邻苯三酚自氧化法
NBT光还原法_邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较_简报_
河北职业技术师范学院学报 第14卷第2期,2000年6月Journal of Hebei Vocation2Technical Teachers College Vol.14 No.2 J une2000NB T光还原法、邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较(简报)张文军1,葛 超2(1河北职业技术师范学院教务处,昌黎,066600;2河北职业技术师范学院食品工程系)关键词:SOD;酶活性测定方法;NB T光还原法;邻苯三酚自氧化法中图分类号:Q554+16 文献标识码:A 文章编号:1008-9519(2000)02-0068-03超氧化物歧化酶(SOD)是催化O-2歧化反应的酶类,它催化的反应是O-2+O-2+2H+H2O+ O2。
由于O-2是一种极不稳定的氧自由基,因此,检验SOD活性一直采用间接的方法。
笔者针对目前较普遍采用的邻苯三酚自氧化法和NB T光还原法,从灵敏度、精确度、反应特异性三个方面对两方法进行比较,以确定提纯过程中非纯品SOD及纯品SOD两种材料酶活测定的适用方法。
1 材料与方法111 材料纯品牛红细胞SOD、玉米SOD粗提液(自制)、超滤液(超滤膜MW=4000)、透析液(体积分数为014～019的硫铵分步沉淀后)。
本实验所用药品牛红细胞SOD为电泳纯、核黄素(上海化学试剂采购站供应,进口分装),Met(甲硫氨酸)、邻苯三酚为国产分析纯。
112 方法11211 NB T光还原法 根据Stewart和Bewley报导[1],在3mL反应液中含有13×10-3mol甲硫氨酸;75×10-5mol NB T;2×10-6mol核黄素;100×10-9mol ED TA;50×10-3mol磷酸缓冲液(p H 718),在4000lx光下照射15min后,NB T光化还原产物蓝色甲月替在560nm有最大吸收,在此条件下,反应被抑制50%所需酶量为1个活力单位。
05-05-18邻苯三酚改进
邻苯三酚法测定超氧阴离子自由基的清除作用1. 邻苯三酚自氧化改进：1.1 试剂的配制1. pH8.2 50mM Tris-HCl（含EDTA）缓冲液 500mL：称取 3.028g Tris固体溶于250mL蒸馏水中，溶解后加入0.9542mL浓盐酸，加入0.1gEDTA后定溶到500mL，装入棕色瓶备用。
2. HCl配0.1mM 邻苯三酚：称取62.22mg邻苯三酚（即焦性没食子酸），溶于5mL10mM HCl（吸取0.0833mL浓盐酸稀释到100mL），吸出100μL溶于10mL同样的HCl中，装入棕色瓶备用（室温一般保存3天）。
1.2 试验方法按下表取50mM Tris-HCl缓冲液、蒸馏水、多糖，混匀后在25℃水浴保温20分钟，取出后立即加入25℃预热过0.1mM 邻苯三酚（用10mM HCl配），迅速摇匀后倒入比色杯（1cm），325nm下测OD，30秒记录一次数据。
实验重复三次。
抑制率AI（％）＝（A对照－A样品）×100%/A对照。
举例：反应体系Tris-HCl(ml)蒸馏水或者10mMHCl(ml) 多糖(ml)邻苯三酚(ml)空白 2 1 0 0对照 2 0.6 0 0.4处理组1 2 0.5 0.1 0.4处理组2 2 0.4 0.2 0.4处理组3 2 0.3 0.3 0.4处理组4 2 0.2 0.4 0.4处理组5 2 0.1 0.5 0.4注意事项：1．多糖母液浓度最好选在1~2mg/ml2．邻苯三酚一般现用现配，放置一般放3天，3．A325nm/分的读数一般为0.7~1之间，实验系统才比较准确，4．用蒸馏水代替HCl配制邻苯三酚是可以的，只是放置时间不能太长2. 试验结果2.1 虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基的清除作用从图21和表26实验结果看，虎乃菇水提多糖对超氧阴离子自由基有清除作用，且清除作用的大小随多糖浓度增加而增加，表现出一定的线性关系。
分别加入100μL、200μL、300μL、400μL、500μL多糖后，对超氧阴离子的清除率分别为14.167%、34.286%、54.762%、70.592%、85.714%。
邻苯三酚自氧化法
1、目的采用邻苯三酚自氧化法测定大蒜不同部位的SOD酶活性2、原理根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（m g∕mL）;每ml 样品中的酶活性单位数（U∕mL）。
酶的纯度越高酶的活性也就越高。
SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。
在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。
加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm[1]处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加[1,2]。
3、仪器、试剂和材料1)仪器UV-260紫外分光光度计（或其他型号），比色杯，样品管，自氧化管2)试剂和材料a)取培育的大蒜等量的须根，茎，叶；b)所用试剂邻苯三酚、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)、EDTA-2Na、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、30%H2O2、三(羟甲基)氨基甲烷、浓HCl,均为分析提纯。
