QC-TY-2008 菌种鉴定标准操作规程
标准菌种确认标准操作规程范文
标准菌种确认标准操作规程一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三内容1.1 试验菌株大肠埃希菌(Escherichia coli )[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B)26003] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis )[CMCC(B)63501] 白色念珠菌(Candida albicans )[CMCC(F)64941]黑曲霉(Aspergillus niger ) [CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ) [CMCC(B)10104] 生抱梭菌(Clostridium sporogenes ) [CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.121 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.122 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要内容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽抱等特征应相似。
标准菌种确认标准操作规程
标准菌种确认标准操作规程一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三内容1.1 试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要内容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
微生物实验用菌种管理规程(含表格)
微生物实验用菌种管理规程（ISO13485-2016/YYT0287-2017）1.0目的规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2.0适用范围适用于微生物实验用菌种管理，包括菌种的申购、传代、使用及销毁等。
3.0引用/参考文件ChP2015实用药品微生物检验检测技术指南4.0职责质量控制实验室负责菌种的申购、传代、使用、销毁等工作，QA负责监控和参与OOS调查。
5.0程序5.1术语和定义5.1.1标准菌株由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌。
5.1.2传代菌株用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种，3代后的传代菌株在需要时可以作为工作菌株使用。
5.1.3工作菌株用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
5.1.4菌种的代将菌种接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
5.2菌种来源5.2.1标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（CMCC）或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌种。
5.2.2质量控制实验室涉及到的菌种种类、代码、保存方法及保存条件如下。
菌种名称菌种代码保存方法保存温度保存期限TSA斜面2～8℃1个月金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003冷冻干燥管-20℃1年TSA斜面2～8℃1个月铜绿假单胞菌CMCC(B)10104冷冻干燥管-20℃1年TSA斜面2～8℃1个月枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501冷冻干燥管-20℃1年SDA斜面2～8℃3个月白色念珠菌CMCC(F)98001冷冻干燥管-20℃1年SDA斜面2～8℃3个月黑曲霉菌CMCC(F)98003冷冻干燥管-20℃1年TSA斜面2～8℃1个月生孢梭菌CMCC(B)64941冷冻干燥管-20℃1年5.3菌种的申购、验收、保存5.3.1菌种的申购5.3.1.1微生物室QC依据菌种的库存及菌种的使用情况，提出采购申请，申请需明确菌种的名称，标准编号以及申购数量等信息。
标准菌株使用标准操作规程
标准菌株使用标准操作规程1 检验目的对实验室的标准菌株进行合理的保存，并规范合理的使用流程，保证菌株的性能稳定可靠。
2 范围微生物实验室保存的标准菌株。
3 职责微生物组工作人员正确执行本操作规程。
4 术语和定义4.1标准菌株其特征进行了分类和描述，有明确的来源。
ATCC（American Type Culture Collection）美国标准菌株收藏中心。
