遗传标记的发展和应用

遗传标记的发展和应用1 遗传标记的种类遗传标记是指在遗传分析中区分不同遗传背景的研究对象的可遗传的标记，根据研究水平的不同，可分为形态学标记、同工酶标记和DNA分子标记。

Mendel 在经典的豌豆杂交实验中就使用了花色等可用肉眼识别的形态标记。

虽然在早期的很长一段时间里，科学家们都在利用形态标记进行连锁分析和遗传作图（Sax, 1923），但由于形态标记数目较少,而且易受环境因素的影响，在界定过程中也易受人为因素影响，不是很准确，因此就限制了其应用和发展。

同工酶是指具同一底物专一性的不同分子形态的酶。

同工酶的概念虽然早就被提出，但由于技术限制，直到五十年代淀粉凝胶电泳酶谱技术的发明（Hunter and Market, 1957），同工酶技术才得以在遗传学研究中被广泛利用。

同工酶标记是一种共显性标记，在不同组织、不同发育阶段和不同物种间可能具多态性，稳定而不受环境影响。

但其数目和多态性对于迅猛发展的遗传学研究来说，依然是远远不够的。

随着分子生物学的快速发展，对遗传物质—DNA的认识和体外操作技术水平的不断提高，产生了新的基于DNA水平的分子标记。

这类分子标记的多态性是由于DNA水平上的各种变异如：倒位、易位、缺失、插入和单个碱基突变造成的。

在长期的自然选择过程中，基因组中积累了大量这种可遗传的变异，并且是均匀地分布于全基因组中的。

因此DNA分子标记相对于同工酶标记和形态学标记具有数目丰富、多态性高、稳定不受环境影响等优点。

根据DNA分子标记的工作原理可将其分为两类，一为以限制性酶切和分子杂交技术为基础的RFLP标记（Bastein, 1980）, RFLP标记最早是应用于人类基因组研究中，现已广泛地在动、植物的基因组研究中使用于遗传作图，基因定位等方面（Burr et al., 1988; Apuya et al., 1988; Mccouch et al., 1988; Tanksley et al., 1992）。

而另一类则是以聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR）为基础的标记。

随着PCR 技术的发明和广泛应用，一大批基于此技术的新型分子标记如RAPD（Williams et al., 1990）、AFLP（Zabeau and Vos, 1993）、SSR（Litt and Luty, 1989; Wu, 1993）等也迅速发展起来。

RAPD是一种显性标记，以一段通常为10个碱基左右的随机寡核苷酸作为引物在基因组中进行扩增，由于引物的随机性，因此数量巨大，而且由于其主要是基于PCR技术，因此操作相对简便。

AFLP标记是以两种限制性内切酶去酶切DNA，然后在两端分别加上两个接头，再进行两次选择性扩增，通常一次扩增可以得到相当多的带，在降低了错误扩增的几率后，AFLP是一种十分高效的标记，而且由于两种限制性内切酶可以任意组合，因此从理论上来说AFLP标记的数目几乎是无限的。

AFLP标记可能为显性或共显性。

SSR标记多为共显性标记，它是指在基因组中的一些有少数几个（2、3、4）核苷酸组成的简单重复序列，由于在生物的长期进化过程中这些重复序列所处的染色体位置常常会发生不对等交换，所以各不同的生物品种往往在这些简单重复序列的重复次数上存在很大的多态性，因此可以利用简单重复序列两侧的保守序列来设计引物进行扩增，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来区分其在扩增片段长度上的多态性。

由于不对等交换是可以多次发生的，因此SSR标记的多态性往往非常高，而且这些简单重复序列在基因组中大量存在，也使SSR标记的来源十分丰富。

此外随着序列信息的日渐丰富，又发展了基于单个碱基差异的DNA标记，如SNP标记。

虽然单个SNP标记可提供的信息量要小于RFLP、SSR等标记，但SNP数量丰富，还可以借助DNA芯片技术进行自动化检测，因此有广阔的应用前景。

2 数量遗传学的发展性状（Character）是指我们在遗传学研究中所调查的生物个体所表现出的形态及生理特征。

在早期的遗传学分析中调查的都是一些质量性状，这些质量性状在分离后代中的表现为不连续变异并符合孟德尔经典遗传规律，基本不受或很少受环境影响，可以很容易地根据质量性状的表现将分离群体进行分组，从而进一步进行遗传分析。

这些质量性状多为一个或少数几个基因控制，在研究上相对简单。

然而，在自然界中生物所表现出的性状大多为数量性状，尤其在农业研究中，人们所研究的大多数农艺性状都是数量性状。

这些数量性状很难直接用经典遗传学的理论来解释，它们在分离群体中表现为连续的变异，这是因为数量性状是由多个基因同时控制，这多个基因在群体中各自独立或相对独立地发生分离，虽然每一个基因的分离依然如质量性状的主基因一样符合经典遗传学规律，但各基因的共同作用却使性状的表现呈连续分布。

此外数量性状也往往更易受环境影响，这也使数量性状的研究更加复杂。

由于这种复杂性使得对数量性状的分析不能再依靠经典遗传学的分析方法，而必须引入统计分析的方法才可以进行，这就是数量遗传学的分析方法。

数量遗传学是指以生物群体为对象，研究个体间属于程度上或数量上而不是属于种类上或质量上差异的遗传现象的科学（高之仁，1986）。

Mendel于1865年在布隆（Brunn）自然历史学会宣读的论文中提出了遗传因子的传递规律，奠定了经典遗传学的基础。

而同时代的另一位遗传学家F.Galton则以数量性状为观察对象来试图建立遗传学，在这个过程中他创造了回归与相关等分析数量性状的工具，并在此基础上逐渐形成了生物统计学派。

