外切酶3介导的LIC高效克隆系统操作步骤
大连In-Fusion Cloning
建立In-Fusion应体系
3.线性化载体的纯化必须胶回收，低电压运行，确保线性分子和环状分子载体彻底分离。
转化感受态细胞 插入片段确认
反向PCR扩增
1.当找不到合适的酶切位点，可以采用反向PCR的方法。 2.同时这也是一种突变的方法（缺失，插入，点突变）。 3.引物设计时，15 nt悬挂的同源碱基可以来源于插入片段。 4.为了保证载体骨架完整性，推荐使用高保真酶，如CloneAmp HiFi PCR Premix（639298）。
7
Q2：引物合成的纯化方式和修饰要求？ A2：脱盐处理即可，较长引物可以PAGE纯化。 3’-OH，而5’无需磷酸化处理。
Q4：引物 除了15 bp的同源序列和目的基因的特异 性序列，还可以包含其它的序列？
A4：可以，在15 bp同源序列之后引入其它适当序 列，用于酶切位点构建、读码框的完整性和融合标 签。15 bp+其它序列+GSP序列。
规格
10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns
Cloning Enhancer
Nucleo -Spin
Stellar Competent Cells
CloneAMP HiFiPCR Premix
Lyophilized
√ √ √ √ √ √ √ √ √ √
推荐5:1或者10:1；插入片段50-100 bp时，推荐10:1或者 50:1。
A5：50 bp-15 kb，8-15 kb的克隆效率可能会 下降。
Q7：PCR产物如何纯化？
A7：如果PCR产物电泳检测显示单一条带，可以采用Cloning Enhancer（639613）处理； 小于350 bp的PCR产物，建议采用Cloning Enhancer（639613）处理； 如果PCR产物含有非特异性背景，请采用切胶方式分离目的片段回收纯化，推荐NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（740609）。
基因工程技术的基本操作程序
基因工程技术的基本操作程序一、引言基因工程技术是一种通过改变生物体的遗传信息，以达到特定目的的技术。
它在医学、农业、能源等领域具有广泛的应用前景。
本文将介绍基因工程技术的基本操作程序，包括基因克隆、基因定点突变和基因表达调控等方面。
二、基因克隆基因克隆是基因工程技术的核心步骤之一。
其基本操作程序如下：1. 提取目标基因：从所需生物体中提取目标基因，可以通过PCR技术扩增目标基因序列。
2. 制备载体：选择合适的载体，如质粒或病毒，将其制备出来。
质粒是一种圆形的DNA分子，具有自主复制和表达的能力。
3. 消化酶切：用限制性内切酶对目标基因和载体进行酶切。
酶切是将DNA分子切割成特定的碎片，以便后续的连接。
4. 连接：将目标基因和载体的酶切产物进行连接。
连接可通过DNA 连接酶催化反应进行。
5. 转化：将连接好的DNA分子导入到宿主细胞中，使其能够复制和表达。
常用的转化方法有化学法、电穿孔法和冷冻法等。
6. 筛选：通过筛选手段，如抗生素抗性筛选、荧光筛选等，筛选出含有目标基因的克隆。
三、基因定点突变基因定点突变是对目标基因进行有针对性的修改，以实现特定功能的操作。
其基本操作程序如下：1. 设计引物：根据目标基因序列，设计合适的引物，引物通常由20-30个碱基组成。
2. PCR扩增：使用引物对目标基因进行PCR扩增，得到包含目标基因的扩增产物。
3. DNA修饰：利用特定的DNA修饰酶对扩增产物进行修饰，以实现目标基因的定点突变。
4. 酶切与连接：将修饰后的DNA分子进行酶切，并与载体进行连接，形成重组DNA。
5. 转化与筛选：将重组DNA转化入宿主细胞中，通过筛选手段筛选出含有突变基因的克隆。
四、基因表达调控基因表达调控是基因工程技术的另一重要方面，它可以实现对目标基因的表达水平进行调控。
其基本操作程序如下：1. 选择调控元件：根据需要，选择适当的调控元件，如启动子、增强子和抑制子等。
2. DNA克隆：将调控元件与目标基因进行连接，形成重组DNA。
综述：无缝克隆与基因融合(中文版)
无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。
准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。
本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。
基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。
传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。
然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。
这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。
这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。
无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。
这是获得杂交基因的理想情况。
以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。
启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。
转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。
启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。
然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。
基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。
分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。
在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。
在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。
只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆常用工具酶ppt课件
;.