4.2标准储备菌株标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。
4.3 工作菌株标准储备菌株传代后得到的同种菌株。
4.4 标准培养物标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。
4.5质控菌株ATCC最佳，但当无法获得时可以使用ATCC演化的菌株或我国国家菌种库储存的标准菌株。
特殊情况，例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌株。
室间质评的菌株即可。
5 保存程序5.1标准菌株用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。
根据菌种的生长特点，接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。
酵母菌要求3天，形成孢子的微生物宜保存孢子。
5.2标准储备菌株成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。
相当于20%的甘油。
挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。
苛养菌可以适当增加菌量。
-80℃保存。
除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。
保存期限1-5年。
成分为脱纤维羊血。
挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。
苛养菌可以适当增加菌量。
-80℃保存。
主要用于保存链球菌、嗜血杆菌及厌氧菌。
保存期限1-5年。
5.3工作标准菌株由标准储备菌株传代得到的菌株。
标准储备菌株对多向下传三代。
过多的传种会增加变异的机会。
标准储备菌株根据菌种特点选择适宜的培养基和培养条件进行培养18-24h即工作标准菌株。
储存在2-8℃，可放四周。
个别营养要求高的为2周，例如肺炎链球菌和嗜血杆菌。
使用时应编号并登记。
5.4编号方法每个菌的保存管都要有唯一的编号，签字笔标注，便于查找和管理。
5.5记录管理5.5.1菌种应有严格的登记。
《菌种操作规程》PPT课件
将准备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内， 按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119～121℃， 保温30分钟，接种用具保温60分钟并填写《摇瓶配 制记录》和《培养基接种用具消毒记录》。
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4
孢子悬浮液的制备
将经过摇瓶考察指标符合要求对照的斜面孢 子，制成高浓度的孢子悬浮液，用无菌的毛 细吸管或注射器将菌液分装于安瓿管底部， 每管装0.3～0.5mL
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5
预冻及速冻
灌装好的安瓿管置2～5℃冰箱预冻1h，然后 置-30℃温度下速冻1h后取出，置真空干燥器 内。
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保藏
合格安瓿管置2～5℃冰箱保藏，保藏期为1～10年。
记录
安瓿管在保藏过程中应控制温度，每天查看温度并填写
《温度、湿度原始记录》，在使用过程中应填写《安瓿
管使用记录》。
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8
砂土管的制备
砂的处理
普通黄沙用稀酸（1N的HCL或H2SO4）或稀碱 （1NNaOH）浸泡12小时后,倒去酸水，用自来水充 分冲洗至PH中性，烘干后用磁铁吸去铁屑，经60目 筛过筛后备用。
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10
砂土孢子的制备
斜面孢子的选择及质量标准
取经选育的单菌落制备的大试管斜面孢子或生产良好的 茄氏瓶斜面孢子，具以下条件：孢子层生长丰满，较均 匀，孢子数量较多，少水，孢子呈淡黄色。斜面孢子一 般培养7～9天，孢子成熟。经无菌试验检查正常。发酵 摇瓶试验生产能力符合要求。
生产能力试验：
用10mL吸管吸取5mL孢悬液接种于母瓶，接种后塞上棉塞，包 扎纱布，置180～220转/分摇床上，28±1℃培养44～50小时左 右，待菌丝长好后取下，准备并瓶。
标准菌种确认标准操作规程
标准菌种确认标准操作规程一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三内容1.1 试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要内容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
菌种检定操作规程
菌种检定操作规程
