免疫学实验——淋巴细胞功能检测
医学检验技术：免疫检验公式大全
医学检验技术：免疫检验公式大全
免疫学是检验考试中的必考项。
今天就重点讲一下免疫学检验公式大全。
1.外周血单个核细胞分离的实验中，为分离单个核细胞，常常要利用一种比重在075-1.090之间的介质，使得单个核细胞与其他血细胞分离。
为了加快沉浮速度，一般还要做离心分离，这时细胞在介质中的沉降速度用以下公式表示：
沉降速度=2r2(Q-Q0)g/g
其中r为细胞半径，Q为细胞比重，Q0为介质比重，g为离心力，为细胞与等体积标准颗粒的摩擦系数的比值，为介质的黏度。
2.淋巴细胞的功能检测中，需要检测转化为淋巴母细胞的淋巴细胞比例，即淋巴细胞的增殖实验。
转化后的淋巴细胞，可表现为细胞变大，胞质空泡，核仁明显等，即成为淋巴母细胞。
该实验中，转化率可以这样表示：转化率=转化的淋巴细胞数/未转化的淋巴细胞数100%
3.在检测中性粒细胞的杀菌实验中，我们需要检测杀菌率。
杀菌率的检测方法常用显微镜法和溶菌法。
前者将白细胞与葡萄球菌混合，碱性美兰染色后在油镜下观察吞噬细菌的白细胞数：杀菌率=胞内含有染菌体的细胞数/吞噬细菌的白细胞数100%
4后者将白细胞悬液和经人血调理过后的细菌混合后，隔一段时间取定量培养物，接种固体培养基培养，37℃培养18小时后计算生长菌落数。
杀菌率=[1-(作用30min或60min后的菌落数/0min 菌落数)] 100%
4.巨噬细胞的功能检测中，常用吞噬鸡红细胞实验来衡量其吞噬功能，有此公式：吞噬率=吞噬CRBC的巨噬细胞数/200 100%。
人外周血淋巴细胞分离、计数、活力测定临床免疫学实验报告
实验温度：18℃湿度：32% 实验时间：2012年11月8日实验八、人外周血淋巴细胞分离、计数、活力测定【实验目的】1.通过该实验掌握外周血淋巴细胞分离、计数的方法。
2.有助于观察机体免疫状态。
【实验原理】人外周血RBC、粒细胞比重为：1.092，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，比重为1.075，因此选用一种比重介于二者之间而近于等渗的淋巴细胞分离液（比重为1.077±0.001）进行密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出单个核细胞（淋巴细胞）。
【实验材料】1．肝素溶液用生理盐水将肝素配成125～250 U/ml的溶液，置4℃下保存备用。
2．淋巴细胞分层液市售或自配，20℃时密度应为(1.077±0.001)g/L。
3．Hanks液pH 7.2～7.4。
4．完全RPMI-1640培养液。
5．15 ml或50 ml锥底离心管。
6．水平离心机，显微镜。
7．玻璃吸管，滴管，细胞计数板等。
8．2％台盼蓝染液。
【实验步骤】1.采集静脉血3ml，注入盛有肝素的无菌小瓶中（每ml全血加0.1 ml 肝素溶液），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2.用吸管加入等量Hanks液，使血液等倍稀释。
3.吸取淋巴细胞分离液2ml置于离心管中，然后将上述稀释血液在距分离液界面上1cm处沿试管壁缓慢叠加至分离液表面。
应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。
4.将离心管置水平式离心机内，在18～20℃下，以2000 r/min离心20min，离心后，管内分层如下图所示5.用毛细吸管轻轻插入灰白细胞层，沿管壁轻轻吸出该层单个核细胞，转入另一支离心管中。
6.将所得到的单个核细胞悬液用5倍体积的HanK’s洗涤2次，每次以1500 r/min 离心10 min，弃上清。
7.混悬细胞，沉淀加1640培养液1ml，摇匀。
8.计数细胞：取0.1ml细胞悬液，加WBC稀释液0.9ml，混匀，静止片刻，冲池，低倍镜下计数四大格细胞总数。
临床免疫学检验项目
临床免疫学检验项目一、引言临床免疫学检验项目是通过检测人体免疫系统的功能和免疫相关指标，以辅助临床诊断和监测疾病进展的一种重要实验室检查方法。
免疫学检验项目广泛应用于各个领域，包括感染病、自身免疫病、肿瘤、器官移植、过敏性疾病等。
二、常见的临床免疫学检验项目1. 免疫球蛋白检测免疫球蛋白（Immunoglobulins，Ig）是人体内最重要的抗体，可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等不同类型。
通过检测免疫球蛋白的水平，可以评估人体免疫系统的功能状态，判断是否存在免疫缺陷或免疫异常。
2. 细胞免疫功能检测细胞免疫功能检测主要包括淋巴细胞亚群分析、细胞因子检测和免疫细胞功能评价等。
淋巴细胞亚群分析可通过检测CD4+和CD8+T 细胞的比例，评估免疫系统对感染和疾病的应答能力。
细胞因子检测可以检测IL-2、IL-6、IFN-γ等细胞因子的水平，用于评估炎症反应和免疫调节功能。
免疫细胞功能评价可以通过检测免疫细胞的增殖、杀伤力和吞噬功能等指标，评估免疫细胞的功能状态。
3. 自身抗体检测自身抗体是指机体免疫系统异常产生的针对自身组织或器官的抗体。
自身抗体检测可以帮助诊断自身免疫病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。
