中药注射剂指纹图谱实验研究技术指南

说明：本实验研究规程指南为在原技术要求的基础上规范中药注射剂色谱指纹图谱试验研究而制订。

本指南未能概括的内容，通过实践可自行补充调整，但申报资料或复核资料中须有相应的说明和申述。

指南中的"色谱指纹图谱"指采用柱色谱及薄层色谱等各种色谱技术实验研究的指纹图谱。

光谱指纹图谱将另行规定。

一、供试品收集供试品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，由于不可能对一个药材的所有样本进行试验，而且生长环境条件对药材代谢产物有影响，所以要收集有代表性的供试品。

收集不少于10批供试品的含义是指样本的数和量要有足够的代表性。

(一) 原料药材：在药材的化学成分与中医临床疗效的之间的关联尚未能阐明的现阶段，基本上是在承认其传统的功能主治及临床验证的基础上进行指纹图谱的实验研究。

原料药材的指纹图谱主要是反映其自然状态的内在质量情况，研究其指纹图谱是以此作为选择原药材投料或混批提取的依据，同时作为研究注射剂成品指纹图谱相关性的基础。

由于自然条件的变化，药材个体之间指纹图谱的差异是正常的，在品种鉴定无误的基础上，力争药材有较为固定和稳定的来源，个体之间的指纹图谱主要特征大致相似即可，使成品指纹图谱特征的稳定有起码的保证。

药材的"批" 不是工业生产的"批"，是指相互独立的供试品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的供试品分成若干份供试品，以保证试验结果的代表性。

由于收集药材供试品受主观和客观的条件限制，供试验的供试品严格讲均没有统计学的意义，所以供试品数越多越好，10批是最低的要求。

供试品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：▪药材名称▪供试品来源（真实记录供试品来自何处：传统产地收集或是资源丰富的产地收集，或者来自GAP基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买，等，以便于生产原料的采购选择和测试数据的可追溯）。

