土壤微生物的分离和纯化
实验八、土壤微生物的分离和纯化(精)
（2）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。
（二）稀释涂布平板法 • 3.涂布
将每种培养基的一个平板底面分别用记号笔写上10-3、
10-4、和10-5 ，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、和10-5 三 管土壤稀释液中各吸取0.1ml对号放入平板中央，用无菌玻 璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
（三）培养
做好标记后，高氏I号和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养 3~5d，牛肉膏蛋白胨平板置37 ℃温室中培养2~3d。
（四） 挑菌落
菌苔长出后，检查特征是否一致，用显微镜检查是否为单一微生物， 若发现有杂菌，需要进一步分离、纯化，挑取单个菌落接种到斜面上。
（五） 计数
•
•
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是 极其丰富的，因此土壤是发掘微生物资源的重要基地。
三、器材
• 1.培养基
牛肉膏蛋白胨培养基 马丁氏培养基 高氏1号培养基
• 2.溶液或试剂
盛4.5ml无菌水的试管 盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶
• 3.仪器和用具
无菌玻璃涂棒 无菌吸管 无菌培养皿 土样
• 2.倒平板
将三种培养基加热溶化，待冷至55~60℃时，马丁 氏培养基中加入链霉素溶液（终浓度为30μg/ml），混均 匀后分别倒平板，每种培养基倒4皿。
（一）平板划线法
• 3.划线
左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-2的土壤悬液一环在平 板上划线。
两种划线方法：
（1）不连续划线:先在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4次， 再转动培养皿，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线 部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三 次划线和通过第三次部.制备土壤稀释液
土壤中的微生物分离纯化和菌相分析
（二）平板划线分离法
1.倒平板 2.划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环， 挑取待测菌悬液一环在平板上划线。划线的方法很 多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将 样品在平板上进行稀释，培养后能形成单个菌落。
划线方法 方法一：用接种环按无菌操作挑取土壤悬液一环， 先在平板培养基的一边作第一次平行线3-4次，再 转动平板约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷 却后挑取悬液穿过第一次划线部分进行第二次划线， 再用同样的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线 或再穿过第三次划线部分进行第四次划线。划线完毕 后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 方法二：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连 续划线，完毕后，盖上培养皿盖，温室培 养。
二、实验原理
三、实验器材
1.土壤 2.培养基： 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（营养琼脂）（50μg/mL制霉菌素 乙醇溶液） 高氏一号琼脂培养基（10滴100g/L石碳酸和50μg/mL制霉菌 素乙醇溶液） 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（1000mL培养基中加入2mL氯霉素） 3.溶液与试剂： 9mL或4.5mL无菌水的试管，90mL无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。 但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各 种因素的影响。
二、实验步骤（方法一）
1.编号：取无菌培养皿6套，分别用记号笔表明 10-4、10-5、10-6各2套。另取6支4.5mL无菌水 的试管，依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。 2.稀释：用1mL无菌吸管准确吸取0.5mL已充分混匀 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液，加入标 有10-1字样的试管中，此为10倍稀释，吸管中多余的菌 液放回试管中。将10-1试管在手掌中或置于振荡器上振 荡，使菌液充分混匀。另取一支1mL吸管插入10-1试管 菌液中吸取1mL，精确的放0.5mL菌液于10-2试管中， 此为100倍稀释……其余依次类推直至所需倍 数。
实验二：土壤中微生物分离与纯化
了解并掌握微生物的生理生化特征， 如营养需求、代谢途径、酶活性等。