常见的自身抗体检测项目包括抗核抗体（ANA）、类风湿因子（RF）、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCAs）等。
4. 过敏原检测过敏原检测是通过检测人体对特定过敏原的免疫反应，帮助诊断和治疗过敏性疾病。
常见的过敏原检测方法有皮肤划痕试验、血清特异IgE抗体检测和免疫球蛋白E（IgE）介导的组织释放试验等。
5. 肿瘤标志物检测肿瘤标志物检测是通过检测体液或血清中特定蛋白质的水平变化，辅助肿瘤的早期诊断、疾病进展监测和预后评估。
常见的肿瘤标志物检测项目包括癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）、甲胎蛋白（AFP）等。
三、临床意义和应用临床免疫学检验项目在临床诊断和治疗中具有重要意义。
通过对免疫学指标的检测，可以辅助诊断免疫缺陷病、自身免疫病、感染病等，并评估疾病的严重程度和预后情况。
医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
健康评估淋巴实验报告
健康评估淋巴实验报告引言淋巴系统是人体重要的免疫系统之一，由淋巴管、淋巴结、脾脏、扁桃体等组成。
淋巴系统的健康状况对人体免疫功能起着重要的作用。
本次实验旨在通过淋巴细胞计数，对参与者的淋巴系统进行评估，进一步了解其免疫状况。
实验方法实验器材- 带有记数室的显微镜- 尼尔霍夫涂片- 淋巴细胞计数液（酸性染色剂）实验步骤1. 参与者取一小滴鲜血于无菌试管中；2. 向试管中加入1滴淋巴细胞计数液，混匀；3. 将混合溶液滴于尼尔霍夫涂片上，并用盖玻片覆盖；4. 将尼尔霍夫涂片放置显微镜台上；5. 在400倍放大倍率下观察尼尔霍夫涂片中的淋巴细胞数量，并记录。
实验结果本次实验共有20名参与者，他们的淋巴细胞计数结果如下所示：参与者编号淋巴细胞计数-1 13002 15003 12004 14005 16006 11007 17008 18009 190010 170011 130012 140013 200014 120015 180016 160017 190018 150019 110020 1200实验分析根据实验结果，我们可以得出以下分析：1. 淋巴细胞计数在不同参与者之间有一定的差异，范围从1100到2000不等。
这表明不同个体的淋巴系统健康状况存在差异。
2. 平均淋巴细胞计数为1500，中位数为1450。
这表明参与者的平均淋巴细胞水平正常。
3. 大部分参与者的淋巴细胞计数在1200到1700之间，符合健康范围。
4. 少数参与者的淋巴细胞计数高于1700，属于较高水平，需要进一步观察其免疫系统的状况。
结论本次淋巴实验评估结果显示大部分参与者的淋巴细胞计数处于健康范围内。
然而，仍然有少数参与者的淋巴细胞计数较高，可能存在免疫系统的异常情况。
进一步评估这些参与者的淋巴系统功能、抗体水平等是必要的。
淋巴细胞计数是一种简单而有效的评估淋巴系统健康的方法。
希望通过实验数据的分析和进一步研究，能够更深入地了解淋巴系统与人体健康之间的关系，为免疫疾病的预防和治疗提供有力的依据。
免疫学实验方案设计——证明某产品具有免疫增强作用(从淋巴细胞数目及活性的角度考虑)
免疫细胞的计数
1. 直接计数 2. 检测细胞表面特征性标记分子 膜表面分子免疫荧光检测法 流式细胞分析法 免疫细胞化学法 抗体致敏细胞花环法 3. 检测细胞特定功能（微量细胞毒试验、细胞因子检测）
直接计数
细胞计数
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
细胞计数并检测活性
用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul台盼蓝液混合
单次密度梯度分离法 单一密度 连续密度梯度
血浆
PBMC 分离液 多形核白细胞 红细胞
取PBMC
玻璃平皿
单核细胞吸附； 未吸附的为淋巴细胞
淋巴细胞及其亚群的分离
✓尼 龙 毛 分 离 法 ✓E 花 环 沉 降 法 （ 课 本 内 容 ） ✓免 疫 吸 附 分 离 法 ✓磁 珠 分 离 法 ( I M B ) ✓流 式 细 胞 术 ( F C M ) ✓抗 原 肽 - M H C 分 子 四 聚 体 技 术
• 免疫细胞的种类：
淋巴细胞：T细胞、B细胞、NK细胞 单核/巨噬细胞、树突状细胞、中心粒细胞
• 免疫细胞的分布：
• 外周血 • 免疫器官： • 组织
胸腺、骨髓 脾脏、淋巴结 粘膜相关淋巴组织
4
免疫细胞检测
免疫细胞数量与功能检测是判断机体免疫功能状态的重要指标
• 免疫细胞及亚群的分离、鉴定与计数 • 单核-吞噬细胞功能测定 • T淋巴细胞功能测定 • B淋巴细胞功能测定 • NK细胞功能测定 • 其他免疫细胞功能测定
取10ul于细胞计数板上 镜检
死细胞染成蓝色，活细胞不着色
Thank you!
磁珠分离法
• 在磁珠表面包被具免疫 反应性的抗体进行抗原 抗体反应，在细胞表面 形成玫瑰花结
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