▪收集时间（购买时间）及收集人▪货源情况调查（货源是否充足和稳定）▪基原鉴定及鉴定人：产地或GAP基地收集的药材结合植物形态鉴定品种。

如缺原植物，由熟练的专业人员凭性状或显微特征鉴别。

如近缘品种、难以区分的野生品种（如白花蛇舌草、蒲公英），应在指纹图谱研究中仔细比较，如获得的指纹图谱相似度很高，也可应用，但须明确记录。

并在今后实施GAP时确定一个品种，如指纹图谱相似度很低，则须确定品种，改为栽培品使用。

商品混乱的品种（如陈皮）产区的选择应缩小范围，并结合资源选用药典收载品种中的一种。

复方制剂中的君药及处方量大的药材必需重点注意品种的鉴定，以避免今后执行指纹图谱过程中出现难以预料的困难。

▪质量评估：为了便于对色谱的正确分析，减少试验结果的判断误差，首先药材需符合药典或部颁标准规定，并详细记录。

所有药材均须编号，必要时附药材外形照片。

▪供试品的留样、贮藏和标签：由于指纹图谱研究周期较长，供试品必须在干燥、低温、避光处贮藏，标签必须有编号，收集供试品的编号应与贮藏样品、试验样品的编号一致。

留样数量应不少于试验实际用量的3倍。

以保证试验结果有异议时的可追溯。

▪如以中药饮片或炮制品为起始原料，应采用符合中国药典或饮片炮制规范的供试品。

申报资料可将关键内容扼要填写于表一中：表一（推荐）附一：药材外形照片。

附二：药材的色谱图（试验完毕后）。

(二) 半成品(提取物)：药材所含成分的个体差异是难以避免的，指纹图谱研究用的半成品应来自生产车间通过药材混批调整及规范的生产工艺生产的实际样品。

关键技术及相应参数填写于表二，并附试验完毕后指纹图谱。

表二（推荐）半成品（提取物）名称混批前批号日期提取方法（关键技术）混批后批号混批比例原始记录保存处数量：容器：贮藏地点及条件：供试品留样附：混批前后的指纹图谱。

(三) 成品(注射剂)：产品批号、生产单位、成品批号与半成品（提取物）批号的相关性均须有明确的记录，以保证试验数据的可追溯。

成品的“对照用指纹图谱”是建立在标准化提取物或10批以上产品指纹图谱的基础上。

各批供试样品须有留样。

主要内容填写于表三，并附试验完毕后的指纹图谱。

表三（推荐）供试品批号生产单位供试品数量供试品留数量：容器：贮藏地点及条件：样指纹图谱研究用的原药材、半成品及注射剂成品均应有10批以上的样品供实验，以保证指纹图谱的可重复性。

二、供试品溶液的制备(一) 药材供试品溶液的制备▪取样：供试品取样应注意代表性，以保持实验室取样与实际生产应用药材一致，例如地上部分的药材，取样约0.5～1Kg，分别称量茎、叶、花、果的大致比例并做记录。

例如果实类药材，生产时去除种子的，供试品也应除去种子，并做记录。

如果药材表观质量不均匀（如大小不一、肥瘦不等、粗细不匀等），应注意供试品的取样有代表性，其后的试验中，必要时应做比较试验，以考察所含成分有无显著差异，供生产参考。

▪称样：应按照常规要求，将选取的供试品适当粉碎后混合均匀，再从中称取试验所需的数量，一般称取供试品与选取样品的比例为1：10，即如称取1g供试品，应在混合均匀的10g 选取的样品中称取。

因为指纹图谱需要提供量化的信息，称取供试品的精度一般要求取3位有效数字。

▪制备：药材指纹图谱的主要目的，一是考察药材本身的质量情况，二是以药材的指纹图谱为参比，提取物及制剂的指纹图谱与之比较，以考察制剂与原药材的相关性。

药材供试品溶液的制备，可选用适宜的溶剂和提取方法，定量操作进行，尽量使药材中的成分较多地在色谱图中反映出来，并达到较好的分离。

最终制备的供试品溶液还应能适应色谱试验的需要，如液相色谱的供试品溶液宜用色谱流动相或色谱洗脱强度较弱的溶剂；薄层色谱用的供试品溶液可采用液液萃取或固液萃取，选用适宜的溶剂制备供试品溶液。

气相色谱的供试品可采用水蒸气蒸馏法、顶空进样法或固相微萃取法，供试品如需使用溶剂，应用低极性低沸点的溶剂。

▪定容：供试品溶液最终应用适宜的溶剂溶于标定容量的容器中，制成标示浓度的供试品溶液（g/mL或mg/mL）。

▪放置：一般要求供试品溶液尽量新鲜配制，如连续试验需要，供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下短期放置，一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。

▪标签：须注明编号或批号，应与取样的药材编号一致，或有明确的关联，以保证数据的可追溯。

主要操作过程及数据应详细记录。

(二)半成品(提取物)供试品溶液的制备：称取不同批次的半成品（提取物），参照"供试品溶液"的制备方法中相应的内容制备成一定量的溶液，备用。

标签须注明编号或批号，应与取样的药材编号一致，或有明确的关联，以保证数据的可追溯。

主要操作过程及数据应详细记录。

(三)成品(注射剂)供试品溶液制备：液体注射剂一般可直接或稀释后作为供试品溶液，必要时也可用适宜的溶剂提取并制备成一定量的溶液。

固体形式的注射剂（冻干粉针）须注意注射剂成品的附加剂有无对色谱试验干扰。

如有干扰，须研究采取适宜的样品预处理方法以排除干扰（如含有氯化钠则液相色谱不可使用蒸发光散射检测器；如糖分太多，可能影响薄层色谱的清晰度和分离度；冻干粉针的骨架剂用量较大时也可能影响色谱的质量等）。