c)Tris-HCl 缓冲液4、操作步骤4.1SOD粗酶液的提取称取鲜重3.00 g的样品,加入少量预冷的pH=7.8的磷酸缓冲液(含0.1 mmol/L的EDTA、质量浓度为4 %的聚乙烯吡咯酮烷),冰浴研磨.将匀浆液于4 000 r/min下离心20 min.取其上清液,于60℃水浴15 min,待其冷却后,于4 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,将上清液定容到10 mL容量瓶,4℃冰箱中保存备用[3,4]。
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mgNa2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，而在酸性环境中却相当稳定。为了尽可能使缓冲液的pH维持恒定，要求加样量尽可能少些，因为PH变化对自氧化速率有较大的影响，见图2
实验表明:不同pH对滞后时间和线性维持时间影响不大，而对线性速率影响很大。实验还表明，降低pH要比升高pH对速率影响更大。测定时，要求将反应液pH严格控制在8.2，误差不得超过士0.01。
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
抗氧化实验方法
附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。
因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。
抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。
2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。
三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。
2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。
3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。
4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。
现配现用，4h内有效。
四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。
邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量
邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量一、实验原理:邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。
二、实验试剂：大宝sod蜜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管 8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根这个液体貌似是不能研磨的，而且本身就是酶，正常的生物体内的酶不都是可溶的？研磨是为了破碎细胞的。
我觉得应该是通过加水——打碎胶体，把抗氧化剂全都搞到水中（这个拜托查下）——分液——乙醇-氯仿沉淀（用来鉴别是带Mn还是CuZn）（不知道会不会有另外两种抗氧化剂干扰）——透析（去离子电泳用）乙醇-氯仿的浓度比酶的保存问题：测一下大宝pH应该可以作为参考，但是这个酶种类太多了，要点就是pH至少不能小于6，关于最适合pH是否也要测量？还是说我们是为了测量大宝里面SOD的活性所以就按照大宝的pH保存。
还有一个小小的想法就是。
这部分是1次做完还是两次做完？EDTA二钠：几乎不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。
用于络合金属离子和分离金属。
干扰物，但是没有氧化性三、实验步骤：（1）SOD提取：取大宝sod蜜加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)（2）除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。
清除超氧阴离子能
2.3试验方法
吸取不同质量浓度样品液1mL 于试管中，依次加 入1mL 0.078mol/LNBT，1mL 0.468mol/L NADH， 最后加入0.4mL 的0.06mol/L PMS 溶液，室温摇 匀，后静置5min，于560nm波长处测定吸光度， 调零组用不同质量浓度样品液1mL，0.4mL 蒸馏 水代替PMS 溶液调零，用蒸馏水作阴性对照，VC 作阳性对照，清除率计算
1.2试剂
Tris-HCl 缓冲溶液（三羟甲基氨基甲烷） 邻苯三酚 HCl 溶液
1.3仪器
紫外-可见分光光度计 真空干燥箱 电热恒温水浴锅 旋转蒸发仪
1.4试验方法：
