高效液相色谱法测定硫酸特布他林与

引
言
实验部分
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分析化学
第 38 卷
2. 2 2. 2. 1
实验方法
10 样品的制备和净化 将 Alsever 液混悬的红细胞 0. 2 mL （ 含红细胞 1. 2 × 10 个 ） 置于 2 mL PE 管中， 分别准确加入普萘洛尔标准工作液与特布他林标准工作液 ， 或者单独加入其中一种药物， 然后
1. 特布他林（ Terbutaline） ； 2. 普萘洛尔（ Propranolol） 。
药物浓度（ x ） 进 行 线 性 回 归， 得 特 布 他 林 与 普 萘 洛 尔 的 线 性 方 程 分 别 为 y = 5 . 389 x + 5 . 3577 ， r = 0. 9999 ； y = 0 . 257 x + 0 . 0082 ， r = 0. 9998 。以基线信噪比的 3 倍测定检出限（ LOD） ， 本法针对特布他 林与普萘洛尔的检出限分别为 1. 0 μg / L 和 3. 0 μg / L。 分别于 Alsever 液中加入特布他林或普萘洛尔， 使终浓度均为 0. 30 mg / L， 各平行处理 6 份， 进样测定， 计算峰面积的 RSD 分别为 0. 8% 和 1. 2% 。 3. 6 特布他林与细胞膜受体的特异性结合 利用高效液相色谱法测定与细胞膜受体作用后游离药物浓度 ， 加入药物量与游离药物量之差即为 结合药物量。据此， 即可测定出特布他林与红细胞膜 β2 肾上腺素受体的结合量。取一系列浓度的特布 他林溶液 100 μL， 分别加入到 0. 2 mL Alsever 液混悬的红细胞中， 各个浓度的样品平行处理 6 份， 其中 3 份同时加入 100 mg / L 普萘洛尔 100 μL， 另外取 3 份空白的 Alsever 液混悬的红细胞， 只加入 100 mg / L 普萘洛尔 100 μL ， 再取 2 份空白的 Alsever 液混悬的红细胞， 所有反应管均补加 Alsever 液至 0. 5 mL， 振 1500 r / min 离心 5 min， 荡混匀后， 将混悬液均置于 37 ℃ 水浴振荡保温反应 1 h ， 取出， 吸取上清液 0. 2 mL， 于此上清液中加入 0. 2 mL 甲醇， 混悬均匀， 静置 10 min 后 13000 r / min 离心 5 min。 取上清液 20 μL 注入高效液相色谱仪测定游离药物浓度 。测定结果见表 1 。结果表明， 特布他林的非特异性结合 与特异性结合均随加入量的增加而增大 ， 同时加入硫酸特布他林和普萘洛尔组结合量明显高于单独加 ， 入硫酸特布他林组 提示特布他林与普萘洛尔在红细胞膜受体上的结合位点可能不同 。
补加 Alsever 液至 0. 5 mL，混匀。将此混悬液置于 37 ℃ 水浴振荡保温反应 1 h， 取出， 以 1500 r / min 离 心5 min， 吸取上清液 0. 2 mL， 于此上清液中加入等体积的甲醇， 用于除去其中可能混有的少量蛋白质 13000 r / min 离心5 min， 成分。混悬均匀， 取上清液待测。 2. 2. 2 色谱条件 Hypersil C18 色谱柱（ 250 mm × 4. 6 mm，10 μm ） ； 流动相为 0. 020 mol / L KH2 PO4 溶 pH 5. 1 ） 液（ 含 0. 25% 三乙胺， 甲醇（ 20∶ 80 ，V / V ） ，流速为 1. 0 mL / min； 检测器为荧光检测器， 激发波 长 280 nm， 发射波长 320 nm； 柱温 30 ℃ ； 进样量 20 μL。
峰附近有一个干扰峰， 而且通过调节流动相比例的方法无法将其与特布他林达基线分离 ， 如果将其与特 布他林达基线分离， 普萘洛尔又不能被洗脱下来， 而且保留时间太长， 色谱采样时间必须在 30 min 以 上， 效率较低。改用荧光检测器后， 检测的灵敏度提高了 100 倍（ 定量限达到 1. 5 μg / L） ， 同时空白红细 胞样品中的杂质峰没有荧光吸收 ， 不存在对特布他林检测的干扰， 整个采样时间只需要 12 min， 检测效 率明显提高。色谱分离结果见图 1 。 3. 5 线性范围、 检出限和重现性 于 Alsever 液中分别加入不同浓度的特布他林和普萘洛尔标准溶液 ， 制得样品中分别含有 2 种药物 0. 030 ， 0. 100 ， 0. 300 ， 1. 000 和 3. 000 mg / L 的系列溶液， 分别进样测定， 以峰面积（ y） 对 浓度为 0. 010 ，