《菌种检定操作规程》
一、目的
菌种检定操作规程旨在规范菌种检定过程，确保检定结果准确可靠，保障实验室菌种质量。
二、适用范围
本规程适用于各类实验室对菌种进行检定的操作。
三、设备和试剂
1. 必备设备：无菌工作台、培养箱、平板计数器等。
2. 必备试剂：琼脂培养基、生理盐水、甘油等。
四、菌种检定操作流程
1. 取样准备：将待检菌种进行悬浮液制备或直接取样，保证单一菌种在接种时的质量。
2. 培养基接种：将取样溶液均匀涂敷于琼脂培养基表面，将琼脂培养基放入培养箱进行培养。
3. 孵化：将接种后的琼脂培养基置于培养箱中，进行相应的温度和时间的培养。
4. 菌落计数：使用平板计数器对菌落进行计数，记录结果。
5. 结果分析：根据计数结果，对菌种进行鉴别和鉴定。
五、结果确认与报告
1. 只有经过两名以上实验人员的确认，结果方可出具。
2. 将检定结果填写在检定记录表上，并进行备份存储。
六、质量控制
1. 定期对实验室设备和试剂进行检验、校正。
2. 定期进行内部质量控制，对检定结果进行复核和比对。
七、附则
1. 对于异常情况的处理：出现异常结果时，要及时进行排查并记录处理过程。
2. 本规程未尽事宜，由实验室主管负责进行详细规定。
以上即为《菌种检定操作规程》的内容，希望各实验室严格按照此规程进行菌种检定工作，确保实验室菌种质量及检定结果的准确性。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
标准菌株验证鉴定步骤
1.1 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌标准菌株：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于营养琼脂平板上，36℃±1℃培养18-24 小时。
并观察菌落形态。
a. 金黄色葡萄球菌：菌落凸起，圆形，不透明；b. 大肠埃希氏菌：菌落稍凸，圆形，湿润，乳白色；c. 铜绿假单胞菌：菌落扁平，圆形，边缘不整齐，光滑湿润，可产生蓝绿或黄绿色素；d. 枯草芽孢杆菌: 表面粗糙不透明，镜检菌体有芽孢。
1.2白色念珠菌：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂培养基平板或PDA 琼脂平板上，30℃-35℃培养24-48 小时。
本菌细胞呈卵圆形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6 倍，革兰氏染色阳性，但着色不均匀。
黑曲霉：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂斜面培养基上，23℃-28℃培养48-96 小时。
菌丛呈黑褐色，粗糙。
1.2 生孢梭菌：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18-24 小时；或在厌氧条件下接种于哥伦比亚琼脂上，30℃～35℃厌氧培养18-24 小时。
2、菌种鉴定：2.1金黄色葡萄球菌：革兰氏染色试验：革兰氏阳性菌(紫色)，葡萄状排列，球菌。
兔血浆试验：接种1 个单菌落于1 支兔血浆溶液中，30℃-35℃培养至6 小时，每半小时观察一次。
凝固为阳性。
金黄色葡萄球菌为阳性反应。
2.2大肠埃希氏菌：革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色。
IMVC 生化试验：2.3铜绿假单胞菌：革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色A。
氧化酶试验：将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿，用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，涂在试纸上。
在60s 内变为蓝色或蓝紫色为阳性，不变色为阴性。
绿脓菌素试验：取斜面培养物接种于PDP 琼脂培养基斜面上，培养24 小时，加三氯甲烷3～5 ml 至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。
种子检查标准操作规程
1.目的：规范菌种检查过程，保持菌种活力稳定，不退化。
2.范围：适用于SM001菌种的检查。
3.职责：实验室人员对本操作规程的实施负责。
4.内容：4.1 种子分类4.1.1 种子分为原始种子、主种子、工作种子。
4.1.2原始种子用于传代培养主种子。
主种子用于制备工作种子。
工作种子用于发酵生产。
4.2 原始种子制备4.2.1 培养基准备4.2.1.1 培养基配制100ml 50*M：80ml 水，17.75g 磷酸氢二钠，17.0g 磷酸二氢钾，13.4g 氯化铵，3.55g 硫酸钠。
4℃存放两周内有效。
100ml 100*505：50g 甘油，57ml 水，5g 葡萄糖。
115℃单独灭菌20min，4℃存放两周内有效。
