基因载体的选择与构建总结
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
基因工程知识点总结
基因工程总结一．概念(1)原理：。
(2)优点：与杂交育种相比，；与诱变育种相比，。
（3）基因工程成功的原因：①成功拼接的原因：②成功表达的原因：二．基本工具1、两种酶：(1)：作用特点：。
(2)：E ·coli DNA 连接酶与T 4 DNA 连接酶的区别：2、一种运载体（1）条件：①；②；③具有特殊的标记基因（作用：）（2）种类：最常用；其他动植物病毒、三、操作程序(1)：方法：①：不知道脱氧核苷酸序列②：已知目的基因两端一小段序列，便于③利用化学方法人工合成：知道全部序列，且基因比较小。
这种方法不需要模板。
(2)——基因工程的核心基因表达载体的组成：(3)生物种类常用方法受体细胞将目的基因插入到Ti 植物动物受精卵将含有目的基因的表＋微生物原核细胞Ca 2处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 分子质粒的T-DNA 上→农达载体提纯→取卵转化过程杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得色体的DNA 上→表达具有新性状的动物(4)①目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA 上：②是否转录：③是否翻译：④个体水平鉴定：抗虫、抗病接种实验易错点说明：1、切割目的基因和运载体的要求：用限制酶。
目的是：。
同种的含义是：同一种或相同两种，即单酶切或双酶切。
选择双酶切的原因是。
2、工具≠工具酶；运载体≠质粒。
3、启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
启动子：。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
4、基因探针的要求：①单链②有③5、农杆菌转化法中的“2”次导入：第一次：将含有目的基因的T—DNA的质粒导入农杆菌；第二次（非人工操作）：将含有目的基因的T—DNA导入受体细胞并整合到植物细胞的染色体DNA上。
6、转化：。
生物选修三知识点总结
生物选修三知识点总结生物选修三是高中生物课程中的重要组成部分，涵盖了现代生物技术的多个方面。
以下是对生物选修三知识点的详细总结。
一、基因工程基因工程，又称为 DNA 重组技术，是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
（一）工具1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）：能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
2、 DNA 连接酶：连接两个 DNA 片段，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
3、载体：常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
载体需要具备的条件有：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA 片段插入；具有标记基因，便于重组DNA 的筛选。
（二）基本操作步骤1、目的基因的获取：从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增、人工合成。
2、基因表达载体的构建：这是基因工程的核心步骤，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
3、将目的基因导入受体细胞：导入植物细胞常用农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；导入动物细胞常用显微注射法；导入微生物细胞常用感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：分子水平的检测包括检测转基因生物染色体的 DNA 上是否插入了目的基因、检测目的基因是否转录出了mRNA、检测目的基因是否翻译成蛋白质；个体水平的鉴定包括抗虫或抗病的接种实验等。
二、细胞工程（一）植物细胞工程1、植物组织培养：在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
2、植物体细胞杂交：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
（二）动物细胞工程1、动物细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
载体构建连接实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过载体构建和连接技术，将目的基因与载体成功连接，构建一个含有目的基因的重组质粒。
此实验是基因工程中的重要步骤，对于后续的基因表达、蛋白质纯化等研究具有重要意义。