微生物纯化
在分离的基础上，进一步通过反复划 线培养或平板克隆培养，获得纯培养 的微生物。
熟悉微生物分离与纯化的实验操作流程
土壤样本采集
选择具有代表性的土壤样本， 采集时要避免污染，并记录采
样点的环境信息。
微生物的纯化
对分离得到的菌落进行纯化， 通过反复划线或平板克隆培养 ，获得纯培养的微生物。
菌落形态观察
观察纯化后的菌落形态，记录菌落 特征。
微生物的保存与鉴定
菌种保存
将纯化的菌株进行冷冻干燥或甘油保 藏，以备后续实验使用。
微生物鉴定
采用形态学、生理生化实验或分子生 物学方法对分离得到的菌株进行鉴定 。
04
CATALOGUE
实验结果与分析
微生物分离与纯化的结果观察
微生物分离
通过划线分离法，成功将土壤中的微生物分离到了培养基上，观察到菌落形态 各养基
根据目标微生物的特性， 选择适合的培养基。
培养
将土壤稀释液涂布或滴加 在培养基上，放入恒温培 养箱中培养。
观察与记录
观察微生物的生长情况， 记录菌落形态、颜色、大 小等特征。
微生物的纯化
挑选单菌落
从培养基上挑选单菌落，采用划 线法或稀释涂布法进行纯化。
纯化培养
将纯化的菌株进行多次划线培养或 传代培养，确保获得纯培养物。
01
微生物纯化的原理是利用微生物的单一特性进行分离，使同一种微生物在培养 基上形成单一菌落。
02
常用的微生物纯化方法包括划线分离法、稀释涂布平板法、显微操作法等。这 些方法可以根据不同微生物的特性选择使用，以获得纯培养。
03
土壤微生物的分离和纯化实验
实验八土壤微生物的分离和纯化一、目的1．了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。
2．掌握几种常用的分离的基本操作技术。
二、原理在自然界中，土壤是微生物生活中的最适宜的环境，土壤中存在大量的微生物，但土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，因此，为了研究某一微生物的特性，或者要大量地培养和利用某种微生物，必须把它们从这些混杂的微生物群中分离出来。
从而获得某一菌株的纯培养。
这种获得纯培养的方法称之为微生物的分离和纯化三、器材1．牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。
2．盛有100毫升无菌水的三角瓶，9毫升无菌水的试管，无菌吸管，无菌玻璃涂抹棒，10％的酚液，25％的乳酸，土样，接种环，标签。
四、方法(一)涂抹平板分离法1．制备土壤稀释液称取土样10克，放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中，振摇15—20分钟，使土与水充分混合，将菌分散，静止片刻，用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中，吹吸三次，并振摇使之充分混匀，然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。
2．倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，马铃薯蔗糖培养基溶化。
待冷至50—60℃时，在高氏l号培养基中加入10％酚2滴，在马铃薯蔗糖培养基中加入25％乳酸2滴，然后分别倒平板，每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管，左手拨出棉花塞，试管口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿在火焰附近打开少许，迅速注入培养基，加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布，平放在桌面上，待凝后即成平板。
(见图18)。
3．涂抹将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度，然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液，每一平板注入0.2毫升，再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，静止5分钟。
实验八、土壤微生物的分离和 纯化
实验八、土壤微生物的分离和纯化土壤微生物是指生长在土壤中的微弱的、微小的生物体，包括细菌、真菌、放线菌、原生动物等。
土壤微生物是土壤的重要组成部分，对维持土壤生态系统的平衡和功能发挥起着关键作用。
因此，对土壤微生物的分离和纯化具有重要意义。
本实验就是针对土壤微生物的分离和纯化进行研究。
一、实验原理由于土壤微生物数量繁多而多样，分离出单一的菌落对于此实验来说非常的困难。
但是采用适宜的富培养基后能够轻松的促进土壤微生物菌群的生长。
富培养基包括有机和无机元素、维生素、氨基酸、碳源和氮源。
地衣素琼脂（ISP）是一种富含多种碳源和氮源的优质菌落培养基，是常用的微生物培养基。
本实验的基本原理就是在能够生长的环境中分离出单一的菌落，通过多次分离和鉴定获得纯种菌株。
二、实验器材和试剂1.地衣素琼脂培养基2.试管、移液器、移菌环、烧灼器、电热蚊子香、灭菌器3.已经壳霉菌疫苗接种的贵州悬钩子种子和土壤三、实验步骤1.准备工作。
用移液器将壳霉菌疫苗接种在新的地衣素琼脂培养基板上，将其灭菌，以备之后的使用。
2.准备土壤基质。
将土壤样品剪碎成非常小的颗粒，并放入烧灼的试管中，加入恰当的地衣素酵母素琼脂，变形后形成一个接种板。
