免疫学实验——淋巴细胞功能检测
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淋巴细胞功能检测
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之(从影响淋巴细胞功能、
T淋巴细胞增殖的角度考虑) .
淋巴细胞功能检测
•T细胞增殖（转化）实验 •绵羊红细胞玫瑰花环试验 •B细胞产生抗体能力的测定 •细胞因子的检测
T细胞增殖（转化）实验
原理：T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，在 24~48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如 细胞变化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由 淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞 转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。
(1) 非抗原性刺激物：如植物血凝素(PHA)、刀豆素 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、脂多糖(LPS)，通称促有丝 分裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞， PHA和ConA刺激T细胞增殖。 (2) 抗原性刺激物：如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤 风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗 原等。
3.500转/分离心5分钟，放4℃冰箱中2小时后， 弃大部分上清。 4. 染色及观察 轻轻悬浮沉积的细胞。向悬液中滴一滴美蓝 液，混合，10分钟后取一滴放载玻片上，加 盖玻片镜检。 高倍镜或油镜下计数200个淋巴细胞,凡结合3 个或3个以上的绵羊红细胞者为阳性，计算 花环形成细胞的百分率。正常值65%左右。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISPOT法
原理：ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验，可用于测定产 生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被固相，然后 加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与板上的 抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代 表一个产生抗体的细胞。
方法
1.抗原包被: 37C° 2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯 平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 2.抗体生成细胞培育:加入适量抗体生成细胞，37C°, 5%CO. ，3~4h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。 3.测定斑点产生细胞:加二抗，37C° ，5%CO.2，2~3h。加辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。 4计数: 24h后用10~30倍显微镜下计数斑点形成细胞。
方法
(以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例）
1.分离PBMC和APC,APC用丝裂霉素或放射性核素处理。 2.96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。 3.每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别 为0、1、5、10和20ug/ml。每一种浓度设三复本。 4.37℃，5%CO2，6天。 5.加3HTdR,继续培养18小时。计数。
人T淋巴细胞的测定
绵羊红细胞玫瑰花环Fra Baidu bibliotek验
原理:玫瑰花环试验，又称为花结试验。是测定淋巴细胞数量和功 能的一种方法。
人类T和B淋巴细胞表面具有不同的受体。由于人类T淋巴细胞表面 具有与绵羊红细胞结合的受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形 成E花环，因此，T细胞也成为红细胞花瓣形成细胞。根据E-玫瑰花 环形成率， 可以间接判断机体细胞免疫力。目前，已广泛应用于临 床，作为测定人群免疫状态的一个指标。
方法与结果: 1.淋巴细胞提取 (1)取人抗凝血2毫升，加2毫升Hanks液使之稀释。 加于2毫升淋巴细胞分层液液面之上(沿管壁轻轻 加人，勿使两液相混)。 (2) 2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另试 管中加5倍体积的 Hanks液洗1一2次，(1500转/分 离心10分钟)弃上清即成 2.加吸收过的胎牛血清0.1毫升，0.5%绵羊红细胞悬 液0.2毫升，于淋巴细胞中。混合后，37℃水浴5 分钟。
Thanks For watching
材料: 1.肝素(100单位/毫升)、 淋巴细胞分层液人 的正常血液 2.0.5%绵羊红细胞悬液(用Hanks液配制), Hanks 液 3.吸收过的胎牛血清:取经56℃30分钟加热灭 活后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后， 37℃水浴20分钟，2000转/分离心10分钟， 取上清液即成。 4. 灭菌注射器，针头，试管，吸管等。
细胞因子生物学活性检测和浓度测定
1．细胞增殖法 细胞因子具有细胞生长因子活性，筛选，建立只依赖于某种因子的细胞系， 这些细胞系在通常情况下不能存活，加入特定因子后才能增殖。通过测定 细胞增殖情况（如使用3h-tdr掺入法、MTT法等）鉴定细胞因子的含量。 2．靶细胞杀伤法 是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。 3．细胞因子诱导的产物分析法 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，通过测定所诱生的相应 产物，可反映细胞因子的活性。
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之(从影响淋巴细胞功能、
T淋巴细胞增殖的角度考虑) .