免疫学实验设计——证实一产品有免疫增强作用(从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度考虑)
实验操作
(三)方法与结果: 1.淋巴细胞提取 (1)取人抗凝血3毫升，分成3份编号1.2.3，向2.3号中加入适量药品，向1.2.3中
分别加入1毫升Hanks液使之稀释。分别加于1毫升淋巴细胞分层液液面之上 (沿管壁轻轻加入，勿使两液相混)。 (2) 2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另试管中加 5倍体积的Hanks液洗 1~2次，(1500转/分离心 10分钟)弃上 清即成。
材料
1、主要材料: 消毒肝素抗凝管(内含肝素10~20单位) 、注射器、微量加样器、
微量细胞培养板、49型玻璃纤维滤膜、离心机、细胞培养箱、 干燥箱、多头细胞收集器， FJ-2107液体闪烁计数仪。 2、主要试剂 完全RPMI-1640培养液(内含 15% FCS, 25mM Hepes, 5x102 mM= 巯基乙醇), 植物血凝素 (PHA，用完全RPMI- 1 640配成浓 度为30 ug/ml) ; H-TdR.工作液18.5KBq/20ul (中国原子能研 究院b同位素所)。 闪烁液(二甲苯1000 ml,ppo 7 g,popop0.5g) 。
证实一产品有免疫增强作用
（从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度考虑）
从T细胞功能的角度考虑
3H-TdR渗入法检测淋巴细胞转化率
实验原理：
胸腺嘧啶核苷(TdR) 是DNA合成的前身物。人外周血T淋巴细胞 在PHA刺激下发生母细胞转化而增殖，处于S期的细胞不断地摄 取TdR用以合成DNA。与此同时，H-TdR也不断地被摄入细胞内 而被放射性标记。通过液体闪烁计数测量方法，便可了解淋巴 细胞增殖活动的情况，籍以了解机体的细胞免疫功能。
实验操作
④终止培养时，用多头细胞收集器将细胞收集在49型玻 璃纤维滤膜_上，将滤膜置烤箱内烘干。
医学免疫学-副本021：免疫学检测原理
概述是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细临床免疫学检测原理一、基于抗原-抗体反应的检测方法抗原抗体结合反应的特点、影响因素、基本检测方法二、免疫细胞的测定免疫细胞的数量和功能检测三、免疫分子的检测Ig、补体、细胞因子、CD、表面受体、粘附分子、HLA型别分析四、免疫学检测技术的临床应用免疫性疾病、免疫相关分子、免疫功能检测基于抗原-抗体反应的检测方法* 应用范围：用已知抗原检测未知抗体用已知抗体检测未知抗原大分子物质药物、激素和炎性介质等各种半抗原物质一、抗原抗体反应的特点（1）高度特异性和交叉反应⏹——是血清学诊断的依据⏹抗原决定簇－超变区的结合高度特异性（2）可见性——成比例结合→决定反应结果的关键因素（3）可逆性⏹是分子间非共价键结合⏹可逆性结合一定条件下（低pH、高浓度盐、冻融等）→抗原-抗体可被解离（二）影响抗原-抗体反应的因素* 电解质中和抗原抗体复合物表面的电荷0。
85－0。
9％NaCl* 酸碱度PH6-8* 温度37℃(0-45℃)* 振荡* 抗原和抗体本身的性质1）抗体特异性、亲和力2）抗原理化性质、表位多寡和种类抗原抗体反应的基本检测方法(agglutination)凝集反应* 原理颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合→肉眼可见的凝集物* 方法直接凝集、间接凝集、间接凝集抑制试验直接凝集试验－原理：细胞(组织细胞、细菌）＋相应抗体细胞凝集一定条件下间接凝集抑制试验沉淀反应* 原理可溶性抗原与相应抗体结合→肉眼可见的凝集物* 方法单向免疫扩散，双向免疫扩散、免疫电泳沉淀反应原理扩散实验双扩实验结果分析火箭电泳对流免疫电泳补体结合试验免疫标记技术* 原理用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质→标记抗体或抗原→进行抗原-抗体反应* 优点灵敏度高、快速、可定性、定量、定位标记技术检测抗原（1）免疫荧光法(immunofluorescence，IF)* 直接荧光法。
免疫学检验-免疫细胞及其功能检验技术
一、白细胞的分离 （一）自然沉降法
加抗凝血于试管中
室温或37℃中静置 （30-60min）
分层
结果示意图
（二）高分子聚合物沉降法
抗凝血与等量3%明胶或 6%右旋糖酐溶液混匀
室温或37℃中静置 （30～60min）
分层结果与自然沉降法 类似
四、吞噬细胞的分离
•吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞 噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器 官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中 性粒细胞。 •分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。
（一）单核细胞的分离
• Percoll密度梯度分离法 • 流式细胞术分离法（常用方法） • 免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法
