抗药性突变株的获取和突变率测定
试验十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株
实验十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株【实验目的】：了解并熟悉抗药性突变株的筛选原理和方法【实验原理】：经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变的数目大大增加，但所占的比例仍然是整个群体中的极少数。
为了快速、准确地得到所需的突变体，必须设计一个合理的筛选方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。
梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法，其操作要点是：先加入不含药物的培养基，立即吧培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含一定浓度药物的培养基，这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基，然后再将大量的菌液涂布于平板表明上。
经培养后，在高浓度药物处出现的菌落就是抗药性突变型菌株。
【材料和器皿】：（1）菌种：大肠埃希氏菌（2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2×（2倍浓度）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于小三角瓶中，每瓶装20ml），生理盐水。
（3）器皿：培养皿，涂布棒，移液管，滴管，离心机【方法和步骤】：1 制备菌液从已活化的斜面菌种上挑一环大肠埃希氏菌于装有5ml牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心管中（接2支离心管），置37℃条件下培养16h左右，离心（3500r/min，10min），弃去上清液后再生理盐水洗涤2次，弃去上清液，重新悬浮于5ml的生理盐水中。
并且将2支离心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成108/ml的菌液。
然后吸3ml菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿中。
2 紫外线照射（1）预热紫外灯：紫外灯功率为15W，照射距离30cm。
照射前先开灯预热30min。
（2）照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并计时，当照射达2Min 后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。
3 增殖培养（在暗室红灯下操作）照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3ml 2×牛肉膏蛋白胨培养液的小三角瓶中，混匀后用黑纸包裹严密，置37℃培养过夜。
微生物遗传学三
单链整合 复制与分离
转化子(strR) 肺炎链球菌转化的主要过程
非转化子(strS)
转化因子进 入细胞
转化因子单链 配对与整合
复制 分离
筛选的方法: a. 高于临界浓度的平板进行分离； b. 梯度平板法
所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等 ）相似的物质。
如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变 株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。
为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?
补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B
相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
三种遗传型：
野生型（wild type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。
[A+B+], 可在[-]生长。
营养缺陷型（auxotroph） 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。
出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、
标记明显等）； • 对诱变剂敏感
出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
a
b
c
单一营养物质要求的鉴定：
以氨基酸缺陷为例进行说明 将18种氨基酸按右表分为6组
特点：每2组只有一种共同物质
NTG诱变筛选高产柚苷酶抗药性突变株
１ 摇 瓶 发 酵 单 位 达 ７０ ０ ／ 株 ７ ．６Ｕ ｍＬ的 ３— ４一Ｎ Ｇ一１ 菌 株 ， ５ Ｔ ６号 比出 发 菌 株 的产 酶 能 力 提 高 了近 １０ 。 ０％
关 键 词 ： 苷 酶 ； 药 性 致 死 突 变 ； 明 圈 柚 抗 透 中 图分 类 号 ： ９ ６ ５ Ｑ ４ ． 文献 标 识 码 ： Ａ
Ｋ ｅ ｏ ｄｓ：ｎ ｒｎ ｉ ａ ｅ； ｈ ｍｉａ ｅ ｉｔｎ ｅｈ ｌｍ ｕ ａｉｎ；ｒ ｎ ｐ ｒ ｎ ｉｃ ｅ ｙｗ ｒ ａ ｉ ｇｎ ｓ ｃ ｅ ｃ ｌｒ ｓｓａ ｔｌｔ ａ ｔｔｏ ｔａ ｓ ａ ｅ ｔｃ ｒｌ
柚皮 苷是 柑桔 类水果 中 的主要苦ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ味物 质 ，柚苷 酶能将 其分 解为柚 配质 （ ａｉ ｅｉ） 葡 萄糖 和 鼠李 Ｎ ｒ ｇ ｎｎ 、 ｎ 糖， 因而该 酶 可用 于柑橘 制品 的脱苦 。在 这方 面的应 用 国 内外 已有许 多报道 ¨“ ， 但在我 国柚 苷 酶并 没