1000ml ZY：1000ml 水，10g 胰蛋白胨，5g 酵母粉100ml 1M MgSO(500X)： 87ml 水，24.65g 七水硫酸镁4终浓度：1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母粉，25mM 磷酸氢二钠，25mM 磷酸二氢钾，50mM氯化铵，5mM硫酸钠，2mM 硫酸镁，0.5% 葡萄糖，0.5% 甘油20ul，100*505 100ul，50*M 200ul 每10ml ZYM-505培养基加入ZY 9.68ml，1M MgSO4固体培养基：按照ZYM-505配置完成后，按照2%的加入量加入琼脂。
1000ml 50%甘油：500ml甘油，500ml水4.2.1.2灭菌100*505：115℃单独灭菌20min，培养基使用前加入培养基内混合使用,50*M混合后121℃灭菌20minZY,1M MgSO44.2.1.3 液培养基分装，然后做好液体培养基灭菌完成后，在超净工作台中加入卡那霉素、100*505和1M MgSO4标记4.3 检查4.3.1 培养从超低温冰箱中取出原始种子、主种子、工作种子各随机三支，置于-20℃预解冻30min，然后置于4℃解冻完全，待用。
在超净工作台中按照无菌操作流程，向做好标记的培养基中各接入一支菌种，做好标记。
菌种鉴定仪标准操作规程
菌种鉴定仪标准操作规程《菌种鉴定仪标准操作规程》一、前言菌种鉴定仪是一种用于快速鉴定微生物菌株的设备，广泛应用于医疗、食品、环境监测等领域。
为了保证鉴定结果的准确性和操作的规范性，制定本规程。
二、适用范围本规程适用于使用菌种鉴定仪进行微生物菌株鉴定的实验室及相关人员。
三、操作人员1. 操作人员应具备相关微生物鉴定的基本知识和实践经验。
2. 操作人员应经过培训，并取得相关操作资格证书。
四、仪器及试剂1. 菌种鉴定仪应符合国家标准，保证设备的正常运行。
2. 试剂应来自正规厂家，保证试剂的质量。
五、操作流程1. 准备待测菌株：将待测菌株培养于适宜的培养基上，保证菌株的纯度。
2. 设置菌种鉴定仪：根据待测菌株的品种和特性设置菌种鉴定仪的相应参数。
3. 载玻片制备：将待测菌株悬浮于载体上，进行薄膜制备。
4. 菌种鉴定：将载玻片放入菌种鉴定仪中进行快速鉴定。
5. 结果判读：根据仪器显示的结果进行判读，并与其他方法进行对比分析。
六、结果记录与报告1. 记录：对每次鉴定实验的结果进行详细记录，并按规定保存相关数据。
2. 报告：将鉴定结果进行整理，并向相关部门或客户提交鉴定报告。
七、设备维护和质控1. 设备维护：定期对菌种鉴定仪进行维护和保养，保证设备的正常运行。
2. 质控：定期进行质控实验，保证菌种鉴定的准确性和可靠性。
八、处罚与奖励1. 对违反本规程造成损失的个人或单位，将给予相应的处罚。
2. 对严格执行本规程并取得良好成绩的个人或单位，将给予相应的奖励。
九、附则1. 本规程由实验室管理者负责执行，并定期进行评估和更新。
2. 对本规程中未尽事宜，由实验室管理者负责解释和裁决。
十、生效日期本规程自颁布之日起生效。
标准菌种确认标准操作规程
标准菌种确认标准操作规程一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三内容1.1 试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要内容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
菌种操作规程
2021/8/15
• 配制称量时，一般将不溶或难溶物质 Nhomakorabea如酵母粉等 ）和易溶解物分开称，根据母瓶培养基配方称取所 需葡萄糖和酵母粉重量，葡萄糖用蒸馏水溶解，酵 母粉直接按配比分装于三角瓶内。
• 定容后用10N的NaOH调节PH至8.2～8.8，按每瓶 100mL的量分装于500mL直口三角瓶内，塞好棉塞 ，用双层纱布扎口后，再用牛皮纸扎口，放置在不 锈钢筐中，盖上牛皮纸，准备消毒。
2021/8/15
发酵摇瓶接种操作
• 发酵摇瓶接种由两人操作，一人为主操作子斜面， 一人为辅操作摇瓶，主操作用接种铲取孢子于茄氏 瓶中，一支铲子只能用于一只子斜面，将3～5支子 斜面的孢子接入装有80mL无菌水的带玻璃珠三角瓶 中，放置摇床上摇10～15分钟制成
• 接种后将摇瓶瓶口纱布扯平扎紧，置180～220转/ 分摇床上，28℃±1℃湿度50%～ 70%的条件培养 11天后，下摇瓶测生物量、总油和AA的含量并填写 《原材料摇瓶考察结果记录》。
套、白工作服和帽，再准备好工业酒精、火焰圈和 打火机。 • 接种人员穿好衣服后，一人将浸泡工业酒精的火焰 圈套在小罐接种口上，一人拆开种瓶包扎的牛皮纸 和纱布，待消毒人员通知后点燃火焰圈，燃烧一分 钟左右，当接种帽旋下后，在火焰圈内迅速打开种 瓶棉塞，将种液倾倒入小罐内，残余种液在超净台 接种肉汤培养基，作无菌监测，接种完毕后填写《 种瓶生产进罐记录》和《培养基接种用具消毒记录 》。
• 定容后用10N的NaOH调节PH至8.2～8.8，按每瓶 100mL的量分装于500mL翻口三角瓶内，塞好专用 夹心纱布，用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐中，盖 上牛皮纸，准备消毒。