） • 黏附法
黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除 单核细胞。
（二）巨噬细胞的分离
• 斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）
操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前 臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出 现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。
• 腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）
优点：速度快、得率高 不足：白细胞黏性增加
二、外周血单个核细胞的分离
•外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）主要是指淋巴 细胞和单核细胞。 •PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群 •PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。
人外周血中各类血细胞密度
（二） Percoll分层液法
连续密度梯度分离液 （Percoll液+PBS，离
免疫学检测原理及临床应用
• ANNEXIN V是种磷脂结 合蛋白，作为探针能识 别凋亡细胞。
• 细胞对细胞活性染料 （如PI）有拒染性。而 坏死细胞能被PI染色。
（二）淋巴细胞功能测定的体内试验
迟发型超敏反应皮肤试验 ●特异性: PPD皮试、过敏原皮试 ●非特异性: PHA 皮试、DNCB皮试
●流式细胞术(flow cytometry，FCM)
●磁分离技术
（三）淋巴细胞亚群计数
●免疫荧光技术（IF） ●补体依赖微量细胞毒试验 ●流式细胞术（FCM） ●花环试验
用FITC-抗IgM 单抗计数B细胞
二、淋巴细胞功能测定
3H-TdR渗入法
淋巴细胞增值试验 MTT法 形态学计数法
体外试验
是指一个抗体分子与整 个抗原之间的结合强度。
之间的结合强度。
High
Affinity Ab
Low
Affinity Ab
Keq =
104
106
Ag
Ag
Avidity Avidity
抗原抗体反应的基本检测方法
（一） 凝集反应 颗粒性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下
形成肉眼可见的凝集块。 （二） 沉淀反应
细胞毒试验
51CR释放法 乳酸脱氢酶释放法
细胞凋亡检查法
分泌功能测定 体内试验：皮试
检测细胞因子分泌细胞 检测抗体形成细胞
二、淋巴细胞功能测定
（一）淋巴细胞功能测定的体外试验
1. 淋巴细胞增殖试验
●刺激物
* 非特异性：丝裂原PHA、Con A和PWM，抗CD2、 CD3单抗，同种MHC等
* 特异性：破伤风类毒素、PPD、白色念珠菌、肿瘤 细胞等
医学免疫学实验3设计
医学免疫学实验四第三小组:刘茹，徐天宇，李嘉琪，邓诗凡【实验任务】市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一个方案证实之（从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度考虑）。
【目的要求】一、学会设计实验，从淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度证实某产品有免疫增强作用。
二、掌握淋巴细胞转化试验的原理及临床实用价值。
三、了解E花环形成的原理，学会用E玫瑰花试验鉴定和计数T淋巴细胞的方法。
【实验材料】一. 肝素（每毫升含100单位），PHA（每毫升含1000微克)二. 199或1640培养液（内含20%灭火小牛血清，青霉素100单位/毫升链霉素100微克/毫升）。
三. 0.5%绵羊红细胞悬液（用Hanks液配制）：吸收过的胎牛血清。
取经56度30分钟加热灭火后的胎牛血清加半量压积绵羊红细胞混合后，37度水浴20分钟，2000转/分离心10分钟，取上清液即成。
四. Hanks液，人抗凝血，淋巴细胞分层液，离心机等。
试剂的相关说明肝素: 一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
PBS:磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。
它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广;而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。
PBA:苯硼酸Hanks液:生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液(Balanced Salt Solution,BSS )，简称H。