文章编 号 ：００ ２８ （０７ ０ — ６０ ０ １ — ２６ ２０ ）４ ０７ — ５ ０
Ｎ Ｇ诱 变 筛选 高产 柚 苷酶 Ｔ 抗 药性 突变株
陈 玲 ， 晓嵘 ， 国全 涂 涂
（ 西 农 业 大 学 生 物 科 学 与 工 程 学 院 ， 西 南 昌 ３ ０４ ） 江 江 ３０ ５
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ｏ ｅ ｉ ａ ｓｓ ａ ｔ Ｍ ｕ ｎ ｔ ａ ｎ ｔ ｇ ｃ ｅ ｎ ｎ ｆ Ｃｈ ｍ ｃ ｌＲｅ ｉｔ ｎ ａ ｔ ｔ Ｓ ｒ ｉ ｓ ｗｉｈ Ｈｉ ｈ Ｎａ ｉ ｇ ｎ ｓ －ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ Ｃａ ａ ｉｙ ｂ ｅ ｎ ｆ ＮＴＣ ｎ ｕ ｔｏ ｒｎ ｉ ａ ｅ・ ｒ ｄ ｃ ｎ ｐ ｃ ｔ ｙ Ｍ ａ ｓ ｏ － Ｉ ｄ ｃｉｎ
(1)大肠杆菌菌液6ml放入无菌培养皿-PPT精品文档
7. 对照设计及结果评估：每次试验均需设有自发突变对照。 做法基本与上相同，但在菌悬液内不加吖啶橙待测样品液。 经37℃培养48h后，观察在加药和不加药平板上长出的菌 落，记录并算出每组平皿菌落平均数/皿，以Rc表示。
突变率（MR）= 每皿诱变菌落均数（Rt） 每皿自发突变菌落均数（Rc） 只有突变率 > 2时才认为样品属艾姆氏试验阳性。当试验样 品浓度达500ug/皿仍未出现阳性结果时，便可报告该待测 样品属艾姆氏试验阴性。 对于阳性结果的样品，其试验结果尚要经统计分析，若计算 剂量与回变菌落之间有可重复的相关系数，经相关显著性 检验，最后才能确认为阳性。
稀释倒平板法
1 ml
1.dilute sample 10 cell no/ml 9 ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
2. plate out 0.2 ml
5、诱变处理：
（1）预热：正式照射前开启紫外灯预热10min。
（2）搅拌：取制备好的菌悬液6ml移入9cm的无菌培养皿中， 放入无菌磁力搅拌棒、置磁力搅拌器上，15W紫 外灯下30cm处。 （3）照射：打开皿盖边搅拌边照射，剂量为3、6 min。 所有操作必须在红灯下进行。
五、实验报告
见实验讲议
实验五 细菌原生质体融合
一、目的要求
1、了解原生质体融合技术的原理。
2、学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。
二、基本原理
原核微生物基因重组可通过转化、转导、接合等途径，但有 些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的 限制。1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有 人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由 于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种 工作所广泛研究和应用。
大肠杆菌实验报告
大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选0740063 阿噟兰1.前言抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。
但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。
在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。
当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。
如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。
DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。
因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。
一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。
选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。
在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。
本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。
若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。
紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。
因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。
在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。
2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml Ph7.0按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。
紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选
紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选姓名：张鑫淼班级：生工1301一．实验目的以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。