事实上Mendel学派提供了数量性状分析所要依据的基本原理而Galton的生物统计学派则阐明了解释连续变异所必需的工具和方法，但两者都无法单独的解释数量性状的遗传。

在这两个学派争论并融合的过程中，又诞生了两个著名的学说，一为Johannsen于1909年提出的著名的纯系学说，他通过对菜豆的种子重量性状的研究发现在纯系内的选择是无效的，即在纯系内个体间的差异是由环境因素造成的。

所以他提出数量性状同时受遗传因素和非遗传因素影响，这也就阐述清楚了表现型和基因型的关系：表型的连续变异是由于基因型的不连续变异被环境作用修饰后所形成的。

另一个则是1908年Nilsson-Ehle与1910年Emerson和East分别提出的多基因假说，他们认为可以用一些个别作用较小的遗传因子来接受数量性状的连续变异，每单个遗传因子是按Mendel遗传规律的方式传递，而各遗传因子的效应累加就造成了表型的各种中间类型，变异就是数量的。

连续的。

这个假说发展了Mendel的经典遗传学理论，认为数量性状依然受其控制，只是遗传因子的数量变多了，单个因子的效应变小了而已。

这两个学说揭示了数量性状遗传的两个基本特征：多基因控制和易受环境影响。

其后，1918年著名学者Fisher在他的一篇重要文献“根据孟德尔遗传假设的亲属间相关的研究”中就首次利用多基因假设分析样本，对连续变异的数量性状进行了数学分析，将数量变异分解成了各个分量,开创了数量性状遗传研究的思想方法（高之仁，1986）。

随着分子标记技术的发展，尤其是高密度分子标记遗传连锁图的构建，使得数量性状的研究有了更有力的工具。

传统方法是利用多基因假说将控制某一数量性状的各微效基因作为一个整体来研究其加性、显性或上位性效应，而无法分解各微效基因，从而以经典遗传理论来分别加以研究。

而在有覆盖全基因组的分子标记的基础上，就可以利用统计分析的方法，对分离群体中的数量性状进行研究，可以将各个微效基因即数量性状的QTL（quantitative trait locus）分别定位到具体的染色体区段上，并对各基因进行单独研究如分析单个基因的加性、显性或基因间上位性效应等。

3 利用分子标记进行遗传作图和数量性状的定位分子标记技术的发展使得数量性状的研究更准确有效，因为基于分子标记技术的高密度的遗传连锁图的构建提供了覆盖全基因组的分子标记，借助这些标记可以将数量性状位点（QTL）定位到某个标记所在的染色体区段。

（1）作图群体作图群体是指用来构建遗传图谱的一个分离群体，在全基因组各位点间随机发生分离的群体是遗传作图的最基本的一个条件。

根据作图群体是否具有稳定遗传性可以将其分为两类：临时性分离群体和永久性分离群体。

临时性分离群体中各个体基因型中都有很多杂合位点，这类群体一旦自交后基因型就发生了变化，所以无法稳定遗传下去，包括F2群体（McCouch et al., 1988; Kurata et al., 1994; Beaumont et al., 1996），由F2群体衍生的F3家系（Yu et al., 1997）、回交群体（Causse et al., 1994; Xiao et al., 1995）和三交群体（Liu et al., 1997; Wang et al., 1998）等。

这类群体，尤其是F2群体很容易获得，而且可以为遗传分析提供最为丰富的信息，如加性效应和显性效应等。

永久性分离群体中个体间存在差异，但个体本身的基因型是纯合的，后代不会发生分离。

这类群体常见的有重组自交系（recombinant inbred lines, RILs）和双单倍体群体（doubled haploid lines, DHs）。

利用这些群体进行遗传分析也有不少报道（Burr et al., 1988; Xing et al., 2002; Lu et al., 1996; Yan et al., 1998; Jiang et al., 2004）。

RILs是通过多代自交产生的，因此后代不再分离，可以不断地提供遗传背景一致的种子。

而且由于在多代自交中重组事件多次发生，使得遗传图距的估算是相对准确的。

但构建重组自交系需要较长时间，而且无法估计显性效应。

DH群体是通过花粉培养染色体加倍得到的，后代也不分离。

但DH群体由于受培养条件限制，有些基因型难以获得。

还有一类特殊的群体为近等基因系（near isogenic lines, NILs），一般是对初步定位的QTL 利用其邻近的分子标记在不断的回交中进行辅助选择，建立一个遗传背景基本纯合一致，只在目标区段发生分离的群体。

利用NILs就可以用较少的分子标记更精细地定位QTL（Doebley et al., 1995; Tanksley et al., 1996）。

（2 ）遗传图谱的构建利用分子标记研究数量性状研究的一个关键步骤就是遗传连锁图谱的构建。

遗传作图是建立在染色体的重组与交换理论的基础之上的，即根据不同标记（位点）间的重组交换率r 来转化为标记间的遗传距离。

一般常用的作图软件为Mapmaker/EXP3.0。

最早关于遗传图谱的工作开始于上世纪80年代，Botstein（1980）首先提出利用RFLP 标记构建连锁图，Donis-Keller（1987）则首次报道了人类的遗传连锁图。