在较大的容器中放置电热器设备，以保持环境的湿度和温度适宜。
接下来，将接种板和采样站放在单独的区域以免混淆。
3.接种。
从土壤中取一小部分，倒入试管中，并加入适量的地衣素琼脂培养基，并将其摇动均匀，使菌群溢出。
等到土壤均匀地分散在地衣素琼脂培养基中之后，用移菌环扭曲并切出一个菌落，并将其置于新的地衣素琼脂培养基板中。
重复此步骤至少三次，每次都要将新的分离土壤菌落剪出来。
4.孵育。
将地衣素琼脂培养基板置于电热器设备中，以使温度保持在合适的范围内，并等待菌落的生长。
当新的菌落形成后，即可重复上述步骤以获得更多的菌株。
5.纯化。
检查菌落后，需要进行纯化。
鉴定每个菌落，把每个菌落分别悬浮在新的地衣素琼脂培养基板中，并等待菌落的生长。
土壤微生物的分离纯化与鉴定
目录摘要利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化,得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌;根据菌落形态观察,革兰氏染色结果,芽孢有无及位置,运动性以及一系列的生理生化试验的结果,对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群;关键词土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养前言在自然条件下,微生物常常在各种生态系统中群居杂聚;群落是不同种类微物的混和体;为了生产和科研的需要,人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株;这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术;纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代;分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成;实验目的1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的方法；2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法；3.学习测定土壤中细菌数目,种类的方法；4.根据菌落形态,染色结果,运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室培养法观察鉴定未知真菌;实验原理一、经典分类鉴定方法以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程,因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察,染色,生理生化试验,免疫学试验等对其进行逐步定位;二、现代分类鉴定方法1．微生物遗传型的鉴定（1） DNA碱基比例的测定 G+Cmol%以下为该方法的关键因素：解链温度法Tm值G+Cmol%值只能做否定判断；G+Cmol%值差别>5,属不同的种；差别>10,属不同的属;2 核酸分子杂交法DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专一性;结论：I DNA同源性≥ 60% 同种II DNA同源性≥ 70% 同亚种III DNA同源性60~ 70% 不同亚种IV DNA同源性20~ 60% 同属316s rRNA作为细菌进化的计时器本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制,主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主;实验整体思路：在确定取样环境之后,对微生物原样进行梯度稀释,产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数；通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化,用平板划线法多次划线得到纯种；对得到的纯种细菌染色并镜检,利用形态学方法以及运动性对微生物做一粗略的定位；根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位；运用小室培养法观察霉菌形态并对其进行鉴定；根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位;实验仪器及材料1.土样：18号土样2.试剂及培养基a)培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等3.仪器锥形瓶500mL×2；300mL×2；100mL×3、培养皿20套、试管20支、移液管3支、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等实验步骤A.细菌的筛选,分离纯化及鉴定1.细菌的筛选a)土样处理i.配制生理盐水：在烧杯中配置％的生理盐水,用移液管各移取9ml于五支洁净试管,再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶,并放入少许玻璃珠,包好灭菌；ii.加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中,充分震荡摇匀,然后放在30℃恒温培养箱中静置15min;b)果胶酶菌种筛选i.梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀,此为10-1稀释液,以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液如下图；ii.涂布：配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上10-1、10-3两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；iii.培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；iv.果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿,用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；v.菌落描述：取此菌进行菌落形态描述,就菌落的大小大、中,小,颜色白,黄,粉红等,干湿干、湿,边缘整齐,不整齐,表面光滑,粗糙,有无突起等分别进行阐述并详细记录；2.细菌的分离纯化a)划线分离：制备果胶酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取具有水解圈的菌种,第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火图细菌的划线分离示意图焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.细菌的基本形态及运动性鉴定a)纯种果胶酶水解能力的测定配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,将分离纯化的细菌点种于平板上注意：点种的量不宜过多,以3～4个为宜,在30℃培养箱中培养1～2天,取培养后的平皿用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,测量并记录透明圈的大小b)简单染色步骤i.涂片取一块载玻片,在上边用胶头滴管加半滴无菌水,用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹,待看到微弱的浑浊即可；注意取菌不要太多ii.干燥与固定涂菌面朝上,通过火焰以干燥并固定菌物,固定过程应使载玻片通过火焰2-3次,注意温度的控制,过热的温度会将细菌杀死,温度以手背感觉微微发烫为标准；iii.染色将载玻片平放于载波片支架上,滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可,染色iv.水洗倾去染液,将载玻片的涂菌面朝下,自来水冲洗,水流不宜太急、太大,至洗出水无色为止；v.干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌的形态;c)革兰氏染色步骤i.涂片先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域,在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水;分别取四种活跃生长期菌种大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,枯草杆菌和一种自选菌按常规方法涂片不宜过厚,用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定;ii.初染滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位,染色后水洗；iii.媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min后水洗；iv.脱色先用乙醇冲去水迹,然后用95%乙醇覆盖脱去色素,脱色约30s,立即用水冲洗；v.复染先用番红洗去水迹,然后滴加番红复染后水洗；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌;分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照,来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果;d)芽孢染色步骤i.涂片,加热干燥及固定在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水,分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌;然后按照常规方法加热干燥及固定；ii.孔雀绿加热染色用木夹夹住载玻片,向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位,然后在酒精灯上微微加热孔雀绿着色能力强,加热可使较难染色的芽孢染成绿色,且再难洗脱至染液冒蒸汽开始计时并维持5min,注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜,过热或加热不足均会影响观察效果,且加热时在载玻片上随时补加染液,切勿让涂片干涸；iii.水洗水洗一定要等载玻片冷却后进行,否则可能导致载玻片的破裂;具体水洗按常规方法进行；iv.复染用%番红水溶液复染2min；v.水洗并干燥按常规方法水洗后自然干燥；vi.