了解细菌抗药性突变株的筛选方法二．实验材料菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。
仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4 营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL三．实验原理以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。
因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。
为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。
物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。
在生产和科研中可利用此法获得突变株。
链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。
细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。
四．实验内容与操作步骤（一）出发菌株菌悬液的制备1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h；2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h；3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液；4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞；5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。
2022年福建技术师范学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年福建技术师范学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、细胞壁的主要功能，一是______，二是______，并具有______、______以及______。
2、T4噬菌体由______、______和______三部分组成。
3、耐氧菌之所以能在有氧的环境中生存，而不被超氧阴离子自由基所毒害，原因是其细胞内存在______和______两种酶。
4、放线菌为7.5～8.@5、酵母菌菌为3.8～6.@0、霉菌为4.0～5.@8、藻类为6.0～7.@0、原生动物为6.0～8.0。
@43、培养基按所含成分可分为______、______和______；按物理状态可分为______、______、______和______；按用途可分为______和______。
5、真菌是不含有______素、______营养，以______进行繁殖的真核微生物。
6、微生物包括的主要类群有______、______和______。
7、1971年，McCord和Fridovich提出了一个关于厌氧菌氧毒害机制的______学说。
其根据是厌氧菌缺乏______酶，一般也缺乏______酶，因此易受______等的毒害。
8、微生物将空气中的N2还原为NH3的过程称为______。
该过程中根据微生物和其他生物之间相互的关系，固氮体系可以分为______、______ 和______3种。
9、线粒体的核糖体在大小上类似于原核生物的核糖体，线粒体与细菌之间的近缘关系，支持真核的细胞器（线粒体、叶绿体）是由______演化出来的假设。
10、具有免疫原性和反应原性的抗原称为______，具有______而没有______的抗原称为半抗原。
二、判断题11、放线菌是一类陆生性较强的原核生物，它们产生的孢子都是不长鞭毛的。
（）12、只有能利用无机氮化物合成氨基酸的微生物，才属于氨基酸自养微生物。
（）13、肽聚糖合成过程中的一个重要中间产物称作“Park”核苷酸，就是UDP-N-乙酰胞壁酸四肽。
关于生物抗药性的两个经典实验
关于生物抗药性的两个经典实验关于生物抗药性的两个经典实验生物都具有不同程度的抗药性，抗药性的出现是突变的结果，是不定向。
通过一系列的实验可以证明这个结论。
在实验题中常出现两个经典的实验：1 果蝇抗药性的实验为了证实突变和自然选择学说，实验者曾把混合群体中的果蝇成对分开，繁殖为若干家系。
把每一家系分装两瓶，让其中一瓶作DDT 的抗性鉴定，也就是把涂有一定剂量DDT的玻片放入各个家系供鉴定的果蝇瓶中。
如果鉴定结果某一家系存活率最高，就把该家系另一瓶未放DDT玻片的果蝇选留，再一对对分开繁殖为若干家系。
每一家系同样分装两瓶，让其中一瓶作DDT的抗性鉴定，并增加玻片上DDT的剂量。
鉴别结果又有某一家系存活率最高，便又把该家系另一瓶未和DDT玻片的果蝇选留，同样再一对对分开繁殖。
这样，经过连续十多次的鉴定和选择，并且每次鉴定都增加玻片上DDT的剂量，选留下来的抗性家系抗DDT的能力可比原来的增加几百倍。
在这一实验中，DDT只起选择鉴别的作用，每次留下来作种的是抗性家系中未接触DDT的那一半，所以从实验开始到结束，它的后代都从未接触过DDT，这证明果蝇的抗药性不是定向变异和获得性遗传，而是在突变基础上单向性选择的结果。
2细菌抗药性实验用细菌作实验更可以在短期内获得卓有成效的结果，其中最著名的是利德伯格创造的细菌影印培养实验（见下图）。
实验开始，把液体培养的细菌涂布在含细菌生长必需营养成分的洋菜培养基上（1，2），保温培养约24小时后，就会在培养基表面出现由每个细菌细胞分裂繁殖所形成的许多菌落。
这时，可用缚有平绒跟培养皿直径一致的圆柱体按预先做好的箭号标证印到培养基上。
这样，每个细菌菌落便有部分细菌细胞按一定位置影印到平绒上（3）。
把缚有平绒的圆柱体同样按照箭号标记转移影印到另一个含青霉素或链霉素的洋菜培养基上（4），再保温培养，就可鉴定出那些能继续繁殖的抗性菌落。