淋巴细胞功能检测
•T细胞增殖（转化）实验 •绵羊红细胞玫瑰花环试验 •B细胞产生抗体能力的测定 •细胞因子的检测
T细胞增殖（转化）实验
原理：T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，在 24~48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如 细胞变化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由 淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞 转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。
(1) 非抗原性刺激物：如植物血凝素(PHA)、刀豆素 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、脂多糖(LPS)，通称促有丝 分裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞， PHA和ConA刺激T细胞增殖。 (2) 抗原性刺激物：如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤 风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗 原等。
3.500转/分离心5分钟，放4℃冰箱中2小时后， 弃大部分上清。 4. 染色及观察 轻轻悬浮沉积的细胞。向悬液中滴一滴美蓝 液，混合，10分钟后取一滴放载玻片上，加 盖玻片镜检。 高倍镜或油镜下计数200个淋巴细胞,凡结合3 个或3个以上的绵羊红细胞者为阳性，计算 花环形成细胞的百分率。正常值65%左右。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISPOT法
原理：ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验，可用于测定产 生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被固相，然后 加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与板上的 抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代 表一个产生抗体的细胞。
方法
1.抗原包被: 37C° 2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯 平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 2.抗体生成细胞培育:加入适量抗体生成细胞，37C°, 5%CO. ，3~4h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。 3.测定斑点产生细胞:加二抗，37C° ，5%CO.2，2~3h。加辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。 4计数: 24h后用10~30倍显微镜下计数斑点形成细胞。
方法
(以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例）
1.分离PBMC和APC,APC用丝裂霉素或放射性核素处理。 2.96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。 3.每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别 为0、1、5、10和20ug/ml。每一种浓度设三复本。 4.37℃，5%CO2，6天。 5.加3HTdR,继续培养18小时。计数。
人T淋巴细胞的测定
绵羊红细胞玫瑰花环Fra Baidu bibliotek验
原理:玫瑰花环试验，又称为花结试验。是测定淋巴细胞数量和功 能的一种方法。
人类T和B淋巴细胞表面具有不同的受体。由于人类T淋巴细胞表面 具有与绵羊红细胞结合的受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形 成E花环，因此，T细胞也成为红细胞花瓣形成细胞。根据E-玫瑰花 环形成率， 可以间接判断机体细胞免疫力。目前，已广泛应用于临 床，作为测定人群免疫状态的一个指标。
方法与结果: 1.淋巴细胞提取 (1)取人抗凝血2毫升，加2毫升Hanks液使之稀释。 加于2毫升淋巴细胞分层液液面之上(沿管壁轻轻 加人，勿使两液相混)。 (2) 2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另试 管中加5倍体积的 Hanks液洗1一2次，(1500转/分 离心10分钟)弃上清即成 2.加吸收过的胎牛血清0.1毫升，0.5%绵羊红细胞悬 液0.2毫升，于淋巴细胞中。混合后，37℃水浴5 分钟。
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材料: 1.肝素(100单位/毫升)、 淋巴细胞分层液人 的正常血液 2.0.5%绵羊红细胞悬液(用Hanks液配制), Hanks 液 3.吸收过的胎牛血清:取经56℃30分钟加热灭 活后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后， 37℃水浴20分钟，2000转/分离心10分钟， 取上清液即成。 4. 灭菌注射器，针头，试管，吸管等。
细胞因子生物学活性检测和浓度测定
1．细胞增殖法 细胞因子具有细胞生长因子活性，筛选，建立只依赖于某种因子的细胞系， 这些细胞系在通常情况下不能存活，加入特定因子后才能增殖。通过测定 细胞增殖情况（如使用3h-tdr掺入法、MTT法等）鉴定细胞因子的含量。 2．靶细胞杀伤法 是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。 3．细胞因子诱导的产物分析法 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，通过测定所诱生的相应 产物，可反映细胞因子的活性。