主要用于配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞组织培养液。
瑞氏姬姆萨染液：为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。
染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。
免疫学实验设计_证实某产品的免疫增强作用(考虑淋巴细胞活性及功能)
设计思路1
E花环沉降法： 免疫学上用来检测T细胞数量的一种实验方法，T细胞表面具有能与绵羊红细 胞(SRBC)表面糖肽结合的受体，称为E受体(CD2)。CD2 是一种糖蛋白，相 对分子质量为30 000~60 000，已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。 当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状。通过花 环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可测 知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态
中的单核巨噬细胞 ,再分别以脱脂棉柱或尼龙棉柱纯化T淋巴细胞。纯化的T 淋巴细胞经流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度 ,台盼蓝排斥实验检测纯化T细胞 活力 • 脱脂棉柱滤过分离法可以代替尼龙棉柱法获得高纯度高活性的T淋巴细胞
Thanks.
箱固定15分钟。 • 5.取出后，轻轻旋转试管，使沉淀细胞重新悬浮;取1滴涂片，自然干燥后，瑞
氏染色，高倍下观察。
设计思路1
• 结果处理 • 凡能结合3个SRBC者即为E花环阳性细胞。计数200个淋巴细胞，算出花环
形成细胞百ห้องสมุดไป่ตู้率。
E-花环
设计思路2
• 尼龙棉分离法 • 密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞 ,通过玻璃器皿黏附的方法去除其
设计思路1
• 操作方法 • 1.用分层液密度梯度离心法分离淋巴细胞，计数后，用Hanks液配成107个/ml
细胞悬液。 • 2.取0.1 ml淋巴细胞悬液，加入0.1 ml 1% SRBC及0.05 ml灭活小牛血清，混匀。 • 3.37℃静置5分钟，500 rpm低速离心5min后，放入冰箱，2小时或过夜。 • 4.取出试管，吸弃上清液，加0.8%戊二醛溶液1 滴，轻轻旋转混匀，置4℃冰
t淋巴细胞亚群测定检测内容
t淋巴细胞亚群测定检测内容淋巴细胞是免疫系统中的重要细胞群，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等。
其中，T淋巴细胞又可分为多个亚群，如辅助性T细胞（CD4+ T细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+ T细胞）等。
这些不同的淋巴细胞亚群在免疫应答中发挥着不同的作用，具有重要的生理功能。
T淋巴细胞亚群的检测对于研究免疫功能的状态、诊断某些免疫相关疾病、评估治疗效果等具有重要意义。
通过测定T淋巴细胞的各个亚群的比例和数量，可以了解机体的免疫状态及炎症程度。
例如，在免疫抑制治疗后，CD4+ T细胞数量减少，容易导致感染的发生。
而在某些自身免疫性疾病中，CD8+ T细胞可能异常激活，导致炎症反应增加。
T淋巴细胞亚群的检测方法有多种，常用的包括流式细胞术、酶联免疫吸附法等。
这些方法在具体的实验室操作中都有一定的局限性，需要严格控制实验条件，确保检测结果的准确性和可靠性。
此外，对于正常值的确定和不同实验室之间的结果比对也是一个重要的问题，需要更多的研究和标准化操作的制定。
除了在科研领域中的应用，T淋巴细胞亚群的检测在临床诊断和治疗中也有着广泛的应用。
例如，在HIV感染者的监测中，CD4+ T细胞计数是评估疾病进展和治疗效果的重要指标之一。
通过监测CD4+ T细胞的数量，可以及时调整治疗方案，有效控制病情发展。
在肿瘤的免疫治疗中，T淋巴细胞亚群的检测也可以辅助判断患者的免疫状态，选择最合适的治疗方案。
在未来，随着免疫疗法的发展和个体化治疗的需求增加，T淋巴细胞亚群的检测将变得越来越重要。
我们需要进一步深入研究不同T淋巴细胞亚群在免疫反应中的作用机制，发现新的治疗靶点，并开发更加灵敏、准确的检测技术。
通过不断地探索和创新，我们可以更好地利用T淋巴细胞亚群的信息，为免疫相关疾病的诊断和治疗提供更好的支持。
免疫学实验 ——淋巴细胞分离计数及活性
淋巴细胞的分离
实验原理：
根据各类血细胞的比重不同，采用分层液提取淋巴细胞。PBMC （外周血单个核细胞）与血液中的其它成分存在密度差异，利用密 度在1.077 ± 0.001g/L之间而且近于等渗的淋巴细胞分层液作密度 梯 度离心，离心时，各种血液成分按密度梯度重新分布聚集，血浆和 血小板由于密度较低分布于分层液上部，红细胞和粒细胞由于密度 较大分布于分层液底部，PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液层 面上，这样就可以分离得到PBMC了。
