免疫组织化学技术(ABC法)
常用免疫组织化学染色方法-步骤
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组织化学技术(ABC法)
免疫组织化学技术（ABCxx）大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100 和0.03%H2O2的0.01%磷酸盐缓冲液（PBS, pH7.4 ），室温30min ;含3%牛血清白蛋白（BSA, Sigma的PBS室温30 min; 豚鼠抗HAP1抗体（1:300）, 4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次10min;生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min; ABC复合物（1:100）, 2小时；PBS漂洗3次，每次10min ;含0.03%DAB 和0.006%H2O2 的Tris 盐酸缓冲液（pH7.6）室温13mi n;常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。
以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。
鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。
A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。
C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。
D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析, *示与对照组比较, P<0.01。
比例尺为100 am。
E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析, ▲示与对照组比较, P<0.01。
免疫荧光双标技术脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS室温30min，含2%正常羊血清(NGS和3%BSA的PBS室温30min,入豚鼠抗HAP1 抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100) 4C 孵育48h; PBS漂洗 3 次，每次10 min，加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG (1:500),室温闭光2h, PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。
荧光显微镜观察，FITC用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。
免疫组织化学技术-1
技术种类： 技术种类：
免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学 免疫胶体金细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术
标本的处理 抗 体的选购 免疫组织化学染色过程
标本的处理
取材 固定 包埋 切片
免疫组织化学染色
（一） 取材
体外培养细胞标本的取材
实验动物、人体材料标本 实验动物、
1. 细胞标本的取材
（1）印片法：将载玻片轻贴在暴露的病 ）印片法： 变区，使脱落细胞粘附于玻片上。 变区，使脱落细胞粘附于玻片上。
缺点
细胞抗原在酶消化过程中暴露某些抗原 决定簇的同时，将破坏部分抗原。 决定簇的同时，将破坏部分抗原。 酶消化对某些膜抗原、激素受体、 酶消化对某些膜抗原、激素受体、癌基 因及部分淋巴细胞抗原，不但没有增强， 因及部分淋巴细胞抗原，不但没有增强， 相反有破坏作用，重者细胞结构受损， 相反有破坏作用，重者细胞结构受损， 增加某些抗原的弥散。 增加某些抗原的弥散。
PLP液 液
赖氨酸-多聚甲醛固定液 （过碘酸-赖氨酸 多聚甲醛固定液） 过碘酸 赖氨酸 多聚甲醛固定液）
适合富含糖类组织的固定，对超微结构 和许多抗原的保存均较好。 配方：分A、B液，需保存在40C冰箱内， 2周内使用。
A液：赖氨酸盐 蒸馏水 赖氨酸盐+蒸馏水 蒸馏水+Na2HPO4+PBS B液：多聚甲醛 蒸馏水 液 多聚甲醛+蒸馏水
石蜡包埋
脱水、 脱水、透明等过程应尽量在温度较低的 环境下进行， 环境下进行，以尽量减少组织抗原的损 失。 组织块可尽量修整得小，使能充分脱水、 组织块可尽量修整得小，使能充分脱水、 透明和浸蜡。 透明和浸蜡。 浸蜡包埋的温度应保持在60 以下 以下。 浸蜡包埋的温度应保持在 0C以下。
快速微波ABC法免疫组织化学技术的研究
快速微波ABC法免疫组织化学技术的研究
马大烈;詹镕洲;黄玲;谢企良
【期刊名称】《第二军医大学学报》
【年(卷),期】1991(12)6
【摘要】随着免疫组织化学方法学的进展,其敏感性和特异性已得到显著提高。
然而,目前常用的方法既费时又增加了非特异背景染色和脱片机会。