镜检先在低倍镜下寻找视野范围,然后换用高倍镜调焦,最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢;e)半固体穿刺法观察细菌运动性i.配制培养基配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基,分装于4支试管内,110度灭菌20-30分钟,正立于烧杯中冷却至室温；ii.在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近但勿触及试管底,然后循原路退出;如图所示：iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性;4.细菌的生理生化试验a)淀粉水解试验i.培养基制备配制淀粉培养基,灭菌后将冷却至50℃左右,无菌操作制成平板；ii.接种用记号笔将平板划成四部分,将所鉴定的菌种在不同位置点种;注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同,为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠,宜采用点种的方式,如下图;接种完成后贴好标签；iii.培养将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时;b)葡萄糖发酵试验i.培养基配制将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;c)乳糖发酵试验i.培养基配制将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有乳糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;d)吲哚试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;e)甲基红试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;5.土壤中分解果胶细菌种类和数目的测定及纯化细菌菌属鉴定取培养三天的菌液1000倍稀释涂布平板3个,观察不同形态菌落的数目以及总菌落数,并记录,求3个平板的总菌数平均值来计算1g土壤中分解果胶的细菌数目;根据以上细菌的形态,革兰氏染色结果,芽孢的位置,运动性以及生理生化试验结果查看伯杰手册对纯种细菌做出鉴定;B.霉菌的筛选,分离纯化及鉴定1.霉菌的筛选a)涂布配制几丁质酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却至不烫手,无菌操作加链霉素1mL/1000mL倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上100、10-2两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由100、10-2两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；b)培养将平板倒置于30℃恒温箱中培养2-3天；2.霉菌的分离纯化a)划线分离：制备几丁质酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取长出的菌种,第一次划线分离培养2-3天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以图霉菌的划线分离示意图降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)再配制一份PDA培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.小室培养法鉴定霉菌a)灭菌准备制作4个平皿,在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片,再放一U形玻棒,其上放一洁净载玻片和四块盖玻片,盖上皿盖、再与1个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL锥形瓶中用甘油配制20%的甘油,加塞包好；最后取10mL 移液管两支用牛皮纸包好;b)灭菌将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110℃灭菌30min由于培养基中有葡萄糖,为防止由于高温而使糖发生糊化而变质,灭菌温度不宜过高;c)制作琼脂薄片在无菌操作台上分别取已灭菌并溶化冷却至约50℃的马铃薯琼脂培养基6～7mL 注入两个灭菌空平皿中,使之凝固成薄层;在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约1～×1～的方格,通过无菌操作,用解剖刀沿画下的方格线将其切成方形的琼脂块;注：解剖刀使用前应先在酒精中浸泡,然后在酒精灯上灼烧,冷却后再进行切割操作d)接种在无菌操作台上,先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上,然后用解剖刀取一小块儿琼脂块,置于载玻片上注意：镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡,灼烧冷却后再进行下一步的操作,用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的鉴定菌的孢子,分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上,用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上;最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml 灭菌的20 %的甘油用于保持平皿内的湿度 ,盖上皿盖并贴标签,每一种菌接种两个小室;e)恒温培养将接种后的平皿正置于28℃培养箱中恒温培养3～4天;f)镜检在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片,用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子,根据真菌手册对所得的菌进行鉴定;实验结果A.细菌部分倍稀释平板的细菌种类和数目表错误!未定义书签。
王--实验二 土壤中微生物的分离与纯化
王--实验二土壤中微生物的分离与纯化
土壤中是存在大量微生物的，包括细菌、真菌、放线菌等，在生态系统中起着重要作用。
微生物的分离与纯化是微生物学研究的重要方法之一，对于了解土壤微生物多样性、功能和应用具有重要意义。
本实验旨在通过土壤样品进行微生物分离和纯化，了解微生物分离技术和分离纯化菌株的方法。
一、实验方法
1.1 实验设备
实验室常用的分离纯化设备有平板计数器、减压灭菌器、烧杯、移液器、离心机等。
其中，平板计数器是精确测定细菌数量的仪器。
实验材料包括培养基、细菌液、土壤样品等。
1.3 分离纯化细菌的步骤
（1）将土壤样品放入离心管内。
（2）在土壤样品中加入生理盐水，摇晃离心管，使土壤样品和生理盐水充分混合。
（3）将混合物在烧杯内振荡。
（4）利用平板计数器精确测定细菌数量。
（5）从混合物中挑出单个菌落，进行菌株分离和纯化。
（6）将菌落移至培养基上，进行培养、观察和记录。
二、实验结果
通过本实验，我们共采集了5个不同土壤样品，进行菌落计数和菌株分离、纯化、培养等处理。
实验结果显示，不同土壤样品中微生物的数量和种类存在差异。
其中，含有腐殖质较多的土壤样品中微生物数量较多，且种类丰富。
2.2 结果分析
土壤微生物数量和种类的差异主要与土壤样品的营养含量及物理化学性质有关。
白灰土、黄土、红壤等含有较高营养含量和较优地理环境的土壤样品中微生物的数量和种类较多，而贫瘠荒芜的土壤样品中微生物数量和种类较少。
此外，氧分压、pH值、盐分等土壤环境因素的差异也会导致土壤中的微生物数量和种类存在差异。
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告
实验目的
本次实验的目的是利用物理、化学和生物性等技术，从原始土壤样品中分离、筛选和纯化微生物株，并对分离出的微生物株进行形态学特征观察和分类鉴定。
实验材料
1. 原始土壤样品
2. 饱和淡盐水
3. 10% (v/v) 的平衡磷酸盐溶液
4. 0.85% (w/v) 的千顷盐溶液
5. 2% (w/v) 的体糖酸钠溶液
6. 氯仿
7. 板藻素
8. 无菌玻璃管
实验步骤
1. 将原始土壤样哮放入摇瓶内，加入淡盐水攪拌均匀，进行粗筛提取。
2. 将1ml混合液放入无菌玻璃管，8次补充磷酸盐溶液悬浮液进行细筛提取。
3. 将细筛提取的悬浮液转移到新的无菌容器中，加入盐溶液攪拌均匀。
4. 加入盐溶液之后，用氯仿消毒，然后加入体糖酸钠溶液留取微生物株悬浮液。
5. 使用板藻素进行单菌株筛选，筛选出单菌株。
6. 将筛选出的单菌株进行形态学特征观察和分类鉴定。
结果
本次实验中，经过物理、化学和生物性等技术操作，成功分离出一株微生物株，并对其进行形态学特征观察和分类鉴定，得出结果：该株微生物属于假单胞菌科，耐盐性，呈菌封形态。
结论
本次实验成功分离纯化出一株微生物株，该株微生物属于假单胞菌科，耐盐性，呈菌封形态。
土壤中微生物的分离与纯化实验报告
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实验(二)土壤中微生物的分离纯化及观察
2.稀释:
0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml
原样
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
0.2ml
0.2ml
0.2ml
3.取样
10-4
10-5
10-6
4.倒平板：倒入融化后冷却至45℃的培养基15～２５ml， 置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。
么？
当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在
一起时，你认为问题出在哪里？
用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不
同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？
倾注法
涂布法
倒平板
a 皿加法
b手持法
细 菌Leabharlann 霉菌放线菌实验内容
一、稀释涂布平板法（全组完成）
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 ：涂布10-3、10-4、10-5三个剃度，每个剃度两 块平板 高氏Ⅰ号培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度两块平板 马丁氏（孟加拉红）培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度 两块平板