二、实验原理载体构建连接实验主要包括以下几个步骤：1. 目的基因的获取：通过PCR扩增或化学合成等方法获得目的基因。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，并对其进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：利用DNA连接酶将目的基因与线性化载体连接，形成重组质粒。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：通过PCR、酶切分析等方法筛选出含有目的基因的重组质粒。
三、实验材料1. 实验试剂：PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、碱性磷酸酶（CIP）、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心机、超净工作台等。
3. 实验材料：目的基因模板、载体质粒、感受态细胞等。
四、实验方法1. 目的基因的获取：根据目的基因的序列设计PCR引物，进行PCR扩增。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，用限制性内切酶进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：a. 将目的基因和线性化载体进行PCR扩增，获得双链DNA。
b. 用Klenow片段或T4 DNA聚合酶将PCR产物进行末端修复，使末端具有3'-羟基。
c. 用CIP处理线性化载体，去除5'-磷酸基团。
d. 将目的基因和线性化载体进行连接反应，加入DNA连接酶。
e. 将连接产物进行PCR扩增，验证连接成功。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：a. 将连接产物转化感受态细胞，涂布于含抗生素的琼脂平板上。
b. 在37℃恒温箱中培养过夜。
c. 挑取单菌落进行PCR扩增，验证重组质粒的存在。
d. 对重组质粒进行酶切分析，确认目的基因已插入载体。
第4章 载体的选择与构建
大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。
pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元
高中生物选修一二知识点总结
高中生物选修一二知识点总结一、生物选修一知识点总结1. 基因工程- 基因工程的概念：通过人工手段对生物体的基因进行改造的技术。
- 基因工程的操作步骤：包括目标基因的获取、载体的选择与构建、基因的导入、筛选与培养。
- 转基因技术的应用：提高作物产量、改良作物品质、生产生物药物等。
2. 细胞工程- 细胞工程的定义：利用生物学原理和工程技术手段，对细胞进行改造和利用。
- 细胞培养技术：包括原代培养和传代培养。
- 细胞融合技术：通过融合技术产生杂交细胞，用于生产单克隆抗体等。
3. 酶工程- 酶的基本概念：生物体内催化化学反应的蛋白质或RNA。
- 酶的分类与特性：根据反应类型分为氧化还原酶、转移酶等。
- 酶的应用：工业生产、洗涤剂制造、食品加工等。
4. 发酵技术与应用- 发酵技术的原理：利用微生物的代谢活动生产有用的产品。
- 发酵过程的控制：温度、pH、氧气供应等。
- 发酵产品：酒类、酱油、醋、抗生素等。
5. 生物多样性与保护- 生物多样性的概念：生物种类、基因和生态系统的多样性。
- 生物多样性的价值：生态价值、经济价值、文化价值。
- 生物多样性的保护措施：就地保护、迁地保护、法律法规等。
二、生物选修二知识点总结1. 生态系统的结构与功能- 生态系统的组成：生产者、消费者、分解者和非生物物质与能量。
- 生态系统的功能：物质循环、能量流动。
- 生态系统的稳定性：抵抗力稳定性和恢复力稳定性。
2. 人口与环境- 人口增长对环境的影响：资源消耗、环境污染、生物多样性减少。
- 可持续发展的概念：满足当代人需求的同时不损害后代人满足需求的能力。
- 可持续发展的策略：节能减排、绿色经济、循环利用等。
3. 能源与资源的利用- 可再生能源：太阳能、风能、水能等。
- 非可再生能源：石油、煤炭、天然气等。
- 资源的合理利用与节约：循环经济、绿色建筑、节能减排等。
4. 环境污染与治理- 环境污染的类型：水污染、大气污染、土壤污染等。
生物高中生物选修1知识点总结
生物高中生物选修1知识点总结一、绪论1. 生物技术的定义与分类生物技术是指利用生物学原理和方法，对生物体及其组分进行操作、改造和利用的技术。
生物技术主要包括基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程等。
2. 生物技术发展简史生物技术的发展经历了传统生物技术和现代生物技术两个阶段。
传统生物技术主要包括酿造、发酵等；现代生物技术则以基因工程、细胞工程等为核心。
二、基因工程1. 基因工程的原理与方法基因工程是通过分子生物学的方法，将目的基因从一个生物体转移到另一个生物体中，使之产生新的遗传特性。
基因工程的基本步骤包括：目的基因的获取、基因载体的选择与构建、受体细胞的转化、转化细胞的筛选与鉴定。