49
RNA聚合酶
催化RNA体外合成反应 依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 不依赖 DNA 的RNA聚合酶
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50
反转录酶(reverse transcriptase)
反转录酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3′ →5′和5′ →3′的 RNA 外切核酸酶活性。AMV和MLV。
DNA末端转移酶 DNA terminal transferase
降解酶 S1 nuclease S1
主要功能 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割
将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成 一个整体 通过向 3‘ 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂 口，即5’→3‘ DNA 聚合酶活性与 3'→5'及5'→3'-外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上
因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
;.
6
核酸水解酶类
核酸内切酶核酸 外切酶
核酸合成酶类
DNA聚合酶RNA聚合 酶DNA连接酶
核酸修饰酶类
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
;.
7
用于核酸操作的常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
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24
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
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25
“星”活性Star activity
“星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端ppH值等，会使一些 核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。
在名称右上角加一个星号(*)表示,•如EcoRⅠ*：AATT ；EcoRⅠ：GAATTC 必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。
3.3_NA_cloning_PCR_ligN2详解
3
2) 反应条件
i. DNA溶液的纯度和浓度(反应浓度) ii. 限制酶的纯度和稳定性 i) 纯度: 尽可能保持厂家推荐的反应条件 ii) 稳定性: 保存和反应 iii. 反应缓冲液: 常用三种核心缓冲液, 即高(H),中(M),低(L)盐缓冲液, 不同温度下的pH值 iv. 反应温度: 大多数为37℃ v. 双酶切和多酶切反应
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2. 连接反应条件
1) 评估连接反应结果的方法 i. 琼脂糖凝胶电泳 ii.大肠杆菌转化
2) 反应条件 i. 温度 ii. ATP浓度 iii. 时间 iv. 连接酶浓度 v. 摩尔比率
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3.DNA连接方法
两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用 则是根据其两者末端的DNA结构.
转化E. coli细胞.
20
3) 基因枪法
基因枪是利用一种仪器直接将DNA注入细胞. DNA首先包被 在金或钨微粒表面, 将这些微粒装入一只塑料筒, 然后连接上基 因枪. “开火”后, 基因枪会将微粒加速螺旋式前进, 直接穿透细 胞壁进入细胞. 该方法特别适用于其他方法转化困难的细胞,如某些植物或 者整个生物个体的转化.
11
载体脱磷酸化
在DNA片段与载体相容性 末端时, 载体分子通常需 要脱去5’-P. 避免载体分 子的自连,从而提高重组频 率. 脱磷酸化由DNA磷酸化酶 处理, 常用的有两种: CIP 和BAP.
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2) 人工接头连接法
人工接头(linker/Adaptor)是一段寡核苷酸,通常包含
有限制酶位点. 用于连接两个不同相容性末端的DNA分子.