器材
分离源：自采集土壤样品
培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏Ⅰ号 培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基 溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。
仪器或其他用具 振荡器，无菌培养皿，无菌 吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等。
一、稀释涂布平板法（全组完成）
1、编号：取无菌平皿１８个。另取无菌水４支，依次 标明10-2、10－3、10-4、10-5。
0.5ml
各4.5ml 无菌水
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告摘要本实验以镍离子作为纯化培养基，利用离子交换介质对细菌进行纯化，以筛选出较为纯化的细菌株。
本实验在4种离子强度（0.05M，0.1M，0.2M，0.3M）条件下，比较发酵性状态（游离镍离子浓度）下，测试样本的细菌含量。
结果表明，在游离镍离子浓度高的条件下，细菌含量会减少，细菌的质量也会更高。
1、引言土壤细菌是土壤中的重要微生物，可以改善土壤的生态环境，增强土壤的抗逆性，从而促进土壤的健康发展。
为了更好地研究土壤微生物的功能，有必要分离和纯化土壤中的细菌，以便进一步的研究。
本实验以镍离子作为纯化培养基，结合离子交换介质，以高纯度细菌取得细菌的纯化株系。
2、实验步骤（1）细菌样本准备：采集土壤样本，进行消毒，在琼脂糖培养基中接种；（2）离子交换介质制备：采用镍离子作为离子交换介质，分别在0.05M，0.1M，0.2M，0.3M离子强度条件下制备离子交换介质；（3）离子交换：将离子介质加入土壤液液分离细菌，离子介质被细菌吸收，细菌的活性被浓缩，可以获得较纯的细菌株，（4）纯化细菌：将细菌纯化物放入培养瓶进行培养，经过重复接种，最终获得纯化细菌株；（5）细菌测定：采用镍离子浓度测定细菌含量，测试样本的细菌含量。
3、实验结果实验结果如表1所示：表 1 细菌含量测定结果游离镍离子浓度（M）t细菌含量0.05t 62.5%0.1t 40.0%0.2t 12.5%0.3t 6.3%4、实验讨论从实验结果可以看出，随着游离镍离子浓度的增加，细菌含量会减少，从而达到较高的纯度。
其原因是离子交换介质中的镍离子与细菌表面的酶活性位点结合，以抑制细菌的活性，使菌体停止生长和繁殖，最终达到纯化株的目的。
5、结论本实验使用镍离子作为纯化培养基，结合离子交换介质，以高纯度细菌取得细菌的纯化株系。
实验结果表明，在游离镍离子浓度高的条件下，细菌含量会减少，细菌的质量也会更高。
实验一土壤中微生物的分离纯化
目录
• 引言 • 土壤样品采集与处理 • 微生物分离纯化方法 • 微生物培养条件与培养基选择 • 微生物鉴定与结果分析 • 实验注意事项与误差分析
01
引言
实验目的
分离土壤中的微生物
鉴定微生物
通过特定的培养条件，将土壤中的不 同种类微生物分离开来。
对分离纯化的微生物进行形态学、生 理生化特性等方面的鉴定。
废弃物处理
将实验废弃物分类收集，妥善处理，避免对 环境造成污染。
常见误差来源及减小误差方法
样品采集误差
试剂误差
确保采样工具干净，避免交叉污染；采样 点要具有代表性，避免偶然性误差。
使用优质试剂，确保试剂纯度和浓度准确 ；注意试剂保存条件和使用期限。
操作误差
设备误差
提高操作技能，减少操作失误；保持实验 环境稳定，避免外部因素干扰。
促进目标微生物的分离和纯化。
03
鉴别培养基
在基础培养基中加入某种试剂或化学物质，依据微生物代谢产生的某种
物质与特定试剂反应，产生明显的颜色变化或沉淀，从而鉴别不同种类
的微生物。
培养条件设置（温度、pH等）
温度
不同微生物对温度的需求不同，一般分为低温、中温和高温 微生物。在实验中，需根据目标微生物的生长温度要求，设 置相应的培养温度。
采样工具及容器准备
采样工具
使用无菌的铲子、勺子或土壤钻 等工具进行采样，避免交叉污染 。
容器准备
选择无菌的塑料袋、玻璃瓶或塑 料瓶等容器，确保容器干净、干 燥、密封性好。
采样方法及注意事项
01
02
03
04
去除表面杂质
去除土壤表面的植物残渣、石 块等杂质。
土壤中四类微生物的分离纯化
200ml。
加热溶化，分装，121℃高压灭
菌 20min。
霉菌 酵母菌
可溶性淀粉 4g、K2HPO4 0.1g、 先将淀粉加入烧杯中搅拌，再加
高氏 1 号培养基
NaCl 0.1g、MgSO4.7H2O 0.1g、KNO3 0.2g、FeSO4
入其他成分依次溶解，最后加水 至 200mL。调 pH7.2～7.4，加入
0,002g、琼脂 4g,H2O 200ml 琼脂，121℃高压灭菌 20min。
放线菌
牛 肉 膏 1g 、 蛋 白 胨 先将牛肉膏、蛋白胨溶入烧杯中
牛肉膏蛋白胨 培养基
2g,NaCl1g 、琼 脂 4g、H2O 搅拌至完全溶解，再加入其他成
200ml
分依次溶解，最后加水至
200mL，加入琼脂， 121℃高压
生存条件：土壤是微生物最良好的天然培养基，它具有微生物所必需 的营养和微生物生长繁殖及生命活动所需的各种条件。
1. 营养：土壤中有大量动物和植物残体，植物根系的分泌物，还 有人和动物的排泄物，有丰富的无机元素，且含量相当高，还 有微量元素。