表 1 特布他林与红细胞膜 β2 受体结合量测定结果（ n = 3 ） Table 1 Results of combining capacity of terbutaline with β2 adrenergic receptor in erythrocyte membrane
第3 期
蒋心惠等： 高效液相色谱法测定硫酸特布他林与红细胞膜表面 β2 肾上腺素受体结合量
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图1 Fig.wenku.baidu.com1
空白红细胞（ A） ， 对照品（ B） 和红细胞样品（ C） 的色谱图 Chromatogram of blank erythrocyte（ A） ，standards（ B） and erythrocyte sample（ C）
第 38 卷 2010 年 3 月
分析化学（ FENXI HUAXUE）
研究简报
第3 期 377 ～ 380
Chinese Journal of Analytical Chemistry
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研究简报
DOI： 10. 3724 / SP. J. 1096. 2010. 00377
（ 重庆医科大学药学院，重庆 400016 ） 建立了高效液相色谱同时检测红细胞混悬液中硫酸特布他林与盐酸普萘洛尔的方法 。 红细胞与特
布他林在 37 ℃ 水浴振荡保温反应 1 h 后， 没有与细胞膜受体结合的特布他林通过 1500 r / min 离心 5 min 后分 离， 取上清液与受体药物复合物分离。 色谱柱为 C18 柱， 以 0. 020 mol / L KH2 PO4 溶液 （ 含 0. 25% 三乙胺， pH 5. 1 ） 甲醇（ 20∶ 80 ，V / V） 为流动相， 在荧光激发波长 280 nm， 发射波长 320 nm 处测定样品含量。在优化的 条件下， 特 布 他 林 与 普 萘 洛 尔 在 0. 010 ～ 3. 000 mg / L 范 围 内 线 性 关 系 良 好， 相 关 系 数 分 别 为 0. 9999 和 0. 9998 。测定重复性相对标准偏差为 0. 8% 和 1. 2% ； 检出限分别为 1. 0 和 3. 0 μg / L。 该方法安全、 简便、 灵 敏， 适用于测定红细胞中硫酸特布他林和受体配体结合实验的研究 。 硫酸特布他林； 盐酸普萘洛尔； 红细胞膜； β2 肾上腺素受体； 高效液相色谱
20090816 收稿； 20091108 接受 本文系国家自然科学基金（ No. 30572353 ） 资助项目 * Email： cqzhouqx@ yahoo. com. cn
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摘 要 关键词
高效液相色谱法测定硫酸特布他林与 红细胞膜表面 β2 肾上腺素受体结合量
蒋心惠 周岐新
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仪器与试剂 1100 高效液相色谱仪（ 美国 Agillent 公司 ） ， 配备荧光检测器。 Hypersil C18 柱 （ 250 mm × 4. 6 mm， 10 μm， 大连伊利特分析仪器有限公司） 。 KH2 PO4 、 H3 PO4 、 NaOH（ 优级纯 ） ； 柠檬酸、 NaCl （ 分析 甲醇（ 色谱纯） ； 三乙胺、 柠檬酸三钠、 葡萄糖、 纯） 。实验用水为超纯水。硫酸特布他林和盐酸普萘洛尔购自中国药品生物制品检定所 ， 分别以超纯 水配成 1000 mg / L 的储备液， 临用时根据需要以 Alsever 液逐级稀释为标准工作液。Alsever 液： 称取柠 NaCl 0. 42 g， 檬酸三钠 0. 80 g， 柠檬酸 0. 05 g， 葡萄糖 2. 05 g ， 加入超纯水溶解， 用 H3 PO4 调至 pH 7. 40 。 再加超纯水至 100 mL， 高温灭菌后置于冰箱中 4 ℃ 保存备用。