24
第四节
PCR 技 术
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一. DNA 体外扩增技术
核酸外切酶III克隆PCR产物的操作流程
核酸外切酶III克隆PCR产物的操作流程
核酸外切酶III克隆PCR产物的操作流程
具体操作步骤如下：
1.制备PCR产物及利用相应的限制
性内切酶线性化载体。
2.按照PCR片段与载体摩尔数为2：
1的比例将两者在冰上混和。
PCR片段浓度应大于50 ng，最
佳浓度在100~150 ng之间，并相
应调整载体浓度。
体系中片段
应调整载体浓度体系中片段
及载体浓度不宜过大。
3.加入水使反应体系达到8 ul。
4.在冰上加入1 ul10×缓冲液。
5.将100个单位的核酸外切酶III用水
稀释10倍，吸取1 ul加入体系。
冰上孵育30秒至3分钟。
66.设置PCR仪程序为70℃20分钟，
42℃10分钟。
待PCR仪加热至
70℃后，立即将反应体系放到
PCR仪上进行反应。
7.反应结束后，吸取2 ul反应液直接
应结束应液直接
用于转化。
ligation independent cloning-分子克隆技术
互补的粘性末端退火形成环状分子，经转化进大
肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突出和
缺口而得到正确重组子(如图)。
3
刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/.2011.30.0013)
双酶切
PCR 双酶切
连接
2
整理课件
ligation-independent cloning
在很多情况下，重组DNA技术的应用都会受到 基因序列中原有的酶切位点的限制，尤其是多基 因片段的重组往往更容易受到限制酶酶切位点序 列的限制，研究者不得不使用一些非常稀有的酶 切位点或者采用其它的DNA重组方法，大大增 加了DNA重组的工作量和难度。因此，开发一 种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显 得十分重要。
➢ 并不存在某一种融合标签可以解决所有蛋白的表达及溶解性问题。 然而，实践证明某些融合标签在促进溶解性方面比别的蛋白更有优 势。有研究表明这些融合标签在促进表达量方面和溶解性的作用是 不同的。
TRX > SUMO ~ NusA > Ub ~ MBP ~ GST.（表达量） SUMO ~ NusA > Ub ~ GST ~ MBP ~ TRX.（溶解性） ➢ 因此，SUMO和NusA是相对比较理想的促进表达量及溶解性的选择。
Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的不依 赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC) 充分满足了上述要求。这种方式不仅克服了常规 依赖连接酶克隆方法的缺点，而且操作简便、方 法快捷及连接效率高，应用日益广泛。
在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种
ExoIII介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建
载体和目的片段间，只要带有足够长的同源 粘性末端（>8bp），经退火，转化E.coil. 即 可获得完整的质粒DNA
如何获得粘性末端
如何获得同源序列
获得粘性末端
ExoIII 全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III)，其 具有3’=>5’的外切酶活性
获得5'粘性末端
获得同源序列
用带同源序列的引or
Gene
引物
Gene
我们最关注的问题是： 采用ExoIII是否能进行高效的克隆？
二、实验过程
ExoIII的验证
条件的优化和系 统的建立
载体重建
用ExoIII进行处理，能够达到高效克隆的目的
700
Amount of clones(cfu)
600 500 400 300 200 100 0 0 20
25, 629
40
60
80
100
120
DNA concentration(ng)
25-50ng 载体和片段
最高效的克隆条件
1. 用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的 反应体系； 2. 4℃ 下反应1h； 3. 保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；
PET 28a 100ng 4ul Gene-A3 100ng 1ul 10ⅹExo Ⅲbuffer 1ul Ddw 4ul +Exo III 20units 室温 5min 转化、涂板 15h 5 个克隆
寻求适合的条件来延长ExoIII处理的时间
条件优化一
Time cause for the Exo III(20units) in 4℃:
核酸外切酶3作用位点
核酸外切酶3作用位点
在底物结合过程中，核酸外切酶3通过其活性位点与DNA形成非共价键。
此时，苏氨酸残基与氧化碱基的C6位以及乙酰基化碱基的C3位之间形成一个氢键。
在修复过程中，核酸外切酶3的活性位点通过剪切修复核糖核酸酶功能，修复DNA链上的氧化和乙酰基化碱基。
首先，活性位点中的酪氨酸残基通过水解氧化碱基上的酮基，在细胞内形成一个开裂的6,7-双羟氧化碱基。
然后，一个天然的DNA糖酸位点发生羟基化反应，生成氧化碱基酮糖酸。
活性位点中的酪氨酸残基接收这个羟基，生成一个氧化醛基，然后与DNA糖酸缺口的羟基反应，最终形成利齿状的DNA。
修复过程的最后一步是DNA链连接过程。
在该过程中，核酸外切酶3的活性位点通过与链连接酶的活性位点结合，使修复的DNA链能够与DNA 脱氧核酸连接。
总结起来，核酸外切酶3的作用位点是其活性位点，该位点主要参与底物结合和修复过程。
其中，通过与DNA氧化碱基和乙酰基化碱基的特定位置发生非共价键和水解反应，形成利齿状DNA链。