这些抗性菌落是不是接触了抗菌素以后通过定向变异产生的呢？按照抗性菌落的位置在原来培养基上找出相应的菌落，并把它们接种到不含抗菌落，并把它们接种到不含抗菌素的洋菜培养基上，由于有其他细菌的竞争，由它们所形成的菌落便布满在洋菜培养基上。
遗传学实验 大肠杆菌抗药性突变株的分离
实验五报告大肠杆菌抗药性突变株的分离PB12210261 徐导中国科学技术大学生命科学学院【摘要】大肠杆菌有个体小、生活周期短、常能在简单的合成培养基上迅速繁殖等特点，并且可以在相同条件下处理大量个体，所以是进行遗传学研究的良好材料。
微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。
【关键词】大肠杆菌抗药性培养基【Abstract】Escherichia coli is individual small, short life cycle, can often features multiply rapidly in synthetic medium and simple, and can handle a large number of individuals under the same conditions, so that it is a good material for genetic research. Microbial resistance mutations are changes in DNA molecules in a specific position caused by the structure, has nothing to do with the presence of drug, a drug exists only as a means of separating a resistant strain, rather than as a trigger induced mutation.【Key words】Escherichia coli Resistance Culture medium【前言】大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。
微生物试题B卷参考答案
2005-2006学年度第二学期《普通微生物学》期终试卷B卷参考答案一．名词解释，请解释下列名词（共20分，每小题2分）：1. 悉生生物凡是接种了某种或某些已知纯种微生物的无菌动物或植物，称为悉生生物。
2. 性导当Hfr菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离染色体组时，可以重新形成游离的、但携带整合点附近的一小段染色体基因的F’质粒，当携带F’质粒的菌株和F-菌株结合时，可将供体菌的部分基因连同F质粒一起传递给受体菌，这种通过F’质粒传递供体基因的方式称为性导，又称为F质粒或F因子转导。
3. 延滞期又称为停滞期，指少量单细胞微生物接种到新鲜的培养液中后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目没有增加的一段时期。
4. 锁状联合蕈菌在菌丝延伸时通过形成喙状突起而连接两个细胞的方式不断时双核细胞分裂，从而不断使菌丝尖端不断向前延伸，此种菌丝细胞分裂的方式称为锁状联合。
5. 单克隆抗体由一纯系B淋巴细胞克隆经分化增殖后的浆细胞所产生的单一成分、单一特异性的免疫球蛋白分子。
6. 模式菌株指能够代表一个微生物种的典型菌株以及由该菌株传代得到的与原初菌株完全一致的纯培养物。
7. 假菌丝指酵母细胞经过一系列的芽殖后，长大的子细胞与母细胞不立即分离，其间仅以狭小的面积相连，这种藕节状的细胞串就称为假菌丝。
8. 抗代谢药物是指一类在化学结构上与细胞内必需代谢物的结构相似，并可以干扰正常代谢活动的物质。
9. 伴孢晶体少数芽孢杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形、方形或不规则形的碱溶性的蛋白质晶体称为伴孢晶体，又称为δ内毒素。
10. 次生F’菌株通过F’菌株与F-菌株的结合，使后者也成为F’菌株，这就是次生F’菌株。
11. LPS位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8-10nm）的类脂多糖类物质，有类脂A、核心多糖、O-特异侧链3部分组成。
12. 异形胞是存在于丝状生长的蓝细菌种类中的形大、壁厚、专司固氮功能的细胞，数目少而不定，位于细胞链的中间或末端。
抗药性突变株的分离
目的要求 基本原理 器材 操作步骤
一、目的要求
学习用梯度平板法分离抗药性突变株
二、基本原理
基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞
的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有 害的环境中戚下来，抗药性突所致，与药物的存在 无关，某种药物的存在只是作为分离某种 抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发 突变的诱导物。
用1 mL无菌吸管吸取0.2 mL大肠杆 菌培养液Strs涂布于梯度平板上。用 无菌玻璃棒将菌液涂布到整个平板表 面。平板倒置于37℃培养48h。
4. 抗性突变菌株分离(第三次培养) 选择1-2个生长在梯度平板中部的 单个菌落，用无菌接种环接触单个菌 落朝高药物浓度的方向划线。平板倒 置于37℃培养48h。
发生不同的生理、生化变化, 与药物的存
在无关。
2) 耐药性基因转移: 耐药质粒,转座子, NDM-1 (金
属 β-内酰胺酶):对β-内酰胺类抗生素（青霉素类抗生素和 头孢菌素）、大环内酯类抗生素（红霉素、罗红霉素、 阿奇霉素等）、氨基糖苷类抗生素（庆大霉素、链霉素
等）、四环素类抗生素（四环素、强力霉素、金霉素等，
替加环素除外）、喹诺酮类抗菌药（环丙沙星、司帕沙
星等）、磺胺类药、利福平等这些常用抗生素有极强的
耐药性 .