【1】取4.5 mL 50mmol/L Tris-HCl 缓冲溶液（pH 8.2）， 4.2 mL 蒸馏水，混匀后在25 ℃水浴中保温20 min，取出， 立即加入在25 ℃预热的3 mmol/L 邻苯三酚0.3 mL，迅速 摇匀后倒入比色杯， 于325 nm 处每隔30 s 测定吸光度， 计算线性范围内每分钟内吸光度的增加值， 以10mmol/L HCl 溶液配制空白为对照。 加入晒青毛茶不同溶剂提取物后， 邻苯三酚自氧化速率 的测定方法：按照上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加 入0.1 mL 不同浓度的样品液，蒸馏水减少。同样以10 mmol/L HCl 溶液配制空白管并作为对照。计算清除超氧 阴离子清除率。清除率:
【2】邻苯三酚自氧化法测定按参照文献[11]的方 法并略有改动，按照表3进行加样，在325 nm波长 下，每隔0.5 min记录一次值，连续记录3 min。样 品在同样条件下测定吸光值，每个处理试样均做3 个平行试验，取平均值。多糖对超氧阴离子的清除 作用按下列公式计算：
邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择
3经验交流3邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择孙雪奇,陈齐英,别小琳(四川省药品检验所,四川成都610034)提要:用岛津UV-240型、260型和T-1901紫外可见分光光度计进行实验,确定邻苯三酚自氧化法测定S OD活性的最适波长非文献使用的420nm和325nm,而应为320nm。
关键词:邻苯三酚自氧化法;S OD活性;波长中图分类号:R917文献标识码:B文章编号:1006-0103(2004)05-0404-02 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,S OD)为体内自由基的清除剂,在生物体的正常代谢中起重要作用,其活性测定常用邻苯三酚自氧化法[1]。
该方法主要是通过测定邻苯三酚自氧化前4min内, S OD对自氧化初始中间产物增加的抑制作用来测定S OD活性。
文献报道的测定波长主要有420nm[1]和325nm[2]。
为探讨初始中间产物的吸收峰位置,进而确定测定波长,特对此进行了研究。
1 实验部分111 仪器与试剂 UV-260和UV-240紫外可见分光光度计(日本岛津公司);T-1901紫外可见分光光度计(上海科学仪器厂)。
试剂均为国产分析纯。
112 方法 吸取4.5ml100mm ol・L-1的T ris-HCl缓冲液(pH812)和4146ml蒸馏水,混匀后置25℃水浴中20min,立即加入在25℃预热的30mm ol・L-1邻苯三酚40μl(10mm ol・L-1的HCl溶液配制),立即混匀,迅速倒入比色池中,以10mm ol・L-1的HCl溶液为空白,分别用上述3种型号的紫外可见分光光度计测定邻苯三酚自氧化中间产物的吸光度。
113 结果 UV-240紫外可见分光光度计测定可知,邻苯三酚自氧化初始中间产物的吸收峰在320～319nm 处。
T-1901和UV-260紫外可见分光光度计两种仪器测得的λmax均出现在320nm波长处,此时在420nm处吸光度还很小,到5min时吸光度<011,可见420nm处吸光度的变化不能反映中间产物的积累,因此,用420nm进行S OD酶活性测定是不正确的。
实验原理 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定
实验原理 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可见光区最大吸收峰为515 nm[17-20]，当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱。
因此可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力。
其作用原理如图1。
图1 DPPH 自由基清除作用原理Fig. 1 Principle of DPPH free radical scavenging1.2.6 DPPH 自由基清除试验的测定方法将每种供试品溶液分别取20 μL 加样在96 孔板中，再在每个孔中平行加入180 μL DPPH 溶液。
同时设立对照组（等量乙醇代替供试液），空白组（20 μL 乙醇加入180 μL DPPH 溶液）。
轻轻振荡，使充分混匀，将96 孔板放置在避光环境下反应30 min。
药物与自由基反应完全，在波长515 nm 处测定，记录最终吸光度（A）值。
自由基清除率D=（A 对照组−A 样品组）/（A 对照组−A 空白）式中A 样品组为加入测试样品后反应液的吸光度；A 对照组为对照组未加药的吸光度；A 空白为空白组的吸光度。
为了减小实验误差，每样品设6 复孔，6 复孔取平均值。
DPPH·(二苯代苦味酞自由基)在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其孤对电子在sl7nm附近有强吸收(显深紫色)。
当有机清除剂存在时,孤对电子被配对,吸收消失或减弱,通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除剂的活性。
DPPH·法用以评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速(反应时间仅需20min左右)、简便、灵敏可行的方法。