近年来,有资料表明,微波辐社在免疫组化技术中的应用不仅克服了上述缺点,而且可获得令人满意的染色效果。
作者将微波与ABC(Avidinbiotin complex)法相结合,应用多种单克隆及多克隆机体对不同类型的良恶性肿瘤进行了免疫组化标记,并与常规ABC法进行比较,以探讨该法的特异性、稳定性和实用价值。
【总页数】3页(P573-575)
【关键词】微波;免疫组织化学;ABC法
【作者】马大烈;詹镕洲;黄玲;谢企良
【作者单位】长海医院病理科;长海医院理疗科
【正文语种】中文
【中图分类】R446.61
【相关文献】
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2.光波-微波-硝酸快速脱钙技术对骨组织免疫组织化学染色的影响 [J], 熊正文;李德炳;冯骥良;黄勇;苏红;胡海霞;李宏伟
3.快速微波ABC法免疫组化技术及其应用 [J], 谷化平;胡海霞
4.双重免疫组织化学技术（ABC法）在鼻咽癌组织中对单个核细胞亚群... [J], 林世珍
5.微波免疫组织化学技术在宫颈癌涂片快速诊断中的应用 [J], 熊正文;谷化平;李春光;田玉旺
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免疫组化SP法与SABC
ABC法：ABC代表的是亲和素－生物素－过氧化物酶复合物。
利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。
但是此法注意内源性生物素活性的消除，以减少非特异性的染色。
SP法：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。
PA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，它能与各种动物的IGG的FC段结合，在免疫组化中可作为桥抗体或标记抗体。
最大的优点是不受种属的特异性限制。
此法还具有染色时间短、灵敏度高、背景染色淡等优点，分子量小，易于穿透组织。
两者本质的区别是：SABC法的“三抗”是SABC 复合物即链酶亲和素－生物素－过氧化物酶复合物；而SP法的“三抗”是过氧化物酶直接与链酶亲和素相连的，没有通过生物素的中介连接。
SABC步骤：切片常规脱蜡、脱水；30％H2O2＋蒸馏水10份混合，室温5－10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗；将切片浸入0.01M枸橼酸盐（PH6.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔10分钟，反复两次进行热修复抗原；滴加5％BSA封闭液，室温20分钟；滴加一抗，37℃1小时30分钟孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温下20分钟，PBS（PH7.2－7.6）洗；滴加试剂SABC，室温下20分钟，PBS洗5分钟×4次；DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中 A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色18分钟；苏木素轻度复染；脱水，透明封片。
显微镜下观察。
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
免疫组织化学的方法有多种，其实都大同小异，不同点只是在于显色基团！SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗2～3次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗2～3次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗2～3次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。
第13章 免疫组织化学技术(二)
再用标记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素
反应-凝集素-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的 特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与 其反应，形成一个“三明治样”的结合物。
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的 一种纯蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有 高度的亲和力，其功能类似亲合素。 利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组 合成酶标链霉亲合素-生物素方法
合物结合
桥联亲合素-生物素技术 Bridged Avidin-Biotin technique， BRAB
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多