抗生素诱导的微生物抗药性产生
获得性耐药性 ： 是指以前敏感细菌，接触抗
生素后, 由于遗传基因的变化、生存代谢途径的
改变而产生的耐药性。
为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药 性突变菌株常用梯度平板法。
（3）在已凝固的平板底部高琼脂的一边 标上“低”，水平放置，倒入 100μg/mL链霉素（在培养基温度下降 至50 ℃ 左右加入）的LB琼脂10ml。过 夜，以便于抗生素渗透，获得0μg/mL 至100μg/mL链霉素梯度平板。
第六章微生物诱变育种
复合处理的方式
• 复合处理有几类：
• 一类是两种或多种诱变剂的先后使用；
• 第二类是同一种诱变剂的重复使用；
• 第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。
诱变因子的复合处理及其协同效应
单独处理 菌种 诱变剂 紫外线 X射线 氮芥 (0.1%) 紫外线 紫外线 γ射线 突变率(%) 21.3 19.7 复合处理 诱变剂 X射线+紫外线 突变率(%) 42.8
因此，应让变异处理后细胞在液体培养基中培养 几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以 得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现 出来。 若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分 离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌 落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果 的不稳定和将来的菌株退化。
3、诱变处理方法
（１）、紫外线和光照复活的交替处理
• 应用光照复活现象能使紫外线诱变作用得 到显著增强。 • 一次紫外线处理后，光照复活一次，突变 率降低；但是，增加剂量再次用紫外线照 射处理，光照复活后，突变率提高了。若 多次进行该处理，则突变率增加更大。
（２）诱变剂复合处理
• 诱变育种中还常常采取诱变剂的复合处理。 因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起 的变异有局限性，复合处理则可扩大突变 的位点范围，使它们产生协同效应，获得 正突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂 复合处理的效果往往好于单独处理.
32
突变株的筛选：
（1）产量突变株的筛选：琼脂块培养法 （2）抗药性突变株的筛选：梯度平板法 （3）营养缺陷型突变株的筛选：影印平板 法等 （4）形态、色素、酶活性和拮抗性等变异 菌株的筛选
诱变
春 日 霉 素 高 产 菌 种 琼 脂 块 培 养 法 筛 选
第七章 微生物的遗传变异和育种
以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在 一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细 胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。
第7页，共93页。
1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty从热死S
型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在 离体条件下进行了转化试验：
第20页，共93页。
4、质粒在基因工程中的应用
质粒的优点：
（1）体积小，易分离和操作 （2）环状，稳定 （3）独立复制 （4）拷贝数多 （5）存在标记位点，易筛选
E. coli的pBR322质粒是一个 常用的克隆载体
第21页，共93页。
5、质粒的分离与检定
提取所有胞内DNA后电镜观察； 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；
F.Griffith，
研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）
S型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性;
R型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性
第5页，共93页。
1928年，Griffith进行了以下几组实验：
（1）动物实验 对小鼠注射活R菌或死S菌 ————小鼠存活 对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 ———小鼠死亡 抽取心血分离
活的S菌
加热杀死的S型细菌里可能存在一种具有遗传转化能力的物质，它能通过 某种方式进入R型细胞，使其获得S型的遗传特性
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（2）细菌培养实验
热死S菌———平皿—培—养 不生长 活 R 菌——平皿—培—养 —长出R菌 热死S菌——+活—R—菌 —长出大量R菌和10-6SI菌
微生物试题(含答案)
微生物试题（含答案）一、单选题（共58题，每题1分，共58分）1.反硝化细菌进行无氧呼吸产能时,电子传递的最终受体是()A、氧气B、无机化合物中的氧C、中间产物D、氢正确答案：B2.F+细胞相对于F—细胞的形态学特点是()。
A、个头较大B、有性菌毛C、菌毛数更多D、有鞭毛正确答案：B3.测定土壤中微生物的总数采用的方法是()A、血球计数板法(单细胞酵母菌或丝状真菌孢子)B、涂片计数法C、比浊计数法D、以上均可以正确答案：B4.按照现代生物学的观点,微生物首先可分为()。