原理:DPPH·(二苯带苦基麟基自由基)是一个大分子的稳定自由基抗氧化剂预期作用模式为:AH十DPPH·~DPPH一H十A·依据DPPH·具有单电子,在517nm处有一强吸收(深紫色),当自由基清除剂与其单电子配对使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系,因而可用分光光度法进行定量分析[91。
邻苯三酚自分解方程式
邻苯三酚自分解方程式
邻苯三酚自分解反应是一种重要的化学反应，涉及到多个化学过程。
以下是该反应的详细步骤：
1. 脱羟基
邻苯三酚首先从羟基中脱去一个水分子，生成一个酚氧自由基。
这个过程是通过酸催化实现的，需要消耗一个质子（H+）。
化学方程式：C6H3(OH)3 → C6H3(OH)2 + H2O
2. 电子转移
接下来，邻苯三酚的酚氧自由基从另一个邻苯三酚分子中获取电子，生成一个新的酚氧自由基和一个新的自由基。
这个过程需要一个电子转移反应。
化学方程式：C6H3(OH)2 + C6H3(OH)3 → 2 C6H3(OH)2·
3. 自由基反应
生成的酚氧自由基和自由基继续进行反应，生成一个新的自由基和一个新的酚氧自由基。
这个过程是一个自由基反应。
化学方程式：C6H3(OH)2· + C6H3(OH)3 → 2 C6H3(OH)2·
4. 终产物生成
最后，两个酚氧自由基结合生成一个双酚，而两个自由基结合生成一个双酚。
这个过程不需要额外的能量。
化学方程式：2 C6H3(OH)2· → C12H10O2（双酚）+ C12H10O2（双酚）
综上所述，邻苯三酚自分解反应是一个复杂的多步反应。
该反应主要包含脱羟基、电子转移、自由基反应和终产物生成等过程。
邻苯三酚 氧化法
邻苯三酚氧化法邻苯三酚（1,3,5-三羟基苯）是一种重要的有机化学品，广泛应用于合成染料、医药、香料等领域。
在工业生产中，邻苯三酚的制备方法有很多，其中氧化法是常用的一种方法。
本文将对邻苯三酚氧化法的原理、工艺流程和优缺点进行介绍。
一、原理邻苯三酚氧化法的基本原理是通过将对苯二酚（1,4-二羟基苯）氧化得到邻苯三酚。
氧化剂常用的有空气、过氧化氢、高锰酸钾等。
其中，空气氧化法是较为常用的方法。
二、工艺流程邻苯三酚氧化法的工艺流程包括原料准备、反应控制、分离和精制等步骤。
1. 原料准备：反应的主要原料是对苯二酚。
为了提高反应效率，对苯二酚的纯度需较高。
通常可通过对苯二酚的精制、再结晶等方法来获得高纯度的对苯二酚。
2. 反应控制：在反应容器中，将对苯二酚与氧化剂加入并进行搅拌，调整反应温度和pH值以控制反应速率和产品产率。
3. 分离：将反应混合物进行分离，主要分离邻苯三酚和未反应的对苯二酚。
通常使用溶剂萃取、蒸馏等方法进行分离。
4. 精制：通过再次结晶、减少杂质以提高产品的纯度和质量。
三、优缺点邻苯三酚氧化法具有以下优点：1. 原料广泛：对苯二酚作为主要原料易得，成本较低。
2. 反应简单：反应步骤较少，过程控制相对简单。
3. 应用广泛：邻苯三酚作为重要的有机化学品，广泛应用于合成染料、医药、香料等领域。
然而，邻苯三酚氧化法也存在一些缺点：1. 产率较低：相对于其他制备方法，氧化法的产率较低。
2. 对环境的影响：氧化法使用的氧化剂可能对环境造成一定的污染。
3. 能耗较高：反应温度和pH值的调控可能需要较高的能量消耗。
四、总结邻苯三酚氧化法是制备邻苯三酚的一种常用方法，具有原料广泛、反应简单和应用广泛等优点。
然而，也存在产率较低、对环境的影响和能耗较高等缺点。
在实际应用中，根据具体情况选择合适的制备方法，以满足产量要求和环保要求。
随着科技的发展和工艺的不断改进，邻苯三酚的制备方法也会不断完善，以更高效、环保的方式生产邻苯三酚。
多酚氧化酶对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的干扰
。
酶 活 力 单 位定 义 为 以 抑 制 0 5 %的 反 应 产 物 蓝 0 5 叼 的 酶 鼠为 一 个
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的 生 成 为 一 个 活 力 草 位 即在
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.
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19 93
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加甘薯粗提液 加 人 红细胞粗提 液
上述 结 果表 明 在 甘 薯 和 小 白菜 叶中
含 有 某 种能促 使邻 苯三 酚氧 化 的 物质 且
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甘薯 中含 量更高
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这 种物 质 完 全 抵 消 了 以 ) D 抑 制邻 苯三 酚 自氧化 的作 用 还 导致 了 邻苯
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三酚 自氧化 速率上 升
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活 性 和 多酚 式 化 晦 的 活 力
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.
