荧光光谱的原理及应用

• 发射波长：固定激发光的波长而不断改变荧光的测定波
长并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长 的谱图则为荧光的发射波长。750000
Ex 463 nm
Em 530 nm
500000
Intensity
图 荧光染料C-540A 的激发和发射光谱
250000
0
400
500
600
700
Wavelength / nm
基本概念
• 定义：
当一个荧光分子（又称为供体分子，Donor）的荧光光谱 与另一个荧光分子（又称为受体分子，Acceptor） 的激发 光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发 出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
• FRET现象的特征:
选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光
基本概念
• 测试方法：
1)判断激发波长：①根据分子结构判断；②参照吸收光谱； ③三维扫描
2)以判断的波长为激发，做发射扫描，可以得到发射波长 3)利用得到的发射波长，进行激发扫描，即可得到激发波长
• 强度：
比尔-朗伯定律 If=2.303YfI0εb c
• 应用：定性和定量
荧光波长和强度与结构的关系
• ①溶剂极性可增加 或降低荧光强度； ②与溶剂作用从而 改变荧光物质结构 来增加或降低荧光 强度。
溶剂
温度
• 温度升高，荧光强 度下降(因为内、 外转换增加、粘度 或“刚性”降低)。
•具酸或碱性基团的 有机物，在不同 pH 值时，其结构可能发 生变化，因而荧光强 度将发生改变
pH值
内滤光 和自吸
•体系内存在可以吸收荧光 的物质，或荧光物质的荧 光短波长与激发光长波长 有重叠，称为内滤光；荧 光物质浓度较大，吸收自 身的荧光发射，称为荧光 自吸。
FRET需要条件
• 供体分子的发射光谱和受体分子的 吸收光谱必须有显著的重迭，一般 大于 30％；
• 供体分子和受体分子间的距离必须 在 1-10 nm 之间.D和A间的FRET 效率：
R0: E=50%时供体和受体分子间的 距离 对于特定的供体受体对是常数; R: 供体和受体分子间的距离. E: FRET效率. 对于R特别灵敏
• 测试方法：
①参比法 Yu=YS·(Fu/Fs)·(As/Au ) ·(nu/ns)(A<0.05)；②直接测 量法，要求仪器有积分球
• 注意事项：
温度，溶剂，激发波长，浓度
• 应用：
量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系 间跨越、外转移和内转移等的相对速率
常用物质的量子产率
Q.Y. Standards
Stocks shift
发射光谱的形状 与激发波长无关
荧光的光谱特性
荧光特 性参数
稳态
瞬态
波长和 强度
偏振性 能
量子产 率
荧光寿 命
磷光
磷光寿 命
磷光光 谱
波长和强度
基本概念
• 激发波长：固定荧光的发射波长而不断改变激发光的波
长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波 长的谱图称为荧光的激发光谱。
有序介质的影响(表面活性剂)
CMC
Intensity
1500000
1000000
500000
0 350
0.0001 0.0005 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5 1 mg/ml
400
450
Wavelength (nm)
荧光量子产率
基本概念
• 定义：
荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光 的光子数之比值.(Y)
荧光光谱的原理及其在分子自组 装中的应用
郑永丽 上海交通大学化学化工学院
20131115
主要内容
• 概述 • 荧光光谱法原理 • 荧光的光谱特性 • 我们有关荧光的工作
概述
基本概念
• 能级: 现代量子物理学认为原子的可能状态是不连续的， 因此各状态对应能量也是不连续的。这些能量值就是能级
• 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级 回到基态所发出的辐射。
[nm]
4
PBS
540
27
PBS
620
53
Methol
580
Baidu Nhomakorabea
95
0.1M NaOH, 220C
496
97
Cyclohexane
300
58
0.1 M H2SO4, 220C
350
100
Ethanol
450
95
Water
488
31
Water
514
13
Water, 200C
280
14
Water
270
荧光偏振
• ①跃迁类型（pi->pi*荧光比较强，即有双键的物质荧光强） • ②共轭效应（共轭体系是pi电子更容易被激发，荧光强） • ③刚性平面结构（有这种结构的分子可以减小分子的振动，碰撞失活
可能性小，荧光强） • ④取代基效应（给电子基团，荧光增强；吸电子基团，荧光减弱甚至
猝灭）
荧光强度与环境因素的关系
基本概念
• 定义： • 测量：
①L-型或者单通道法 ②T-型多通道法
• 应用：
流动性,分子基本性质,酶学 分子相互作用,荧光偏振免疫,成像
• 常用偏振研究的荧光分子：
1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)；罗丹明B；2-苯胺基-6-萘 磺酸钠(2,6-ANS)
荧光共振能量转移(FRET)
• 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出 的辐射。
• 分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )：又 称为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强 度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光 光谱的形状和荧光峰对应的波长进行的定性分析．
Cy3 Cy5 Cresyl Violet Fluorescein popop Quinine sulfate Rhodamine 101 Rhodamine 6G Rhodamine B Tryptophan L-Tyrosine
Q.Y.
Conditions for
Excitation
[%]
Measurement
荧光分析法的特点
• 灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1-3个数量级； • 选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸
收的分子不一定发射荧光或磷光； • 试样用量少和方法简便 • 能提供比吸收光谱多的物理参数 • 应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发
荧光。
荧光光谱法原理
荧光和磷光的产生
吸收光谱与发射 光谱镜像关系
• 供体分子的发射态偶极矩与受体分 子的吸收态偶极矩、以及它们的向 量必须满足一定的条件