第10章 亲和分离(2)

亲和分配(Affinity partitioning):
利用偶联亲和配基的PEG为成相 为成相 利用偶联亲和配基的 聚合物进行目标产物的双水相萃 取 ， 可在配基的亲和作用下促进 目标产物在PEG相的分配， 提高 相的分配， 目标产物在 相的分配 目标产物的分配系数和选择性。 目标产物的分配系数和选择性 。 这就是亲和萃取，又称亲和分配. 这就是亲和萃取，又称亲和分配
操作过程: 操作过程
与其他亲和纯化技术一样，亲和分配纯化过程也可经过 三步: 亲和分配(进料 ； 亲和分配 进料)； 进料 杂蛋白质反萃取(清洗 ； 杂蛋白质反萃取 清洗)； 清洗 目标产物反萃取(洗脱 。 目标产物反萃取 洗脱)。 洗脱
应用
图为利用PEG-色素/Aquaphase-PPT(一种淀粉的羟丙基衍生物 的商品名)系统从猪肌组织中连续萃取LDH的流程。猪肌组织直 接在成相系统中匀浆，固形物分配在下相，而目标产物分配在 上相。用离心机分相后，上相用纯下相溶液清洗一次，进入第 二个离心机。从第二个离心机流出的上相与磷酸钠溶液(50%， 磷酸钠双水相系统。由于LDH与色 pH6.9~7.0)混合，形成PEG/磷酸钠双水相系统 磷酸钠双水相系统 素的亲和作用下降，LDH被反萃到下相(磷钠溶液)中得到回收， 而上相的PEG和PEG-色素返回匀浆机中循环再利用。
3 亲和沉淀 （affinity precipitation） ）
3.1涵义： 涵义： 涵义
亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物合成分子（ 亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位 基质、辅酶等） 体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来 的一种特殊选择性的分离技术， 的一种特殊选择性的分离技术，是生物亲和相互作用与沉 淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术。 淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术。 与普通沉淀法的原理有很大不同， 与普通沉淀法的原理有很大不同，它不是依据蛋白质溶解 程度的差异，而是依据 吸附” 依据“ 程度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的 溶解度的大小。 溶解度的大小。
2.2 亲和反胶团萃取
胶束(micelles): 向水中加入S, 水溶液的δ随[S]增大而下降。当[S]达到 胶束
一定值后，S缔合形成水溶性胶束, 溶液的表面张力不再随表面活性剂 浓度的增大而降低。 反胶束萃取技术（ 反胶束萃取技术（Reversed micellar extraction）是近年来发展 ） 起来的一种新型萃取分离技术，主要适合于蛋白质的提取和分离，利 用表面活性剂在有机溶剂中自发形成一种纳米级的反胶束相来萃取水 溶液中的大分子蛋白质。
机理: 机理
对于多效价目标分子与配基结合,
1 1 Kd P + L ←→ PLn n n
P-目标分子，L-配基，PLn-单目标 分子与n配基形成的复合体.
影响因素: 影响因素
1 配基浓度和亲和分配系数Kd，[L]
or [PEG – L]，[PEG-L]/{[PEG-L] + [PEG]}
2 配基种类
影响因素
2nd 配基浓度对 A作用 配基浓度对m 图为OGP浓度对con A 分配系数的影响，随着 随着 OGP浓度增大，con A 浓度增大， 浓度增大 的分配系数增大
影响因素
3rd 对适应 范围的作用 对适应pH范围的作用
图示: 通过添加亲和助表面 活 性 剂 可使目 标 产物 的萃 范围增宽。 取pH范围增宽。 范围增宽 意 义 ： 因此利用亲和反胶 团萃取不仅可以提高目标产 物的分配系数(回收率), 而 且由于萃取操作的pH范围 较宽，便于通过调节pH值 提高萃取分离的选择性。
CH3(CH2)11C≡C-C≡C (CH2)9OPO3HCH2CH2NH2
利用这一性质，将粗制大豆胰蛋白酶抑制剂(STI) (STI)共价偶联在 利用这一性质 ， 将粗制大豆胰蛋白酶抑制剂 (STI) 共价偶联在 PSL表面 制成亲和沉淀介质STI PLS。 STI-PLS重复使用三次 表面， STI重复使用三次， PSL 表面 ， 制成亲和沉淀介质 STI-PLS 。 STI-PLS 重复使用三次 ， 80% 纯化的胰蛋白酶收率保持在80 以上，纯化倍数达5 以上（ 纯化的胰蛋白酶收率保持在80%以上，纯化倍数达5.6以上（结 果见下表） 利用纯化的STI PLS亲和沉淀纯化胰蛋白酶的纯 STI果见下表 ） 。 利用纯化的 STI-PLS 亲和沉淀纯化胰蛋白酶的纯 化倍数达到8 比活达到13000U/mg，接近了纯酶的水平. 13000U/mg 化倍数达到8，比活达到13000U/mg，接近了纯酶的水平.