价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物 与标记生物素联结起来，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最 终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合 物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即 会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原 理
免疫电子显微镜（Immunoelectron Microscope， IEM） 技术是利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋
白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高
电子密度产物，在电子显微镜下对高电子密度标记的抗原 （抗体）进行亚细胞水平定位的技术。 特点: 定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器 在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点
等）进行切割分离并收集用于
后续研究的技术 。 根据研究的需要可在显微切割前 应用免疫组织化学、原位杂交 等方法对需要切割的组织内成 分进行标记。
免疫组化abc法名词解释
免疫组化abc法名词解释
免疫组化ABC法是一种用于检测蛋白质在组织切片中表达的方法。
这种方法通常用于病理学研究和临床诊断中。
ABC法的全称是Avidin-Biotin Complex法，它利用了生物素和亲和素之间的特异性结合来实现对蛋白质的检测。
在ABC法中，首先需要利用一种特异性的抗体来与待检测的蛋白质结合。
这个抗体通常被称为一抗，它可以识别并结合到特定的蛋白质上。
接下来，将生物素标记的二抗加入样本中，这些二抗能够与一抗结合。
然后，将含有酶的生物素-链霉素复合物（ABC）加入样本中，这个复合物可以结合到二抗上。
最后，加入染色底物，这样就可以通过显色反应来观察蛋白质的表达情况。
ABC法的优点包括灵敏度高、特异性好、操作简便等，因此被广泛应用于免疫组化实验中。
然而，也需要注意到ABC法在操作过程中可能存在的非特异性结合和背景信号的问题，需要进行严格的实验控制和数据分析。
总的来说，免疫组化ABC法是一种重要的实验技术，它通过利
用生物素和亲和素的结合特性，能够有效地检测组织切片中蛋白质的表达情况，对于研究和诊断具有重要意义。
免疫组化 ABC法
免疫组化染色步骤(ABC法)第一天：【准备：试剂、37℃恒温水箱打开】1．切片脱蜡：第一排试剂瓶从左至右（二甲苯→Alcohol），二甲苯内浸泡10min，Alcohol 内浸泡5min。
【二甲苯→二甲苯→100% Alcohol→100% Alcohol→95% Alcohol→90% Alcohol→80% Alcohol→70% Alcohol】2．TBS洗10 min×3，置摇床上。
3．【注意避光】用0.3% H2O2和0.3%Triton 混合液处理切片30min，置于摇床上。
增加切片渗透性。
【注：H2O2原液是30%，先把Triton溶解在TBS中后，再加入H2O2】4．TBS洗10 min×3，置摇床上。
5．抗原修复：塑料染缸中加入250mL 0.05M Citrate buffer（或0.05M Tris-HCl缓冲液）液，然后放入片子，调至“解冻”档，先微波加热5min（温度升至95o C左右），继续加热10min,中间冷却5min，再加热10min，然后室温冷却20min6．TBS洗10 min×3，置摇床上。
【如果掉片严重，5、6和3、4调换一下】7．将切片取出，组织周围的水分用滤纸吸干，用特制的记号笔（冰箱中，可防止液体流出）在组织周围划上圈后放入湿盒中，并在圈内滴入5%羊血清，做到完全覆盖住组织，然后将湿盒放入恒温水箱（37℃）中20 -30 min。
8．将湿盒取出，把切片上的羊血清轻轻倒掉，用滤纸擦干留下的水道，否则再加入的液体将会沿着水道流出。
加入Ι抗，做到完全覆盖住组织，放入湿盒中，置恒温水箱（37℃）1h。
9．从水箱中取出湿盒，放入4℃冰箱中过夜。
第二天：【准备：37℃恒温水箱打开】10. 取出湿盒（室温30 min，恢复到室温），将抗体倒掉，TBS洗10 min×3，置摇床上。
11.滤纸将圆圈周围的水分吸去，加入相应Π抗，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中1h12. 取出湿盒，将Π抗倒掉，TBS 洗10 min×3，置摇床上。
如何用免疫组化ABC法做好脑组织冰冻切片
卫生职业教育
Ｖ １ ８ ２ １ Ｎ ． Ｄ２ ０ ０ ｏ ． ２