• 将准备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内， 按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119～121℃， 保温30分钟，接种用具保温60分钟并填写《摇瓶配 制记录》和《培养基接种用具消毒记录》。
菌种验证操作规程
菌种验证操作规程1.目的为菌种验证试验提供作业指导，保证菌种的纯度和良好生长力，保持其生物特性的稳定。
保证实验结果的可靠性和准确性。
2.适用范围本规范适用于新购买菌种及本中心所保藏菌种传代保种的验证试验。
3.职责3.1微生物检验室主管负责监督实施本操作规程。
3.2微生物室检验人员严格按该验证方法进行菌种的验证。
4.菌种确认试验主要内容4.1菌种的纯度确认4.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
4.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
4.2 菌种的特性确认4.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。
4.2.2 菌种的确定方法用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。
再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。
4.3根据不同菌种的生理生化特性做相应的鉴定试验，参照依据见下表。
5.菌种存活率验证将需要验证的菌种同时接种多个斜面，观察菌种的是否存活，然后进行记录，计算。
接种的斜面管总数－未存活的斜面数量/接种的斜面管总数·100％＝存活率6.相关记录菌种验证试验记录编制人：校核人：批准人：。
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目的：建立菌种鉴定标准操作规程
范围：适用于质量控制部菌种鉴定标准操作
职责：质量控制部
内容：
1整体操作步骤
1.1纯化、分离待鉴定菌
用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色
2.1染色剂的配制
2.1.1结晶紫染色液：
甲液：结晶紫 1.0g
95%的酒精20ml
乙液：草酸铵0.8g
水80ml
将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
水300ml
配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:
碱性品红 1.0g
石碳酸 5.0ml
95%乙醇10.0ml
配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:
2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
2.2.2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～3次，以固定涂片。
2.2.3染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本，
染色1分钟。
2.2.4水洗：斜置玻片使很细水流的纯化水从染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止。
2.2.5滴加碘液冲去残水并媒染约1分钟，用纯化水冲去碘液吸干。
2.2.6滴加95%的乙醇脱色约20～30秒，脱色时应将玻片微振动，使酒精分布均匀，立即用水冲净。
2.2.7稀石碳酸红溶液染色1分钟后，用水洗净晾干或吸干。
2.2.8镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100倍物镜观察细菌革兰氏属性。
革兰氏阳性菌染色成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成红色，同时做阳性对照。
3简单染色
3.1用于真菌与细菌的鉴别。
3.2操作:
3.2.1 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
3.2.2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～3次，以固定涂片。
3.2.3染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本，染色1分钟。
3.2.4水洗：斜置玻片使很细水流的自来水从染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止，自然晾干或吸干。
3.2.5镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100倍物镜观察菌体形态。