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超氧化物歧化酶两种邻苯三酚自氧化测定活力方法的比较
超氧化物歧化酶两种邻苯三酚自氧化测定活力方法的比较杨明琰1,2,张晓琦2,沈 俭2,黄继红2,郭爱莲1(1.西北大学生命科学院,陕西西安 710069;2.陕西省微生物研究所,陕西西安 710043)摘 要 在同一反应条件下,以酵母SOD为原料,对2种邻苯三酚自氧化测定SOD的方法进行了比较,实验结果表明325nm法测定的酶活力单位与420nm法测定的酶活力单位的比值约为2.7,考察了不同浓度邻苯三酚对SOD活力的影响。
关键词 酵母菌超氧化物歧化酶;活力测定;420nm法;325nm法;比值中图分类号 Q550 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2006)03-0040-03SOD Activity Determination Comparison bet w eenTwo Pyrogallol AutoxidationYAN G Ming2yan1,2,ZHAN G Xiao2qi2,SHEN Jian2,HUAN G Ji2hong2,GUO Ai2lian1(1.Sch.of L if e Sci.N W U niv.Xi’an710069;2.Inst.of Microbiol.Xi’an710043)Abstract Under identical testing circumstance,take yeast SOD as raw materials,two pyrogallol auxidation deter2 mination methods were compared.The results showed that the ratio of enzyme activity unit determined with325nm and420nm was about2.7,the effects of different concentrations of pyrogallol on SOD activity were also considered.K eyw ords yeast SOD;activity determination;method of325nm;method of420nm;ratio 超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的氧自由基清除剂,与人类健康有密切的关系,现已广泛应用在食品、化妆品及药品领域[1]。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶的活性
超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定——邻苯三酚自氧化法一、实验原理本实验采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的活力。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出超氧阴离子O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
该法所用试剂和仪器比较普通，测试方便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法，但对温度、PH、邻苯三酚浓度、SOD待测液存放时间等诸因素比较敏感，因此测定时严格控制这些因素。
二、试剂和器材1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL 左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L邻苯三酚称取邻苯三酚(A.R)0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
（4）SOD样液2、器材（1）恒温水浴槽（2）紫外分光光度计（3）试管、刻度吸管、微量注射器三、方法和步骤1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化。
改良后的邻苯三酚自氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性
改良后的邻苯三酚自氧化法A.1试剂的制配A.1.1A液：pH8.200.1mol/l三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。
称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml。
A.1.2B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。
称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，待邻苯三酚完全溶解后，用10mmol/L盐酸溶液定容至100ml。
A.1.310mmol/l盐酸溶液。
A.1.4供试品溶液：取1ml于500ml容量瓶中，用蒸馏水定容到500ml。
即得供试液。
A.1.5蒸馏水：双重石英蒸馏水。
A.2仪器紫外-可见分光光度仪，精密酸度计（精密度0.01pH），试管数支，100μl移液枪，1000μl移液枪，10ml移液枪。