关键词 ： 免疫组化 Ａ Ｃ法； Ｂ 脑组织； 冰冻切片 中图分类号 ： ４ ４ １ Ｇ ２． ３ 文献标识 码： Ｂ 文章编号 ：６ １ １４ （０ ０ ０— １８ ０ １７ — ２ ６ ２ １ ）２ ０ — ２ １ Ａ Ｃ法即抗生物素一 Ｂ 生物素一 过氧化酶法 。Ａ Ｃ法是 Ｈ ｕ Ｂ ｓ 等人于 １ ８ 年在 Ｂ Ａ ９１ Ｒ Ｂ法和 Ｌ Ｂ法 的基础上改 良的ｆ Ａ ｌ １ 。其特 点是利用抗生物素分别连接生 物素标 记的第 １抗体和生物素 Ｉ
２ ｉ。 １ ） ０ １ Ｂ 将其漂洗 ３ 每次 ５ ｉ。 １） Ｏ ｎ （３用 ． Ｐ Ｓ ｍ ０Ｍ 次， ｎ （ 用 ｍ ４
Ｄ Ｂ显色 １～ ５ｍｎ 一般不超过 ３ ｉ， Ａ ０ １ ｉ， ０ｍｎ 因为阳性物质在超过
一
定时间后是不可能随时间延长而继续增加的。可在显微镜下
监控整个显色过程 。（５ 用苏木复染 ２ｒｎ左右 ， １） ｉ ａ 使酸碱分化 。 （ ６梯度酒精脱水 ， ２） 二甲苯透明 ， 中性树胶封片。
的非特异反应物和羊血清相结合 ，以降低脑片的染色背景 ， 增
强对比度 ， 甩去多余液体。（ ） ８滴加第 １ 抗体 ５ Ｌ 放置于 ４℃ ０‘ ， ｉ 冰箱 内过夜。（ ）用 ０ １ Ｂ ９ ． Ｐ Ｓ将其漂洗 ３次，每次 ５ｒ ｎ ０ Ｍ ｉ。 ａ
标记 的酶。其第 １ 抗体不为标记物所标记 ，生物素标记 的第 １ Ｉ
生物素上 ，再将生物素一 过氧化酶连接物与过量的抗生物素蛋 白反应而制备的。用 Ａ Ｃ法做其他组织 的冰冻切片容易得 出 Ｂ 结果 ， 但做大 鼠脑组织 的冰冻切 片则 比较困难 ， 因为完整 的大 鼠脑组织切片 面积较大 ， 容易破碎 ， 加上神经系统 中由于抗原
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组织化学SABC法
结果判断标准
一些原则必须掌握： 阳性细胞定位要在5%以上，才能定为阳性。 参考评价： <5% - ， 5%-25% + ， 25%-50% ++， >50% +++ ～++++
P53
雌激素受体β在乳腺癌的表达
免疫组织化学SABC染色法
原理：
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度
亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过
氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后
与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。
用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC复 合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗— ABC。最后用底物显色剂显色。
(3) 3%过氧化氢溶液，10min；
(4) PBS浸洗，×3次； (5) 使用封闭剂：每张切片滴加非免疫动物（羊）血 清(与二抗同源)室温 10min；倾去血清，不洗！ (6) 每张切片滴加小鼠抗人CEA单抗（1:100）， 37℃ ，30min，或4℃过夜； (7) PBS浸洗，3次；
(8) 每张切片滴加第二抗体(1:100)，37℃，
⑴ lgG (anti-Mouse)
⑵ lgG (anti-Rabbit)
Straptived- HRP 复合物（SABC） A液（avidin） ：亲和素 B液（biotin） ：生物素-HRP
显色剂： 浓缩DAB H 2O 2 Buffer
实验步骤:
(1) 结肠癌石蜡切片脱蜡下行酒精入水； (2) PBS浸洗，×3次；
20min； (9) PBS冲洗，×3次； (10)每张切片加100lSABC溶液(1:100)，37℃， 20min； (11)PBS冲洗，×3次； (12)新鲜配制的底物 DAB溶液，3～5min； (13)自来水冲洗，脱水，透明，中性树胶封固。
免疫组织化学技术
免疫细胞化学或称免疫组织化学（Immunochistochemistry）是通过特异的抗原、抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。
此方法可以识别定位各种细胞组织成分，发现蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄生虫、细菌病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等，一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检查并显示出来。
在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位定量测定。
知识点导航一免疫荧光法免疫荧光细胞化学是利用荧光色素标记抗体与组织切片或细胞涂片中的相应抗原反应，形成抗原与标记抗体的复合物，借助紫外光或蓝紫光激发荧光色素；在显微镜下呈现特异性荧光反应，从而定位抗原的技术。
1．免疫荧光染色原理免疫荧光染色是根据抗原抗体反应原理，将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，再与其相对应的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，检测出抗原或抗体，并进行定位及定量。