最后，通过与链连接酶的活性位点结合，完成修复过程。
GeneCopoeia基因克隆技术
与PCR、qPCR等技术一样，作为分子实验室必备手段，分子克隆技术被广泛用于多样的基因功能研究。
所谓分子克隆指的是在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。
基因克隆技术的发展经历3个阶段，第一阶段为经典的T4 DNA连接酶介导的TA克隆及粘性末端克隆，第二阶段为基于DNA修饰酶的LIC系列克隆，第三阶段为基于DNA重组酶的Gateway克隆及一步法克隆。
一、基于T4 DNA连接酶的克隆本系列克隆使用的酶类为：T4 DNA连接酶。
限制性内切酶：可以对目的片段和载体识别并切割出相同的粘性末端，用于碱基互补配对。
T4 DNA连接酶：可以催化目的片段和载体最后一位碱基上的5’磷酸基团和3’羟基形成磷酸二酯键，以实现将目的片段和载体连接成环状质粒。
根据是否使用限制性内切酶，可分为平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。
二、基于DNA修饰酶的克隆方法本系列克隆使用的酶类为：T4 DNA聚合酶T4 DNA聚合酶具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。
缺乏dNTP时，表现为3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和载体，产生单链的DNA粘性末端；加入某一单独dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，掺入与切割动态平衡，切割终止。
因此，T4 DNA聚合酶为基础的克隆方法的关键是目的基因和载体间需要有一定数量的重叠序列。
三、基于重组酶的克隆方法Gateway克隆法——本系列克隆使用的酶类为：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大肠杆菌IHF因子。
该技术需要四个特异性重组位点（attB、aatP、attL、attR），引导发生两个特异性重组反应（BP反应和LR反应）。
BP反应：将目的基因克隆进入入门质粒。
使用到的酶为Int和IHF。
利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法[发明专利]
![利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/21db88cabcd126fff6050b39.png)
专利名称：利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法
专利类型：发明专利
发明人：刘斌,李宏宇,林辰涛
申请号：CN201110393988.9
申请日：20111201
公开号：CN102443596A
公开日：
20120509
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法，其是向含有线性载体和目的DNA片段的体系中加入具有3’-5’外切酶活性的核酸外切酶，在冰上消化30sec ～3min，使两者产生具有同源序列的5’末端，然后在70～75℃下使酶失活，最后退火使线性载体和目的DNA片段重组形成带有缺刻的环形质粒，并转化到大肠杆菌中修复缺刻并随宿主基因组进行复制。
本发明通过使酶热失活而终止消化反应，操作简单易行，同时也继承了其它LIC系统阳性率高的优势，因此适用于大规模的基因克隆及载体构建。
申请人：中国农业科学院作物科学研究所
地址：100081 北京市海淀区中关村南大街12号
国籍：CN
代理机构：北京路浩知识产权代理有限公司
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酶分子克隆的过程
感谢百度文库让我们在这里与你相见，您的下载就是我们最大的动力。
酶分子克隆的过程酶分子克隆呀，就像是一场神奇的魔法之旅呢。
我们先得找到我们想要克隆的那个酶分子的基因，这就像是在一个巨大的基因宝库里寻找一颗独特的宝石。
这个基因可能来自各种生物，比如说细菌呀，或者植物之类的。
然后呢，我们要把这个基因提取出来。
这可不是个简单的事儿哦，就像从一堆沙子里精准地挑出一颗小小的钻石一样。
我们会用到一些特殊的工具，像限制性内切酶，这个酶就像是一把超级精准的小剪刀，可以在特定的位置把基因从原来的DNA长链上剪下来。
接着，我们需要一个载体，这个载体就像是一辆小货车，可以把我们的基因运到合适的地方。
常见的载体有质粒，质粒就像一个小小的环状的DNA，它能带着我们的基因到处跑。
我们把基因和载体连接起来，这个过程就像是把宝石镶嵌到小货车上一样。
之后就是把这个带着我们目标基因的载体送到宿主细胞里面啦。
宿主细胞就像是一个小房子，让我们的基因在里面安家落户。
像大肠杆菌就是很常用的宿主细胞哦。
这个过程就像是把小货车开进了一个特定的房子里。
一旦进入宿主细胞，这个基因就会开始表达，制造出我们想要的酶分子啦。
就像在房子里开了一个小工厂，开始生产我们的宝贝酶分子呢。
这整个过程呀，需要我们在实验室里小心翼翼地操作各种仪器，像离心机啦，培养箱之类的。
每一个步骤都像是拼图的一块，缺了哪一块都不行呢。
我们要时刻关注着实验的各种条件，温度呀，酸碱度之类的，就像照顾一个娇嫩的小婴儿一样。
如果哪里出了点小差错，可能就得不到我们想要的酶分子啦。
所以呀，酶分子克隆的过程虽然很有趣，但也充满了挑战呢。
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简述体细胞克隆技术的操作流程及其原理
简述体细胞克隆技术的操作流程及其原理下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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ExoIII介导的LIC高效克隆系统的建立及载体重建