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3. 1
结果与讨论
药物与细胞膜受体的反应平衡时间的测定
本实验的目的是测定药物与其特异受体的结合特性 ， 采用正常人体温 37 ℃ 为反应温度， 其达到平 衡所需要的时间通过药物与受体的结合程度 ， 也就是含有红细胞膜的 Alsever 液中游离药物的浓度变化 30 ， 60 和 90 min 时， 5842 ， 5843 和 来体现。实验结果表明， 保温时间为 15 ， 游离药物峰面积分别为 6253 ， 5865 。由此可见， 特布他林与红细胞膜受体的结合随水浴加热时间的延长而增加， 但加热到 60 min 后 结合已达平衡， 再延长加热时间， 结合率并没有明显增加， 所以本实验选用加热 60 min 作为特布他林与 红细胞膜受体的反应平衡时间。 3. 2 红细胞破膜与否的选择 红细胞膜经过低渗溶液破裂后， 用生理盐水洗涤除去水溶性杂质至细胞膜层呈肉红色 ， 同时上清液 ， 。 5 mg ， Alsever 200 L ， 呈无色 低温冷冻干燥细胞膜 称取干燥后的细胞膜样品 加入 液 μ 混匀， 再分别准 确加入普萘洛尔标准工作液与特布他林标准工作液 100 μL， 或者单独加入其中一种药物 100 μL， 然后 1500 r / min 离心 补加 Alsever 液至 0. 5 mL。 混匀， 将此混悬液置于 37 ℃ 水浴振荡保温反应 1 h， 取出， 5 min，吸取上清液 0. 2 mL， 于此上清液中加入等体积的甲醇， 用于除去其中可能混有的少量蛋白质成 13000 r / min 离心 5 min，取上清液待测。将此测定结果与未破裂的完整红细胞同法处理 分， 混悬均匀， 的测定结果进行比较。结果表明， 红细胞破裂后所测定得到的非特异结合量明显高于完整红细胞的非 特异结合量， 而特异结合量则减少。 3. 3 净化条件的选择 药物与细胞膜受体结合形成的复合物为大分子物质 ， 易溶于水而不溶于甲醇等有机溶剂中 ， 而本实 验采用的是反相高效液相色谱法 ， 流动相中使用了大量的甲醇， 如果不将水溶性的大分子物质分离， 在 样品注入色谱柱后， 大分子的物质会沉淀而堵塞色谱柱。同时， 已经与受体结合的药物也可能解离。因 此， 净化条件的优劣对测定结果影响很大。考察离心后上清液直接进样， 离心后上清液加入不同量的甲醇 沉淀水溶性的大分子物质， 高速离心后再进样等实验条件所得色谱分离效果及色谱分离时柱压的变化情 况， 得到样品的净化条件即结合反应后的上清液与甲醇 （ 1∶ 1 ，V / V） 混合处理， 分离效果好， 柱压稳定。 3. 4 检测器的选择及专属性 276 nm 波长处检测， 采用紫外检测器， 在进行样品测定时， 发现空白红细胞样品中在特布他林色谱
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受体是存在于细胞膜、 细胞浆或细胞核上的大分子化合物 （ 如蛋白质、 核酸、 脂质等 ） ， 能与特异性 配体（ 药物、 递质、 激素、 内源性活性物质等 ） 结合并产生效应。 受体上能与配体相结合的活性基团， 称 为受点或位点。配体与受体结合是药物发挥临床疗效的基础 。肾上腺素受体存在于细胞膜， 而红细胞 膜表面存在特异的肾上腺素 β2 受体。特布他林是特异性的肾上腺素 β2 受体激动剂， 而普萘洛尔为非 选择性肾上腺素 β 受体的阻断剂， 与肾上腺素 β2 受体亲和力较高。 ［ 1 ～ 3］ ， 目前， 关于受体与配体的结合情况研究的经典方法是放射性受体配体结合法 即采用已用放射 性元素标记的药物与特异的受体蛋白或者含有某类受体的组织共同作用一段时间后 ， 分离未结合的标 ［ 4 ～ 6］ 。由于放射性元素在检测 记药物， 测定受体蛋白或者组织的放射性 ， 从而得出受体配体的结合情况 和后处理时存在环境污染和对人体的伤害 。本研究采用对人体无害的兼具有分离与分析功能的高效液 相色谱法检测游离药物量。结果表明， 特布他林与红细胞膜受体的非特异性结合高于特异性结合量 。