A、细胞型微生物和非细胞型微生物B、细菌和真菌C、原核微生物和真核微生物D、病毒和亚病毒正确答案：A5.下列微生物中属于地球早期生物的是()。
A、根瘤菌B、蓝细菌C、菌根真菌D、真菌正确答案：B6.微生物生态系统自身的特点不包括()。
A、稳定性B、微环境C、协调性D、适应性正确答案：C7.微量元素作为营养物质的主要功能()A、提供能量B、促进固氮作用C、酶的促进剂D、酶的组成成分(生长因子正确答案：A8.诱变育种中,霉菌和放线菌培养到的阶段是()。
A、孢子产生期B、气生菌丝发育期C、孢子成熟期D、基内菌丝发育期正确答案：C9.含水量最高的微生物类群是()A、丝状真菌B、放线菌C、酵母D、细菌正确答案：A10.微生物中的三致不包括()。
A、致霉变B、致畸变C、致癌变D、致突变正确答案：A11.微生物分类学主要探索微生物之间的()。
A、遗传关系B、逻辑关系C、进化关系D、亲缘关系正确答案：D12.柯赫提出了证明某种微生物是否为某种疾病原体的基本原则()。
A、菌种原则B、巴斯德原则C、免疫原理D、柯赫原则正确答案：D13.局限性转导的媒介是()。
A、性菌毛B、鞭毛C、烈性噬菌体D、温和噬菌体正确答案：D14.将细菌作为实验材料用于遗传学方面的研究优点是()。
A、生长快速B、易得菌体C、代谢类型多D、所有以上特点正确答案：D15.接合作用中需要借助的媒介是()。
产量突变株的筛选
2.诱变育种的步骤
出发菌株
纯化，同步培养
挑变异菌于斜面培养基上
培养液
离心收集细胞、洗涤，制 菌 悬液，玻璃珠打散，过 滤
初筛
性能粗测
单个细胞或孢子悬液
活菌计数，诱预备试验
复筛
性能精测
诱变剂处理
存活细胞计数，计算致死 率 变异率计算
菌种保藏及扩大试验
平板分离
菌种用于生产，并进行保藏
卡介苗： 牛型结核杆菌 –牛胆汁、甘油、马铃薯培养基—移种230代（13年） 显著减毒结核杆菌(即卡介苗)
(二)诱变育种
利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因 的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所 需要的高产优质力株。 一般通过营养缺陷型突变株、抗阻遏和抗反 馈突变型、抗性突变型（抗生素抗性突变株、 条件抗性突变株）来筛选。
营养缺陷型诱变筛选步骤及方法
诱变处理
营养缺陷型的浓缩
营养缺陷型的检出
营养缺陷型的鉴定
缺陷型的浓缩 ①抗生素法
原理：青霉素、制 霉菌素等抗生素作 用于正常生长着的 野生型微生物细胞， 而对处于休止态的 营养缺陷型细胞无 作用。 方法：将菌培养在 含抗生素的MM基中
②菌丝过滤法
适用于：丝状（放线 菌、霉菌） 原理：基本培养基上 只有野生型孢子发育 成菌丝；auxo孢子可 通过滤膜，野生型菌 丝不能通过。
3. 三类突变株的筛选
（1）产量突变株的筛选 （2）抗药性突变株的筛选 （3）营养缺陷型突变株的筛选
产量突变株的筛选
琼 脂 块 培 养 法
抗药性突变株的筛选
方法：梯度平板法（gradient plate）
用梯度平板法筛选抗代谢拮抗物突变朱
第八章微生物遗传变异与菌种选育习题及答案
第八章微生物遗传变异与菌种选育习题及答案第八章《微生物遗传与菌种选育》习题及参考答案一、名词解释1．点突变：DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变，称为点突变。
2．感受态：受体菌最易接受到外源DNA片段并实现转化的生理状态。
3．基因工程：又称重组DNA技术，它是根据人们的需要在体外将供体生物控制某种遗传性状的一段生物大分子-----DNA切割后，同载体连接，然后导入受体生物细胞中进行复制、表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
4．接合：遗传物质通过细胞间的直接接触从一个细胞转入到另一细胞而表达的过程称为接合。
5．F'菌株：当Hfr菌株内的F因子不正常切割而脱离其染色体时，可形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，含有这种F因子的菌株称为F'菌株。
6．诱变育种：使用各种物理或化学因子处理微生物细胞，提高突变率，从中挑选出少数符合育种目的的突变株。
7．营养缺陷型：由于基因突变引起菌株在一些营养物质（如氨基酸、维生素和碱基）的合成能力上出现缺陷，而必须在基本培养基中添加相应的物质才能正常生长的突变型。
野生型：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。
原养型：一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株。
9．重组DNA技术：是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物或新物种的一种崭新的育种技术。
10．基因重组：或称遗传重组，两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。
11．基因突变（genemutation）和移码突变：基因突变（genemutation）：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，而导致的遗传变化就称基因突变。
移码突变：指诱变剂会使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。
突变mutation指生物体的表型突然发生的可遗传变化
从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻 克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终 于解决了这场纷争。
1. 变量试验fluctuation test
– 易位--------是指断裂下来的一小段染色体再顺向或 逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。