小鼠六只，用FITC标记的抗CD69抗体，抗CD3抗体， 流式细胞仪，抗Fc受体抗体，FACS缓冲液，仪器缓冲 液，FACS清洁剂，FACS洗净剂
操作步骤：
1.提取纯的淋巴细胞:将小鼠随机分为A、B、C三组，每组两只，给A组注射该 产品和抗CD3抗体，B组只注射抗CD3抗体，C组不注射任何试剂。然后在相同
6.此时可见液体分为四层，最下层是红细胞和粒细胞，分离液在它 的上层，最上层是血浆层，淋巴细胞在血浆层和分离液之间。
7.将淋巴细胞放入含有Hanks液5ml的E、F的两只试管中，充 分混匀，1000转/分离心10分钟，弃去上清液，即获得纯淋巴 细胞 8.比较E、F两只试管中淋巴细胞的体积，若E、F两只试管中体积 相同，则没有免疫增强作用;若E试管中体积小于F试管中的体积， 则说明该产品确有免疫增强作用。
免疫细胞功能检测技术
免疫细胞功能检测技术免疫细胞大致可分为两类：一类能识别特异性抗原，一旦被激活则显示出特异性应答的功能，主要指淋巴细胞群，包括T细胞、B细胞、NK细胞、K细胞等。
另一类能捕获抗原，处理抗原，以一定方式递呈给淋巴细胞或表现其他免疫功能，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。
第一节淋巴细胞的功能检测淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。
体外试验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。
体内试验主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应。
一、T细胞功能检测（一）T细胞增殖试验1.原理T细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞的代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应，如细胞变大、胞质增多、胞质出现空泡、核染色质疏松、核仁明显，并转化为淋巴母细胞。
2、刺激物体外刺激T细胞增殖反应的刺激物包括植物血凝素（PHA）、刀豆素A （ConA）和美洲商陆（PWM）、白喉类毒素、破伤风类毒素、纯化蛋白衍生物（PPD）和白色念珠菌。
3.方法学检测T细胞增殖反应的方法有：（1）形态学检查法：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。
缺点是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。
（2）3H-TdR掺入法：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好，但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。
（3）MTT比色法：本方法的敏感性虽不及3H-TdR掺入法，但操作简便，无放射性污染。
（二）T细胞分泌功能测定体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后，分泌各种细胞因子，可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子的含量、生物学活性和基因表达水平，以反映T细胞功能。
（三）T细胞介导的细胞毒试验T细胞介导的细胞毒试验是细胞毒性T细胞的特性，凡致敏T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出破坏和溶解靶细胞，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标。
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材料: 1.肝素(100单位/毫升)、 淋巴细胞分层液人 的正常血液 2.0.5%绵羊红细胞悬液(用Hanks液配制), Hanks 液 3.吸收过的胎牛血清:取经56℃30分钟加热灭 活后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后， 37℃水浴20分钟，2000转/分离心10分钟， 取上清液即成。 4. 灭菌注射器，针头，试管，吸管等。
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B细胞产生抗体能力的测定
ELISPOT法
原理：ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验，可用于测定产 生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被固相，然后 加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与板上的 抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代 表一个产生抗体的细胞。
方法
