盐度胁迫对黄鳍鲷抗氧化酶和ATP酶影响的研究技术总结

1.2 实验方法
设4个实验组，其中以自然海水组（盐度20)为对照组，再设 盐度分别为15、10、5和淡水的4个处理组，每组3个平行， 每平行放养30尾鱼，起始为自然海水养殖。根据预实验结果， 盐度15由自然海水直接过渡并计时。盐度10、5和淡水过渡 过程为：采用逐级降低盐度的方法，设置每48h降低一级 （盐度由20→10→5→淡水共4级），按淡水、5、10的顺序， 每组间隔48h，按48 h盐度下降一级的速度分别将盐度降至 淡水、5和10，当达到各组相对应的盐度时开始计时，当各 组分别实验至24、48、72、96和120h 时，各组随机抽取6尾 幼鱼用于生化测定。因淡水组在实验开始计时的24h内有死 亡，所以增设在盐度5中停留120h后过渡到淡水的实验组。
• 黄鳍鲷(Sparus latus )属鲷科（Sparidae），鲷属 (Sparus)，广泛分布于红海、阿拉伯海、印度洋、西
太平洋沿岸，我国东南沿海均有分布。黄鳍鲷生活于 近岸海域及河口湾，杂食性，是一种重要的经济鱼类。 国内外学者在黄鳍鲷的消化酶、配合饲料以及病害等 方面进行了大量的研究。但盐度变化对黄鳍鲷幼鱼鳃 和肾脏ATP酶及肝脏抗氧化酶活力影响的研究未见报道。 为了分析黄鳍鲷对盐度变化的适应能力，探讨盐度变 化对黄鳍鲷胁迫的程度，同时也为黄鳍鲷的淡化及半 咸水养殖提供一些基础资料，本项目开展了不同盐度 对黄鳍鲷幼鱼的存活率、鳃和肾脏Na+/K+、 Ca2+/Mg2+-ATP酶及肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧 化氢酶(CAT)活力影响的研究。
1 材料与方法 1.1实验材料
黄鳍鲷幼鱼购自福建诏安沿海，在实验环境中采用自然海 水(盐度20)养殖28d后，随机挑选健康、体表无受伤、个 体大小均匀的幼鱼用于实验研究，用于鳃ATP酶和肝脏抗 氧化酶活力实验的幼鱼全长36±3mm，体重0.59±0.15g， 用于肾脏ATP酶实验的幼鱼全长113±10mm，体重 36.70±3.25g。采用140 L红色塑料桶作为实验容器。实 验用水为砂滤天然海水与曝气自来水按比例配制的不同盐 度的海水。连续充气，每天换等盐度海水一次，水温 18±1℃。实验期间，分别于8:00和17:00投喂饲料，取样 前22h停止投喂。各组实验开始前进行生化测定，在测定 的指标没有显著差异时开始实验。
2.2 盐度对黄鳍鲷幼鱼鳃的Na+/K+-ATP酶活力的影响
实验开始前各组幼鱼鳃的Na+/K+-ATP酶活力经检验没有显著差异(P>0.05)，
由图1可见，随实验时间的不断延长，各实验组鳃Na+/K+-ATP酶活力变化趋势为：
盐度15和10组没有显著变化，与对照组没有显著差异(P>0.05)；盐度5组先升后
2
1
0 0h
降到对照组水平，在24h显著高于对照组(P<0.05)；淡水组升高后一直处在较高
的水平，72和96h显著高于对照组(P<0.05)，120h淡水组升高后下降，48和72h显
著高于对照组(P<0.05)。
10
*
对照组 15 10 5 淡水 120h淡水
9
**
*
8
*
Na+/K+-ATP酶浓度
7
6
5
4
淡
3
1.3 酶活力测定
用MS222 (200 mg/ L) 将黄鳍鲷幼鱼麻醉后，将实验鱼置于 冰盘上解剖，取出鳃、肝脏和肾脏后，用预冷0.9 % 生理盐 水快速冲洗，并用吸水纸小心吸干。测定前先在冰盘内将样 品剪碎，各组样品分别加入9倍体积(W/V)预冷生理盐水，在 玻璃匀浆器中匀浆，于Biofuge Stratos冷冻离心机4℃、 2500r·min-1离心10min。根据需要，将上清液稀释后作酶活 力及总蛋白测定。
2 结果与分析
2.1盐度对黄鳍鲷幼鱼存活的影响
盐度15、10和5组在120 h的实验过程中均未出现反 常现象，摄食正常，没有死亡。淡水组实验开始后的 第一天能摄食，但摄食量明显下降，后不摄食，在96h 内死亡率为34%；120h淡水组在96h内没有死亡。濒死 的鱼体色发白、狂燥不安、急速的上下游动、最后沉 底侧卧死亡。
1.4 数据分析与统计方法
生化测定所得数据采用SPSS13.0统计软件包 中的一元方差分析(One-way analysis of variance)和Duncan法进行多重比较，分析 各实验组与对照组之间及同一组不同时间相
邻两组间的差异，P<0.05为差异显著，所有
的数据均以平均值±标准误差(Mean ±S.D) 来表示。
“盐度胁迫对黄鳍鲷抗氧化酶 和ATP酶影响的研究” 项目技术总结
2013年8月5日
ATP酶是一类分布广泛的膜结合蛋白酶，其中Na+/K+ATP酶在Na+/K+泵中发挥重要作用，参与细胞内外Na+与 K+的主动跨膜转运，维持细胞内高K+、细胞外高Na+的 离子浓度梯度；而Ca2 +/Mg2 +-ATP酶是将细胞内Ca2+ 泵出细胞外，维持细胞内低Ca2+水平。在养殖水体盐度 发生变化的过程中，鳃和肾脏的ATP酶维持细胞内外渗 透压平衡，可以作为离子转运能力的生物学指标。鱼类 体内的的抗氧化系统是生物体抵御环境胁迫的第一道屏 障，盐度胁迫鱼类的抗氧化酶活力。目前己有研究表明， 盐度胁迫能引起鱼类鳃和肾脏的ATP酶和肝脏抗氧化酶 活力变化。盐度胁迫对鳃和肾脏ATP酶和肝脏抗氧化酶 活力的影响可作为盐度对鱼体健康影响程度的指标。
酶活力采用南京建成试剂盒检测，相应操作参照说明书进行。 Na+/K+、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力采用比色法，活力单位定义为 每小时在含有1毫克蛋白的组织中ATP酶参与分解ATP产生 1μmol无机磷的量为1个酶活力单位，即微摩尔分子磷/毫克 蛋白·小时[μmol Pi/(mg prot·h)]，SOD活力按黄嘌呤氧化酶 法，活力单位定义为每毫克组织蛋白在1ml反应液中S(U)，CAT活力采 用比色法，活力单位定义为每分钟分解1μmol 的过氧化氢即 为1个酶活力单位(U) (南京建成试剂盒)。