最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素(fluorescien isothiocyanate，FITC)。
2．染色方法免疫荧光法分为直接法、夹心法、间接法和补体法(1）直接法用荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原结合，检查出相应的抗原成分。
操作方法①冷冻切片、涂片、印片或细胞培养物按要求固定，石蜡切片按常规脱蜡至水。
②用PBS(pH值7.4)充分水洗标本。
③滴加相应的荧光抗体，将标本放入湿盒中，在室温或37℃染色30min，倾去作用液。
④用PBS洗2次，每次5min。
蒸馏水洗1min。
⑤用50％甘油缓冲液封片。
镜检查。
对照染色：可作阴性、阳性、抑制法等对照试验。
2．间接法此法是将荧光素标记到第二抗体上。
先使第一抗体作用于组织切片与抗原反应，用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再与荧光素标记的抗体（第二抗体）作用。
EnVision法和ABC法在免疫组化病理检测中的运用-病理学论文-基础医学论文-医学论文
EnVision法和ABC法在免疫组化病理检测中的运用-病理学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——免疫组织化学技术(免疫组化)是一种在临床病理诊断和生物医学研究中应用非常广泛的技术。
自Coons 等成功应用免疫荧光方法以来，免疫组化经过不断改良，建立了多种简便、灵敏的方法。
现今临床病理中主要应用亲和素－生物素(ABC)法进行诊断，但ABC 法存在着背景深、灵敏度相对较弱等不足。
本研究对EnVision 法和ABC 法进行比较，分析2 种方法各自的优缺点，为临床病理检测提供更合适的方法。
1 资料与方法1．1 资料选取2012 年1 月－2014 年1 月确诊10例肾母细胞瘤的肾组织标本和7 例滤泡性恶性淋巴瘤的淋巴结组织标本。
所有标本均来自于中山大学第一附属医院病理科。
1．2 试剂WT1 抗体( 批号:14012677C) 来自于福州迈新生物技术开发有限公司(中国);CD10 抗体(批号:D06828)、Bcl －6 抗体(批号:1225504C)来自于罗氏公司(美国); ABC 试剂盒(批号:20001418)、EnVisionTMFLEX + Ｒb ( LINKEＲ) 试剂盒( 批号:20008198)和DAB 显色试剂盒(批号:20008206)来自于DAKO 公司(丹麦);其他试剂自配。
1．3 方法所有组织标本均为石蜡标本，每个石蜡标本连续切片，厚度3 m ～5 m，分别制成2 张玻片，将其分成2 组(ABC 组和EnVision 组)分别染色。
ABC 组经脱蜡、水化、修复等常规步骤后，用WT1 抗体(1∶100)、CD10 抗体(1∶200)和Bcl －6(1∶100)抗体孵育1 h 后，直接用HＲP －复合物孵育1 h，然后DAB 显色，苏木精染核，封片。
EnVision 组在一抗孵育之前的步骤与ABC 组相同，在WT1 抗体、CD10 抗体或Bcl －6 抗体孵育后，用EnVisionTMFLEX + Ｒb(LINKE Ｒ) 孵育20 min，再用HＲP －复合物孵育40 min，然后DAB 显色，苏木精染核，封片。
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
免疫组织化学
内室温孵育15～25min，然后吸去孵育液，
不冲洗。（封闭）
5）滴加PBS适当稀释的第一抗体，湿
盒内孵育，或4℃过夜，或室温2～4h。 6）PBS充分冲洗，3次，2min
7）滴加适当稀释的酶标第二抗体， 湿盒内孵育45～60min（室温或37℃）。
8）PBS漂洗，3次，2min。漂洗后，
冰冻切片可用福尔马林固定，固定后再
0.1mol／L Tris－HCl缓冲液（pH8.3）,
用前加入坚牢红TR盐（1mg／ml）。切片
入此液，室温10～15min。取出后用Tris －HCl缓冲液洗净。
10）将切片置流水中终止呈色反应。
11）按需要可进行甲绿或苏木精复染
细胞核。
12）DAB显色标本可经脱水、透明、
树胶封固。其它显色反应用水溶性介质
为抗原制得，其分子量为 HRP的 2～3
倍，比较稳定，内源性 ALP较易清除，
常用于免疫组织化学染色。
2．胶体金标记
其标记就是蛋白质吸附并结合在金颗 粒表面的过程，是由于金颗粒表面带负电 荷和蛋白质表面所带正电荷有静电吸引， 这种吸附取决于pH值，pH值也与胶体金的
聚合状态有关。胶体金标记蛋白（抗体）
所谓抗体标记技术，即利用荧光素或酶或 重金属颗粒使之结合于抗体分子上。
利用双价或多价结合力的物质，如植 物血凝素、生物素－亲和素等，一方面与 标记物（如荧光素、酶等）结合，另一方 面又可与细胞组织内某种物质（如抗体） 结合，这种利用一种物质对组织内某一成 分亲和能力发展起来的技术，即称亲和免 疫组织化学（affinity immunohistochemistry）。
一、抗体的保存
①冷冻干燥；
②添加防腐剂或保护剂；
双重免疫组织化学技术（ABC法）在鼻咽癌组织中对单个核细胞亚群...