A.3方法A.3.1调零在25℃左右，取2支试管，分别依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.15ml；在325nm波长条件下，调零。
A.3.2邻苯三酚自氧化速率测定△A325在25℃，取2支试管（A管和B管），A 管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml；B管中分别加入B液0.15ml，把A管倒入B管中，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s记录一次A值，共测6次，要求自氧化速率控制在0.060（±0.003）OD/min。
A.3.3酶活测定在25℃，在试管中加入A液2.35ml，蒸馏水1.8ml，在25℃的水浴中预热5min,然后加入Vml的样液，再加入0.15mlB液，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s 记录一次A值，共测6次。
在此条件下，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率50%的酶量定为1个活力单位，即△A′325=1/2△A325。
邻苯三酚自氧化法测定不同蜂产品抗氧化活性的研究[1]
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１．１ 材料 油菜花粉、茶花花粉、蜂胶、枣花蜜、蜂王浆：
市 售 ； 无 水 乙 醇 ； 邻 苯 三 酚 ； Ｔｒｉ； ＨＣｌ； 其 他 试 剂 ： 分析纯。 １．２ 实验仪器
ＣＵ４２０ 型 恒 温 水 浴 锅 ： 上 海 恒 科 科 学 技 术 有 限 公司； ＦＡ１６４０ 型电子天平： 上海天平仪器厂； ８５－ １ 型恒温磁力搅 拌器： 常州国华 仪 器 有 限 公 司 ； ＴＤＬ－ ６０Ｂ 型离心机： 上海安亭科学仪器厂； ７２３ 型可见分 光光度计： 上海第 三分析仪器厂； ２０２－ １Ａ 型数显电 热恒温干燥箱： 上海阳光实验仪器有限公司。
醇 ， 用 玻 璃 棒 搅 拌 促 其 溶 解 ， 即 为 所 需 的 １０％蜂 蜜 样品液， 低温贮藏， 备用。 ２．３ 抗氧化实验原理
利用某些体系在氧化过程中有超氧阴离子自由 基（Ｏ２ˉ） 的生成， Ｏ２ˉ与某些化合物的作用， 产生具有特 定吸收的有色物质， 利用分光光度计进行测定。受试 物若能清除 Ｏ２ˉ， 则吸光度发生 变 化 ， 可 间 接 判 断 受 试物对 Ｏ２ˉ的清除作用。
ＸＵＡＮ Ｈｏｎｇ－ ｚｈｕａｎ， ＳＡＮＧ Ｑｉｎｇ， ＭＡ Ｊ ｉａｎ－ ｊｕｎ
（Ｓ ｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓ ｃｉｅ ｎｃｅ ， Ｌｉａ ｏｃｈｅ ｎｇ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ， Ｌｉａ ｏｃｈｅ ｎｇ ２５２０５９）
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ １％ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ， ５％ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｂｅｅ ｐｏｌｌｅｎ， １０％
蜂胶、蜂花粉、蜂王浆、蜂蜜是药食兼用的天 然绿色食品， 具有广泛的生物学活性， 如抗肿瘤、 抗氧化、抗辐射、抗病源微生物、抗菌消炎、增强 免疫、软化血管、净化血液、改善微循环、局部麻 醉、护肝、促进组织再生以及延缓衰老等广泛的生 物学作用［１－ ５］。
邻苯三酚自氧化法原理
邻苯三酚自氧化法原理邻苯三酚自氧化法是一种将邻苯三酚（catechol）转化为对苯二酚（quinone）的化学反应。
这种方法通过氧气氧化邻苯三酚，从而生成对苯二酚。
邻苯三酚自氧化法的原理涉及到邻苯三酚和氧气之间的氧化反应。
在反应中，氧气分子相互作用并与邻苯三酚发生氧化反应。
邻苯三酚中的两个邻位羟基（-OH）在氧气的存在下被氧化成两个酮基（C=O）。
这个反应可以写成如下方程式：2 C6H6O2 + O2 →2 C6H4O2 + 2 H2O在这个反应中，邻苯三酚的两个羟基被氧气氧化生成了两个酮基，同时也产生了水。
邻苯三酚中的羟基（-OH）在氧气氧化反应中失去了氢原子，而邻苯三酚中的碳原子增加了一个氧原子，变成了酮基（C=O）。
这个反应产生的酮化合物则是对苯二酚。
邻苯三酚自氧化法可以通过在反应体系中引入催化剂来促进反应的进行。
常见的催化剂有过渡金属、有机过渡金属和酸碱等。
这些催化剂可以提高反应速率，加速氧气与邻苯三酚的反应。
通过添加催化剂，邻苯三酚的自氧化反应可以更加高效和快速地进行。
催化剂在反应中的作用主要体现在调整反应物的反应速率，并降低反应的活化能，从而促进反应进行。
邻苯三酚自氧化法广泛应用于有机合成和药物研究领域。
对苯二酚是一种重要的化学物质，它可以通过邻苯三酚自氧化法得到，并进一步用于合成多种有机物。
对苯二酚具有良好的氧化性和还原性，它可作为氧化剂或还原剂参与多种有机反应。
对苯二酚还可以用作染料、药物和橡胶生产等方面。
因此，邻苯三酚自氧化法不仅在科学研究中具有重要意义，而且在工业应用中也十分广泛。
总结来说，邻苯三酚自氧化法是一种通过氧气将邻苯三酚氧化生成对苯二酚的化学反应。
该反应可以通过催化剂的引入来促进反应的进行。