2.1 亲和双水相分配
传统的双水相体系 （aqueous two-phase extraction） ）
物质在不相溶的两水相间进行分 配，当物质进入双水相体系后，由 于分子键的作用力，使得目标物质 在两相中的浓度不同，从而达到分 离目的。服从Nernst分配定律： Nernst K=CL/CH
CL、CH分别代表溶质在上相、下相中的 浓度。系统固定时，K为一常数。 。
离子强度、温度等） 值、离子强度、温度等）改变 时，生物分子和介质发生可逆 性沉淀的方法称为二次作用亲 和沉淀。也称为场致沉淀。 和沉淀。也称为场致沉淀。
二次作用亲和沉淀
分离过程 见图10-8） （见图 ）
可溶性结合 (一次沉淀 一次沉淀) 一次沉淀
离心
Baidu Nhomakorabea
亲和载体聚合 -蛋白沉淀 物-蛋白沉淀
场致沉淀 (二次沉淀 二次沉淀) 二次沉淀
3.2操作过程： 操作过程： 操作过程
一次作用亲和沉淀
①初始阶段：将水溶性化合物分子载体偶联上亲和配体，亲和 初始阶段： 水溶性化合物分子载体偶联上亲和配体， 载体偶联上亲和配体 配基与目标蛋白质络合形成沉淀。这与抗原-抗体的沉淀作用 配基与目标蛋白质络合形成沉淀。这与抗原 抗体的沉淀作用 相似. 当配基与蛋白质的亲和结合部位的效价比为1时沉淀率 相似 当配基与蛋白质的亲和结合部位的效价比为 时沉淀率 最高 ； 所得的沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，除去杂质； ②所得的沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，除去杂质； 用一种适当的试剂将目标蛋白质从配基中解离出来。 ③用一种适当的试剂将目标蛋白质从配基中解离出来。
W/O
AOT/异辛烷 （W/O）的反胶团萃取，通过调节 值来分级萃取低分子量蛋白质混合物 异辛烷 ） 反胶团萃取，通过调节pH值来分级萃取低分子量蛋白质混合物 AOT:2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠，是一种阴离子 阴离子表面活性剂 阴离子
AOT/异辛烷 （W/O）调节 值，盐浓度进行分级反胶团萃取 异辛烷 ）调节pH值
影响因素
5th 葡萄糖
向水相中添加目标产 物的水溶性亲和配基， 物的水溶性亲和配基 ， 也可抑制目标产物向 反胶团相反分配。例 反胶团相反分配 如，葡萄糖与con A具 有亲和结合作用，在 利 用 OGP进 行 con A 的反胶团萃取时，随 着水相葡萄糖浓度增 大，con A的萃取率下 降。 意义： 意义 ： 利用目标产物 亲和配基的萃取法相 当于亲和层析的特异 洗脱， 洗脱 ， 有利于提高目 标产物的纯度。
面活性剂的分配系 数。如果亲和助表 面活性剂主要存在 于反 于 反 胶 团 相 ， 则mL 非常大，上式简化 为
有 机 相
m A = m0 [1+ cL ,r K d ,r ]
n
实验: 正辛基-β-D-吡喃葡萄糖 实验 正辛基 吡喃葡萄糖 苷 (octyl-β-D-glucopyranoside，OGP)萃取 萃取con A. ， 萃取 1st 提高 提高con A的萃取率和选 的萃取率和选 择性 引入亲和助表面活性剂无 疑是提高反胶团萃取选择 性的有效手段。 性的有效手段 。 如图示， 在OGP的存在下conA的萃 取率增大，而与OGP无亲 和结合作用的核糖核酸酶A 的萃取率不变。
影响因素
4th 盐浓度的影响
与一般的反胶团萃取一 样，亲和反胶团萃取的 目标产物也可通过调节 水相pH和盐浓度进行反 萃 取 。 如 图 8.37 所 示 ， 随着水相盐浓度的增大， 随着水相盐浓度的增大 ， 不管亲和助表面活性剂 添加与否 ， 反胶团相的 对蛋白质的空间排阻作 用增大的结果。 用增大的结果。
•
离子强度敏感型亲和沉淀胰蛋白酶
二十五-10， 二炔 二炔-1-醇磷脂乙醇胺 二十五 ， 12-二炔 醇磷脂乙醇胺 为含有共轭二炔结构单元的双亲性化 合物，其水悬浮液在超声波处理下形 成0.1~0.2um的球形液泡状磷脂双分子 膜，即脂质体(liposome，见图)，表面 为亲水性乙醇胺基团。该脂质体溶液 在紫外线照射下可发生聚合反应，形 成聚合脂质体(polymerized liposome， ， PLS)。 向PLS溶液加入NaCl，当NaCl浓度超 过0.17 mol/dm3 时，在渗透压作用下 PLS发生快速完全的沉淀。离心回收 沉淀后向其中加入水或低浓度盐溶液， 沉淀又重新溶解(分散)。因此，该PLS 该 具有在盐的作用下发生可逆性沉淀的 性质。 性质。