双重免疫组织化学技术（ABC法）在鼻咽癌组织中对单个核
细胞亚群...
林世珍
【期刊名称】《海南大学学报：自然科学版》
【年(卷),期】1991(009)001
【摘要】双重免疫组织化学染色技术(简称双重染色)可以借助不同底物获得不同的呈色反应,显示不同的抗原物质。
此技术方法可以研究同一细胞内两种或两种以上的组织抗原成分在同一切片上的分布,对于研究疾病的病因和发病机理具有重要的意义。
本文应用双重 ABC 法在同一鼻咽癌组织中显示两种不同抗原,探讨标记癌巢中单个核细胞的方法学问题,结果颇为满意。
【总页数】3页(P89-91)
【作者】林世珍
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】R739.63
【相关文献】
1.碱基切除修复基因在人鼻咽癌组织和鼻咽非癌组织中的表达及其意义 [J], 刘娜;周昕熙;卢丽霞;洪明晃;曾益新;贾卫华
2.鼻咽癌组织淋巴细胞亚群的分布与分析 [J], 宋阳;王莉芬;石林;杜翠萍
3.21例鼻咽癌组织中单个核细胞亚群分布的观察与分析 [J], 姚志仁;林世珍
4.快速微波ABC法免疫组织化学技术的研究 [J], 马大烈;詹镕洲;黄玲;谢企良
5.锚蛋白B在鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 [J], 代文意
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免疫组化ABC法
HRP
步骤：三步法
优点：敏感性较高
特异性强 应用范围广
缺点：某些脏器存在内源性生物素干扰
Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中 磷脂有非特异反应
免疫组化ABC法
实验步骤
• 一、切片和脱蜡 • 切5-10微米的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后 进行后续反应。步骤如下：
• （1）二甲苯脱蜡
• （2）梯度酒精水化（无水酒精、95%酒精、 90%酒精、85%酒精、80%酒精） • 二、微波修复抗原
• （11）贴片，甘油封片
• 四、观察结果并分析
免疫组化ABC法
实验对照设置
对照染色的目的 ---排除假阴性和假阳性。
免疫组化ABC法
实验步骤
• ⑶一抗室温孵育过夜。抗体用含3%牛 血清白蛋白(BSA，Sigma)和1%NGS的
0.01 mol/L PBS稀释(下同)；
• ⑷0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; • ⑸生物素化二抗室温孵育2h;
免疫组化ABC法
实验步骤
• ⑹0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;
⑺ABC(1:100, Vector) 室温2h; • ⑻0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min; ⑼含0.03%DAB和0.006% H2O2的Tris 盐酸缓冲液(TB, pH7.6)室温10~15 min。
免疫组化ABC法
实验步骤
• （10）0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5min;
免疫组化ABC法
实验步骤
• 三、ABC法
• ⑴含1% Triton X-100和0.03 %H2O2的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)室温15min； • ⑵含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)和1%正常 羊血清(NGS, Vector)的0.01 mol/L PBS室温 30min；
Ge 免疫组织化学染色技术
Mallory三色染色法：染料试剂：苯胺蓝、橘黄G、酸性复红、重铬酸钾、磷钨酸、醋酸免疫组织化学的主要染色方法第一篇概述免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。
只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。
染色注意事项：/detail-68.html一、直接法二、间接法三、未标记抗体法抗体和酶、荧光素结合后，或多或少的降低了抗体与抗原的结合能力。
有酶桥法和PAP法，但前者弊端较多。
PAP法（Peroxidase Antiperoxidase. PAP)PAP复合物（二分子抗体，三分子酶），体积小，稳定，穿透性好特点：较间接法敏感20~100倍，较前几种方法非特异性染色轻。
四、ABC 法（Avidin-Biotin-Complex Method）Avidin——卵白素，有四个亚单位，每个亚单位有138个氨基酸，分子两68kD。
一个卵白素分子能与4个分子的生物素结合，基本上不可逆，比抗原抗体结合力大1000000倍，只有在pH1.5的条件下才能将其分离。
Biotin——生物素，一分子的抗体可结合150个生物素分子，和多种酶结合后，不影响催化活性。