此外，单方注射剂药材或复方注射剂中不同药材成分类别如果相差较大，色谱条件要求不同，需要进行样品的预处理时，应分别进行试验，便于制备2张以上的指纹图谱。

主要步骤及数据应详细记录。

三、参照物(一)参照物的选择：指纹图谱的参照物质一般选取容易获取的一个以上注射剂中的主要活性成分或指标成分，主要用于考察指纹图谱的稳定程度和重现性，并有助于色谱的辨认。

在与临床药效未能取得确切关联的情形下，参照物（复方注射剂应首选君药的活性成分或指标成分）起着辨认和评价色谱指纹图谱特征的指引作用，它并不等同于含量测定的对照品。

指纹图谱一般色谱比较复杂，内标物不易选择，也不易插入，指纹图谱不是含量测定，故内标物的作用也不等同于含量测定的内标物，因此应慎重考虑选用内标物质的必要性和可能性。

参照物应说明名称、来源和纯度。

如无参照物也可选指纹图谱中的稳定的色谱峰做为参照峰，说明其色谱行为和有关数据，并应尽可能阐明其化学结构及化学名称。

如情况需要，又有可能也可考虑选择适当的内标物插入色谱中。

(二)参照物溶液的制备：精密称取，用适宜的溶剂制成标示浓度的溶液，备用。

四、实验常用的色谱技术有薄层色谱、液相色谱、气相色谱及其他色谱技术。

须注意各种色谱技术的特点和不足，结合实际选用。

不论何种色谱技术，选用的原则是必需具有良好的专属性、重现性和可行性。

专属性：建立的指纹图谱必须能够表达该品种的特征，即唯一性。

重现性：同一品种同一样品指纹图谱中构成指纹的各特征峰（斑点）作为整体（峰位、峰数、峰的丰度、各峰的大致比例）在不同实验室和不同操作者之间得到的色谱整体特征应有较高的相似度，以表明方法的可行性。

同一品种不同样品之间的相似度不属于此范围。

可行性：色谱方法和试验条件应易于推广和便于执行，即一旦由药品监督管理部门批准成为质量标准的内容后，生产企业、中等水平的分析实验室和省级以上的法定检验机构均可执行该标准。

(一) 实验室：承担色谱指纹图谱的实验室应符合以下6个条件：1、实验室具备承担指纹图谱的总体能力；2、实验室设备通过检验证明符合指纹图谱试验研究的需要；3、技术人员具备从事指纹图谱试验研究的能力；4、对实验室的技术能力评价应有定期的内部的独立检查；5、试验数据有可追溯，与其他实验室有可比性；6、实验室应有质量保证体系，以确保各种措施实施的透明和一致。

(二)仪器：所用的仪器性能应能满足指纹图谱试验的需要，并须经校验；如果同一台仪器有两个以上的项目共用，须有特别措施保证仪器的清洗和维护，仪器使用要有明确记录。

液相色谱柱记录商品名称、生产厂家及相关参数（固定相、柱长度、内径、填料粒度等）；一般需用三根以上不同生产厂家的柱子进行比较，经比较试验后应固定色谱柱来源与规格。

色谱系统的适应性试验可用该品种指纹图谱所用的参照物，参照常法进行，如柱效明显降低，在排除其它因素后，说明该色谱柱不能继续使用。

另一方法是用制作"对照用指纹图谱"的提取物留样样品定期重复试验，将前后得到的指纹图谱垂直叠加，直观比较，各指纹特征峰是否能重合及整个色谱的形状是否有变异，如有变异致使指纹特征已难以辨认，或选择难分离的一对或一组峰，其分离度如明显降低，在排除其他可能的影响因素后，可认作该色谱柱不能使用。

仪器使用人、使用时间及周期应有记录。

薄层色谱系离线操作，薄层板为一次性器材，不存在重复使用问题，但不同厂家的商品预制薄层板质量可能不一致，手工自制的薄层板只能供筛选试验条件使用，用确定的条件制作指纹图谱（图像）时必须用有质量保证的商品预制薄层板（如Silicagel 60，Merck等）。