存在问题： 存在问题：
1st 要求配基与目标分子的亲和结合常数较 亲和结合常数较 高 ，沉淀条件难于掌握，适用于多价， 特别是4价以上的蛋白质，与多配基偶 多配基偶 联。 2nd 沉淀的目标分子与双配基的分离有时需 要透析或凝胶过滤等附加工具，实用上 难以规模放大。
解决办法
原理：利用在物理场条件（ 原理：利用在物理场条件（如pH
双水相两相中水分都占很大比例 (85％一95％)，活性蛋白或细胞在 这种环境中不会失活，但可以不同 克服了有机 比例分配于两相，这就克服了有机 溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲 水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。 水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点
PEG=聚已二醇(polyethylene glycol) DX = 葡聚糖(dextran)
亲和反胶团萃取(Affinity-based reversed 亲和反胶团萃取 理论 micellar extraction) 是指在反胶团相中除通常的表面活性剂 亲和反胶团萃取的分配 分配 （如AOT）以外，添加另一种助表面 添加另一种助表面 系数 活性剂(cosurfactant): S-配基 配基，通过 活性剂 配基 n 1 + cL ,r K d ,r 配基与目标分子的亲和作用，促进目标 m A = m0 产物在反胶团相的分配，提高目标产物 1 + cL ,r (mL K d , w ) 的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。 一般将含有配基的助表面活性剂称为亲 其 中 mL 为 亲 和 助 表 和助表面活性剂(affinity co-surafctant)。
例：
• 1983 年 , 利用 bis-NAD 从牛心组织抽提液中纯化了 1983年 bisLDH，收率为90% ， 纯化倍数达48。 但 NAD价格较高， LDH， 收率为 90% 纯化倍数达48。 NAD价格较高， 90 48 价格较高 且易生物降解，难于实现大规模应用。 且易生物降解，难于实现大规模应用。 • 1983年后，人们开始研究利用三嗪色素为配基的一次 1983年后 年后， 作用亲和沉淀法， 作用亲和沉淀法 ， 其中的代表性工作是利用 Procon 制备双配基，亲和沉淀化免肌LDH LDH， Blue H-B的类似物制备双配基，亲和沉淀化免肌LDH， 收率达97 97% 纯度达电泳纯. 收率达97%，纯度达电泳纯.
第10章 亲和分离技术 10章
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亲和萃取 亲和沉淀的基本原理和特点 分子印迹分离技术
2、亲和萃取 、 （ affinity partitioning ）
亲和萃取就是将亲和色谱的亲和配基用于萃取分离。 亲和萃取就是将亲和色谱的亲和配基用于萃取分离。 包括： 包括： • 亲和双水相 • 亲和反胶团
聚合物可逆性溶解 与蛋白质先解离
回 收 聚 合 物
目标分子
聚合物重新 沉淀
3.3 应用
• pH 值敏感型亲和沉淀纯 pH值敏感型亲和沉淀纯 化胰蛋白酶
• 苄脒基为胰蛋白酶的亲和配基， 而苯甲酸基为pH敏感基团，影 响聚合物的溶解度。该聚合物 可溶解于pH>6的水溶液，但当 pH<5时即可发生完全的沉淀。 • 将该聚合物加入到pH8.0的牛 胰抽提液中，充分混合后加酸 至pH4.0，则聚合物-胰蛋白质 酶复合物沉淀。离心回收沉淀 并用pH为4.0的水溶液清洗后， 再加酸至pH2.0，即可洗脱回 可逆性溶解聚合物（SIS）见表10 10可逆性溶解聚合物（SIS）见表10-12 收胰蛋白酶。利用该方法纯化 牛胰蛋白酶的收率为76%，纯 度提高5.4倍，达92%