4 3%氢氧化钾试验
4.1材料
3%KOH溶液（W/V）、无菌木质牙签、待检菌的新鲜纯培养物（18～24小时）。
4.2操作
4.2.1在一洁净的载玻片上等距离滴上3滴3%KOH水溶液。
4.2.2用铜绿假单胞菌或具有等同反应的菌种作为阳性对照。
4.2.3用枯草芽胞杆菌或具有等同反应的菌株作为阴性对照。
4.2.4用木质牙签从培养基上分别挑取阳性，阴性和待检菌的新鲜纯培养物（18～
24小时）于载玻片上的3滴KOH水溶液中。
4.2.5然后用牙签快速环形搅动30～60秒后，轻轻地向外拉该菌悬液，如果是革兰阴性细菌，在菌悬液和牙签之间有黏丝出现，如果是革兰阳性细菌则无黏丝出现。
4.2.6结果判断
4.2.6.1如果在15秒钟之内溶液的黏性增强并有黏丝形成，则认为该试验菌株的氢氧化钾呈阳性，试验菌株为G-。
4.2.6.2如果溶液不产生粘丝，则试验菌株被判断为氢氧化钾试验阴性，试验菌株为G+。
4.2.6.3当阳性和阴性试验结果均为典型反应时，该实验才有效。
5 触酶试验（过氧化氢酶试验）
5.1细菌代谢产生的过氧化氢对细菌细胞具有毒副作用，而细胞内的接触酶能催化过氧化氢，将其分解为分子态氧，使其解毒。
向含有接触酶的细菌培养物滴加过氧化氢溶液后即产生大量气泡（阳性）。
5.1材料
3%过氧化氢溶液、无菌木质牙签、洁净载玻片、滴管。
5.2操作
5.2.1用无菌木质牙签挑取新鲜待检菌的纯菌苔置于洁净的载玻片上。
5.2.2向玻片上的菌落滴加3%过氧化氢溶液一滴；或于琼脂培养物上直接滴加3%过氧化氢溶液试液。
5.2.3结果判断：立即观察结果，产生气泡为阳性反应，不产生气泡者为阴性反应。
用金黄色葡萄球菌或具等同性质的菌种重复以上步骤作为阳性对照，并用铜绿假单胞菌或具等同性质的菌种作为阴性对照。
5.2.4注意事项
5.2.4.1阴性控制和阳性控制必须为典型反应时，该实验才有效。
5.2.4.2当将过氧化氢溶液加到生长于血琼脂平板上的菌落时会产生假阳性结果（因为红细胞中含有过氧化氢酶）。
5.2.4.3必须将过氧化氢酶溶液滴到菌落上，操作顺序不能颠倒，否则会产生假阳
性结果。
5.2.4.4不要用铂金类接种针或接种环去混合培养物和过氧化氢酶水溶液，因为接种针的铂金可以会引起假阳性结果。
因此在这个试验中，应用木质无菌牙签或是塑料类无菌接种环。
6葡萄糖氧化/发酵试验
6.1 氧化发酵培养基中含有较低浓度蛋白胨和较高浓度碳水化合物，待检细菌通过氧化或发酵利用葡萄糖产酸，使其pH值下降，培养基中的指示剂由绿色变成黄色。
6.1材料
6.1.1无菌矿物油：液体石蜡121℃半小时高压蒸汽灭菌。
6.1.2氧化发酵培养基：葡萄糖10g，胰蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，琼脂4g，溴麝香酚蓝0.08g，去离子水1000ml，pH6.6-
7.0。
分装于13×100mm小试管中，121℃灭菌15分钟。
竖直放置待其凝固后使用。
6.2操作
6.2.1打开小试管。
6.2.2用接种针挑取分离的单个纯菌落，刺入氧化发酵培养基约1cm深，分别接种两个试管。
6.2.3向其中一只试管内加入无菌矿物油，覆盖在培养基表面约1cm高，作为发酵管（OF/F）；另一支不加矿物油作为氧化管（OF/O）。
6.2.4以同样的方法在试管中接种大肠埃希菌或者是等同菌株作为阳性对照，接种铜绿假单胞菌或者是类同菌株作阳性对照。
6.3培养：将接种后的发酵培养基放入35～37℃的培养箱中培养24小时后观察结果，若结果呈阴性，则继续培养24小时。
6.4结果判断
6.4.1培养基变为黄色，反应结果记为阳性。
6.4.2培养基仍保持均匀的绿色，反应结果记为阴性。
6.4.3如果培养基的颜色由绿色变为蓝色，是由微生物产碱反应所致，记为阴性。
7 细胞色素氧化酶试验
细胞色素氧化酶是一种铁卟啉类的酶，它将还原的细胞色素C氧化后以非活性的还原态存在。
而还原的细胞色素氧化酶因将电子传递给分子氧而又变成活性态。
在分子氧的存在下，细胞色素氧化酶和细胞色素C系统能还原一系列有机物。
其中，它将指示条反应区的α–萘酚和二甲基对苯二胺还原，会形成吲哚酚蓝分子，通过这一反应将细菌进行分类和鉴别。
7.1材料
细胞色素氧化酶检测指示条,指示条反应区的主要成分：二甲基对苯二胺0.1μmol、α-奈酚1.0μmol。
7.2操作
7.2.1用牙签从培养基上挑取生长良好的单一菌落（菌落的pH值不得低于6.0，否则会出现假阴性结果）。
7.2.2将菌落均匀涂在反应带上，过20～60秒后，比较反应带的颜色。
7.2.3若反应带变为紫到深紫色则为阳性反应，不变色或黄色为阴性反应。
8 基于系统发育分析的16S rDNA序列测定与比对
8.1当药品无菌检查阳性或培养基灌装试验阳性时，需对基污染菌及与该污染菌相似的菌种进行分子水平上的菌种鉴定。
该类样品则其中送往测序公司进行序列测定。
9 洁净区环境控制-微生物鉴定表
附件：
附录1 菌种鉴定标准操作规程流程图相关文件与记录：
无
培训范围：
质量控制部全体人员
参考文献：
无
编制历史与变更原因：
附录1 菌种鉴定标准操作规程流程图。