染色体间畸变：指非同源染色体间的易位。
染色体畸变在 高等真核生物 中一般很容易 观察，但在微 生物中，尤其 在原核生物中， 还是近年来才 证实的。 许多理化诱变 剂的诱变作用 都不是单一功 能的。
Hale Waihona Puke ➢ 由40年代B. McClintock对玉米粒色素斑点变异的遗传研究而 发现染色体易位，自1967年以来，已在微生物和其它生物中 得到普遍证实，并已成为分子遗传学研究中的一个热点。
5-BU引起的转换
➢ 从上图中，还可以看到5-BU的掺入引起的G┇C回复到 A׃T的过程。通过这两个图示，就很容易理解为什么同 一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变 的原因了。
也可以知道，为什么像5-BU这类代谢类似物只有对正 ➢ 在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止 细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作 用。
（六）紫外线对DNA的损伤及其修复
➢ 发现较早和研究得较深入的是紫外线（U.V.，ultraviolet ray）的作用。
➢ 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产 物主要是二聚体和水合物。其中了解较清楚的是胸腺嘧 啶二聚体的形成和消除。
➢ 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价 结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢 键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正 常配对，从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形 成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链 的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。
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实验名称：抗药性突变株的获取
和突变率测定
姓名：
学号：
系别：
实验日期：
同组同学名单:
本实验利用紫外线诱变，获得大肠杆菌的链霉素抗性突变株，学习了解微生物诱变育种的基本技术。
试验后，通过计算紫外照射造成的死亡率以及自发突变频率和诱导条件下突变频率，进一步加深对紫外诱导的认识。
【实验目的】
1.掌握获取细菌自发和经诱变产生的突变株的基本方法。
2.了解突变株频率和突变率的计算。
3.了解微生物诱变育种的基本技术。
4.
【实验材料】
1.菌种大肠杆菌（E. coli）
2.培养基及试剂牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、蒸馏水、链霉
素（母液10 mg/mL；终浓度10 µg/mL）。
3.仪器及用具三角瓶（300 mL）、9 cm培养皿、6 cm培养皿、离心管（1.5 mL）、恒
温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、大头针、涂布器、酒精灯
【实验方法及步骤】
（一）出发菌株培养液的制备
1. 取斜面或冻存菌种划平板，获得单克隆一个。
2. 取单克隆，37°C条件下在牛肉膏蛋白胨液体培养基培养8~24h；稀释培养液，
取102 ~103 个细菌个体转移到新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，过夜培养。
（二）培养基的制备
倒牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（非选择性培养基），以及含有链霉素的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（选择性培养基平板；链霉素终浓度10 µg/mL，在倒平
板前加入到培养基中）
（三）自发突变的测定
取过夜培养液，稀释106倍（用1.5mL离心管装0.99mL 无菌蒸馏水，将10 µL 培养液加入到0.99 mL蒸馏水，震荡或吹打混匀，连续三次），取100µL 涂布在非
100µL涂布在选择性培养基平板上。
（四）诱导突变以及测定
1. 紫外灯预热20 min。
2. 紫外照射：2 mL细菌培养液放入带有搅拌子的培养皿（6 cm），放置在紫外灯
下方的磁力搅拌器上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打
开皿盖，处理15s，盖上皿盖，关闭搅拌和紫外灯。
3. 测量处理后菌液中细菌总数（稀释106倍，在非选择性培养基平板上涂板）和
突变细菌数量（不稀释和稀释102倍的培养液在选择性选择性培养基平板上涂
板）。
（五）计数和计算
1. 平板培养24h后计数菌落数量。
2. 计算紫外照射造成的死亡率。
3. 计算自发突变频率和诱导条件下突变频率。
【实验结果】
培养24h后菌落数量
紫外照射造成的死亡率：20.47%
自发突变频率：74.8%
诱导条件下突变频率(认为无法计算)
实验结果分析】
1、本实验中紫外照射所造成的菌体死亡率较低，可能是由于照射时间不足,可以通过设计实验，分别用几个时间梯度长度去处理等量的菌，再统计其死亡率是否有差异,就可以验证是否是由于照射不足而引起死亡率低.。
2、观察到自发突变频率过高，不符合实际情况，原因可能是所使用的出发菌株在培养或者保存过程中，存在一定的问题，导致自发突变频率过高（有待证实）。
10 的
3、由于在实验过程中没有在牛肉膏固体加链霉素的培养基上涂布诱导后浓度为6
菌液，故认为无法计算。