四、LAB法（Labeled Avidin-Biotin）特点：1.敏感性较PAP法提高20~40倍；2.非特异性染色几乎没有；3.可用于IHC，核酸杂交等五、免疫组织化学染色方法的选择原则五个“S”原则1.Specificity 特异性间叶组织，上皮组织恶性肿瘤，多克隆抗角蛋白抗体，特异性广鳞状上皮或腺上皮，单克隆抗角蛋白抗体，特异性高；2.Sensitivity 敏感性敏感性高，特异性下降，假阳性增加；敏感性低，特异性高，假阴性增加；3.Simplicity 简便性选用方法愈简便愈好；4.Safety 安全性5.Save (time and money)第二篇：免疫组织化学主要方法举例步骤取材：主要来源于活检标本、手术切除标本及尸体解剖标本。
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免疫组织化学技术（ABC法）
大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x 100和0.03%H2O2的0.01%磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4 )，室温30min；含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)的PBS，室温30 min；豚鼠抗HAP1 抗体（1:30000），4℃孵育48h；PBS漂洗3 次，每次10min；生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min；ABC 复合物(1:100)，2小时；PBS漂洗3次，每次10min；含0.03%DAB和0.006%H2O2的Tris盐酸缓冲液（pH7.6）室温13min；常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。
以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。
鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。
A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。
C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。
D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析，*示与对照组比较，P<0.01。
比例尺为100μm。
E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析，▲示与对照组比较，P<0.01。
免疫荧光双标技术
脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS，室温30 min，含2%正常羊血清(NGS)和3%BSA的PBS，室温30min，入豚鼠抗HAP1
抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100)，4℃孵育48h；PBS 漂洗3 次，每次10 min，加入Rodamine Red或FITC 标记的驴抗豚鼠或兔IgG（1:500），室温闭光2h，PBS 闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。
荧光显微镜观察，FITC 用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm氩氪激光激发，用570nm滤光片检测。
HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。
A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1，B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R，C示A和B的重叠图像。
箭头示HAP1和NK1R双标细胞。
比例尺为20μm。
细胞进行处理后，弃培养基，用0.01MPBS漂洗3遍。
加入4%多聚甲醛固定30min。
PBS漂洗3遍。
加入3%Triton-x 100的PBS，室温30 min；含2%正常驴血清(NGS)和3%BSA的PBS，室温30 min；分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200，Neuro-Marker公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体（1:1000，sigma公司）或兔抗NSE多克隆抗体（1：100，北京中山生物技术公司）4℃孵育48h；PBS漂洗3次，每次10 min；入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG（1:500，Jackson ImmunoResearch Laboratories），室温闭光3h；PBS 闭光漂洗3次，每次10 min；含10%甘油的PBS封片。
激光共聚焦显微镜（Olympus FV500）观察，EGFP 用488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543 nm氩氪激光激发，用570 nm 滤光片检测。