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0
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80
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120
DNA concentration(ng)
25-50ng 载体和片段
最高效的克隆条件
1. 用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体的 反应体系；
2. 4℃ 下反应1h； 3. 保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；
载体重建
• pBKS • pcDNA3.1 • pcDNA6 • pBOB-CMV
通用序列：（No-tag）
Kpn I Cla I
EcoR I EcoR V Bgl II BamH I Hpa I
GGT ACC ATC GAT GAA TTC GAT ATC AGA TCT GGA TCC GTT AAC
800
700
60, 675
600
500
400
300
200
100
0
100
200
300
400
500
600
Exo III processing time(min)
4℃,60 minutes
条件优化二
Amount of clones(cfu)
DNA concentration ladder:
700
600
仅需要用同一对引物对目的基因进行PCR即可 同时将其接进不同的载体，并带上不同的tag
用带同源序列的引物对目的基因进行扩增， 即可获 得带同源序列的目的片段和载体。
Vector
Gene
引物
Gene
我们最关注的问题是： 采用ExoIII是否能进行高效的克隆？
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The protocol for LIC by Exonuclease III
1. Design the primers with 15-bp overlap;
2. Digestion the vector by proper restriction enzyme;
For getting high quality vectors, there are some good tips as follows:
1) The restriction sites we choose should be 5’-overhangs or
blunt ends , but it shouldn ’t be 3'-protruding ends ;
2) Digestion by double enzymes;
3) Digestion the vector overnight to make sure complete cleavage as possible;
4. Quantitation the concentration of the vector through running DNA gel and the vector is prepared for LIC;
5. Amplifying the insert by PCR with the overlap primers, gel-purified, and quantitated, the insert is also prepared for LIC;（You can also treat the templates with DpnI, if there are scarcely any background bands and the positive PCR bands are dense and special enough.）
6. Mix the vector and insert in the reaction system as follows:
Vector 25-50ng
Insert 25-50ng
Add ddw to 10ul 10ⅹExo Ⅲ
buffer 1ul
7. Place the tube in the ice bath for 5mins
( Make sure the mixture in the tube is cooled to the temperature of the ice bath, and the following approach should also operate on the ice);
8. Add 1ul ExoIII(20units) to the reaction mixture; pipe the mixture for several times ;
9. Place the tube on the ice bath or 4℃ for 60mins;
10. Add 1ul 0.5M EDTA (pH 8.0) to stop the reaction; pipe the mixture for several times;
11. The mixture is then melted at 60℃ for 5mins;
12. Place on the ice bath for 5mins;
13. Centrifuge to concentrate the mixture;
14. Transform the mixture of DNA into DH5α;
15. Incubate the bacteria on the LB plates with proper antibiosis for 16h;
16. Pick up single clone for miniprepare ,analyze by restriction enzyme and further analyze by DNA sequencing.。