1.抗原包被: 37C° 2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯 平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 2.抗体生成细胞培育:加入适量抗体生成细胞，37C°, 5%CO. ，3~4h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。 3.测定斑点产生细胞:加二抗，37C° ，5%CO.2，2~3h。加辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。 4计数: 24h后用10~30倍显微镜下计数斑点形成细胞。
淋巴细胞功能检测
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之(从影响淋巴细胞功能、
T淋巴细胞增殖的角度考虑) .
淋巴细胞功能检测
•T细胞增殖（转化）实验 •绵羊红细胞玫瑰花环试验 •B细胞产生抗体能力的测定 •细胞因子的检测
T细胞增殖（转化）实验
原理：T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，在 24~48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如 细胞变化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由 淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞 转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。
人T淋巴细胞的测定
绵羊红细胞玫瑰花环试验
原理:玫瑰花环试验，又称为花结试验。是测定淋巴细胞数量和功 能的一种方法。
人类T和B淋巴细胞表面具有不同的受体。由于人类T淋巴细胞表面 具有与绵羊红细胞结合的受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形 成E花环，因此，T细胞也成为红细胞花瓣形成细胞。根据E-玫瑰花 环形成率， 可以间接判断机体细胞免疫力。目前，已广泛应用于临 床，作为测定人群免疫状态的一个指标。
方法
(以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例）
1.分离PBMC和APC,APC用丝裂霉素或放射性核素处理。 2.96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。 3.每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别 为0、1、5、10和20ug/ml。每一种浓度设三复本。 4.37℃，5%CO2，6天。 5.加3HTdR,继续培养18小时。计数。
(1) 非抗原性刺激物：如植物血凝素(PHA)、刀豆素 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、脂多糖(LPS)，通称促有丝 分裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞， PHA和ConA刺激T细胞增殖。 (2) 抗原性刺激物：如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤 风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗 原等。
细胞因子生物学活性检测和浓度测定
1．细胞增殖法 细胞因子具有细胞生长因子活性，筛选，建立只依赖于某种因子的细胞系， 这些细胞系在通常情况下不能存活，加入特定因子后才能增殖。通过测定 细胞增殖情况（如使用3h-tdr掺入法、MTT法等）鉴定细胞因子的含量。 2．靶细胞杀伤法 是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。 3．细胞因子诱导的产物分析法 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，通过测定所诱生的相应 产物，可反映细胞因子的活性。
方法与结果: 1.淋巴细胞提取 (1)取人抗凝血2毫升，加2毫升Hanks液使之稀释。 加于2毫升淋巴细胞分层液液面之上(沿管壁轻轻 加人，勿使两液相混)。 (2) 2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另试 管中加5倍体积的 Hanks液洗1一2次，(1500转/分 离心10分钟)弃上清即成 2.加吸收过的胎牛血清0.1毫升，0.5%绵羊红细胞悬 液0.2毫升，于淋巴细胞中。混合后，37℃水浴5 分钟。
3.500转/分离心5分钟，放4℃冰箱中2小时后， 弃大部分上清。 4. 染色及观察 轻轻悬浮沉积的细胞。向悬液中滴一滴美蓝 液，混合，10分钟后取一滴放载玻片上，加 盖玻片镜检。 高倍镜或油镜下计数200个淋巴细胞,凡结合3 个或3个以上的绵羊红细胞者为阳性，计算 花环形成细胞的百分率。正常值65%左右。