邻苯三酚自氧化法在有机合成和药物研究中具有重要应用。
邻苯三酚 氧化法
邻苯三酚氧化法
邻苯三酚是一种常用的有机合成试剂，其氧化法在有机合成中具有重要的应用价值。
本文将介绍邻苯三酚氧化法的原理、实验条件、反应机理以及应用等方面的内容。
一、原理
邻苯三酚氧化法是指通过将邻苯三酚与氧气或氧化剂反应，从而得到目标产物的合成方法。
在该反应中，邻苯三酚作为电子供体被氧化剂氧化，形成具有不同化学性质的产物。
二、实验条件
邻苯三酚氧化反应一般在室温下进行，反应物通常以粉末状或溶液形式加入反应体系中。
常用的氧化剂包括高锰酸钾、过氧化氢、硝酸等。
反应溶液的酸碱度可以通过调整溶液的pH值来控制。
三、反应机理
邻苯三酚氧化反应的机理较为复杂，具体的反应机理取决于所选择的氧化剂和反应条件。
以高锰酸钾为氧化剂为例，反应机理如下：
1. 高锰酸钾在溶液中发生分解，生成高锰酸根离子和氧气。
2. 邻苯三酚被高锰酸根离子氧化，形成间苯三酚。
3. 间苯三酚进一步氧化，生成苯醌。
四、应用
邻苯三酚氧化法在有机合成中具有广泛的应用。
其中，最常见的应
用是合成苯醌。
苯醌是一类重要的有机化合物，广泛用于染料、药物、农药等领域。
通过邻苯三酚氧化法，可以高效地合成苯醌，为相关领域的研究和应用提供了重要的有机合成工具。
总结：
邻苯三酚氧化法是一种重要的有机合成方法，通过将邻苯三酚与氧化剂反应，可以合成各种有机化合物。
该方法具有简单、高效的特点，被广泛应用于有机合成领域。
随着对有机化合物合成需求的不断增加，邻苯三酚氧化法也将在更多领域展示其独特的价值和应用前景。
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1、目的
采用邻苯三酚自氧化法测定大蒜不同部位的SOD酶活性
2、原理
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（m g∕mL）;每ml 样品中的酶活性单位数（U∕mL）。
酶的纯度越高酶的活性也就越高。
SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。
在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。
加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm[1]处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加[1,2]。
3、仪器、试剂和材料
1)仪器
UV-260紫外分光光度计（或其他型号），比色杯，样品管，自氧化管
2)试剂和材料
a)取培育的大蒜等量的须根，茎，叶；
b)所用试剂邻苯三酚、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)、
EDTA-2Na、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、
30%H2O2、三(羟甲基)氨基甲烷、浓HCl,均为分析提纯。
c)Tris-HCl 缓冲液
4、操作步骤
4.1SOD粗酶液的提取
称取鲜重3.00 g的样品,加入少量预冷的pH=7.8的磷酸缓冲液(含0.1 mmol/L的EDTA、质量浓度为4 %的聚乙烯吡咯酮烷),冰浴研磨.将匀浆液于4 000 r/min下离心20 min.取其上清液,于60℃水浴15 min,待其冷却后,于4 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,将上清液定容到10 mL容量瓶,4℃冰箱中保存备用[3,4]。
4.2SOD酶活性测定
采用邻苯三酚自氧化法测定[5,6].取两支试管按表1的试剂用量,将缓冲液加入试管并在25℃保温25 min,加入定量预热的邻苯三酚,倾入1 cm比色杯中,迅速摇匀,在波长325 nm处每隔30 s测定吸光度一次,测定3 min内每分钟光吸收值的变化,要求自养化速率控制在每分钟吸光度的变化速率在0.070(±0.002)左右(可增减邻苯三酚的加入量,以控制吸收值)。
SOD酶活测定方法与邻苯三酚自氧化测定相同.样品管取代自氧化管,样品管测定时先加入预热的待测酶液,再加邻苯三酚.其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定,控制加酶后每分钟吸光度的变化速率在0.035(±0.001)左右.然后计算SOD酶活。
表1 大蒜SOD酶活性测定反应体系[6]
酶活性计算公式：
U／mg=(0.070－△A325)×100%×V总/[0.070×50%·V。
·V S] 其中：
△A325：反应吸光值变化值；
V总：反应总体积(mL)；
V S：加入样品液的体积；
V。
：活力单位定义体积（1mL）。
表2 大蒜不同位置的SOD酶活
【参考文献】
[1] 许雅娟,赵艳景,胡虹. 邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化
酶活性的研究[ J ]. 西南民族大学学报: 自然科学版, 2006, 32 ( 6 ) :1208212121
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究及改[ J ]. 化学通报, 2001 (8) : 51625191
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