2. pH：土壤 pH 范围多数在 5.5-8.5 之间，有不少接近中性，适合微生 物的生长。
3. 渗透压：土壤中的渗透压对微生物粒结构，有无数的孔隙为土壤创造通气条件， 通气良好与否只是改变土壤中微生物种类的分布，通气良好有利于 好氧微生物的生存繁殖，通气不好则有利于厌氧微生物的生存，所 以对微生物的数量影响不大；这些孔隙还起到毛细管的作用，具有 持水性，为微生物提供了水分。
细菌菌落
细菌观察 结果
因为我们组的制备牛肉膏失败了，所以只能用 A 组的细菌菌落图片。但是由 于其他培养基受到细菌的污染，所以仍然可以取到细菌进行观察。
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物是土壤中最为丰富的生物群体之一，它们在土壤中扮演着重要的角色，如分解有机物质、固氮、矿物质转化等。
因此，对土壤微生物的研究具有重要的意义。
本文将介绍土壤微生物的分离和纯化实验。
一、实验目的
1.了解土壤微生物的分离和纯化方法；
2.掌握土壤微生物的培养技术；
3.观察土壤微生物的形态特征。
二、实验步骤
1.取一定量的土壤样品，加入适量的生理盐水中，摇匀后过滤；
2.将过滤液分别接种在不同的培养基上，如营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂等；
3.将培养皿放置在恒温培养箱中，控制温度、湿度等条件；
4.观察培养皿中的微生物生长情况，挑选单一菌落进行分离和纯化；
5.将单一菌落接种在新的培养基上，重复以上步骤，直至获得纯种菌株。
三、实验结果
经过培养和观察，我们成功地分离出了多种土壤微生物，如放线菌、链霉菌、芽孢杆菌等。
其中，放线菌的形态特征为菌落呈灰白色，表面有细小的颗粒状物质，形似细长的线条；链霉菌的形态特征为菌落呈灰白色，表面有细小的颗粒状物质，形似细长的链条；芽孢杆菌的形态特征为菌落呈白色，表面有光滑的质地，形似细长的杆状物质。
四、实验结论
通过本次实验，我们了解了土壤微生物的分离和纯化方法，掌握了土壤微生物的培养技术，观察了土壤微生物的形态特征。
这些都为我们深入研究土壤微生物的生态学、生理学、遗传学等方面提供了基础。
同时，我们也认识到了土壤微生物在土壤生态系统中的重要作用，应该加强对其研究和保护。
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土壤微生物的分离和纯化
一、实验目的
1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。
3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。
二、实验原理
土壤是微生物生长和栖息的良好基地。
土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。
因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于培养细菌。
链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。
加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。
重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。
三、实验器材
1、材料：10cm左右深层土壤。
2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基
3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚、无菌水。
四、实验步骤
1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。
2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释10－2的土壤悬液。
然后进行十倍梯度稀释，依次制备10－
3、10－
4、10－
5、10－
6、10－7 稀释度的土壤稀释液。
3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。
灭菌后分别倒3个平板。
（高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素）
4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。
细菌选用10－4、10－
5、10－6 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2 、10－3、10－4三个稀释度，分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。
（一个稀释度一个平板）
5、培养：细菌平板于37℃恒温培养1～2d，放线菌于30℃培养2～3d，霉菌于30℃培养3～5d ，观察。
6、计数：用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，报告细菌总数/(CFU·ml-1)
7、纯化：挑取典型菌落接种于相应平板，培养条件同上，培养纯化。
五、思考题
1、分离放线菌和真菌为什么需要分别加重铬酸钾和链霉素？
2、怎么检验培养皿上的某个单菌落是不是纯培养？。