2. 基因表达载体的构建基因表达载体是基因工程中用于携带目的基因并将其导入受体细胞的工具。
常用的基因表达载体有质粒、噬菌体、病毒等。
3. 基因工程的应用基因工程在农业、医药、环保等领域具有广泛的应用。
例如：转基因作物、转基因动物、基因治疗等。
三、细胞工程1. 细胞工程的基本技术细胞工程是指利用细胞生物学原理和方法，对细胞进行操作、改造和利用的技术。
细胞工程的基本技术包括：细胞培养、细胞融合、细胞拆合等。
2. 动物细胞工程动物细胞工程主要包括动物细胞培养、细胞融合、细胞拆合等技术。
动物细胞工程在制备单克隆抗体、生产疫苗等方面具有重要作用。
3. 植物细胞工程植物细胞工程主要包括植物组织培养、原生质体融合等技术。
植物细胞工程在植物繁殖、遗传改良等方面具有广泛应用。
四、发酵工程1. 发酵工程的原理发酵工程是利用微生物的代谢活性，在生物反应器中进行大规模生产的技术。
发酵工程的原理主要包括：微生物的代谢、发酵条件优化、生物反应器设计等。
2. 发酵过程的主要参数发酵过程中，需要关注的主要参数有：温度、pH、溶氧、搅拌速度、发酵液浓度等。
3. 发酵工程的应用发酵工程在食品、饮料、医药、环保等领域具有广泛应用。
例如：啤酒生产、抗生素生产、生物燃料生产等。
基因治疗的实验流程与操作步骤
基因治疗的实验流程与操作步骤基因治疗是一种通过在人体内引入、修复或替代缺陷基因来治疗遗传性疾病的方法。
这一领域的研究和开发已经取得了许多重要的突破，为许多患者提供了新的治疗方案。
在进行基因治疗时，研究人员需要按照一系列特定的实验流程和操作步骤进行操作。
本文将详细介绍基因治疗的实验流程和相关操作步骤。
1. 遗传疾病的诊断与基因定位在进行基因治疗之前，首先需要进行遗传疾病的诊断。
通过对患者的病史、家族病史和临床表现进行分析，确定患者是否患有遗传性疾病。
如果确认患者患有遗传性疾病，接下来需要进行基因定位，即确定导致疾病的具体基因突变位置。
2. 基因治疗的载体选择与构建基因治疗通常需要使用载体来将治疗基因输送到患者的细胞中。
常用的载体包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体通常具有高度传染性和较高的基因转导效率，而非病毒载体相对较安全。
研究人员需要选择合适的载体并进行构建，将治疗基因插入载体中。
3. 基因治疗载体的扩增与提纯构建好的基因治疗载体需要进行扩增以获取足够的量。
通常使用细菌或哺乳动物细胞进行大规模扩增。
扩增后，载体需要经过提纯过程去除杂质，得到纯净的载体。
4. 细胞培养与基因治疗载体转染在进行基因治疗之前，需要进行细胞培养以获取足够的目标细胞。
根据不同的研究需求，可以选择不同类型的细胞进行培养。
常用的细胞包括体外培养的细胞系和患者体内采集到的细胞。
细胞培养完成后，需要将基因治疗载体转染到目标细胞中。
5. 基因治疗载体在细胞中的表达与功能验证转染完成后，需要验证基因治疗载体在细胞中的表达情况以及是否具有治疗效果。
可以通过检测携带治疗基因的载体在细胞内的表达水平，以及观察是否能够修复目标基因的功能缺陷。
这些验证实验可以在细胞层面和动物模型上进行。
6. 动物模型的建立与基因治疗效果评估基因治疗的效果通常需要在动物模型上进行评估。
研究人员可以选择合适的动物模型，如小鼠、大鼠或猪等。
构建好的载体可以通过注射或其他途径直接引入动物体内。
基因表达载体的构建方法
基因表达载体的构建方法
基因表达载体是一种用来传递外源基因并在宿主细胞中表达的工具。
构建基因
表达载体是基因工程研究中的重要一环，下面将介绍基因表达载体的构建方法。
首先，选择合适的载体。
常见的基因表达载体包括质粒、病毒等。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、稳定性、复制能力、宿主范围等因素，确保选择的载体能够满足所需的表达要求。
其次，准备外源基因。
外源基因可以通过PCR扩增、化学合成等方法获取。
在获取外源基因时，需要考虑基因的大小、序列的一致性、是否含有启动子、终止子等重要元件。
接下来，进行连接。
将外源基因与载体进行连接，通常采用限制性内切酶切割
和连接酶的作用，将外源基因与载体进行粘连连接，形成重组载体。
然后，进行转化。
将构建好的基因表达载体导入宿主细胞中，通常采用化学法、电穿孔法、病毒载体法等方法进行转化，确保外源基因能够成功地表达。
最后，筛选和鉴定。
通过抗生素筛选、酶切鉴定、测序等方法对构建好的基因
表达载体进行筛选和鉴定，确保所构建的基因表达载体能够稳定、高效地表达外源基因。
在构建基因表达载体的过程中，需要注意实验操作的严谨性和规范性，确保实
验结果的准确性和可重复性。
同时，还需要根据具体的研究需求和实验条件，选择合适的构建方法和实验方案，以确保构建的基因表达载体能够满足所需的表达要求。
总的来说，构建基因表达载体是基因工程研究中的重要一环，通过选择合适的
载体、准备外源基因、进行连接、转化、筛选和鉴定等步骤，可以构建出稳定、高效地表达外源基因的基因表达载体，为基因工程研究和应用提供重要的工具和平台。
第三章 基因载体的选择与构建 4
第三章基因载体的选择与构建内容提要•基因载体、报告基因与载体致死效应的概念•细菌质粒载体•噬菌体载体•酵母细胞克隆载体与酵母人工染色体•动物病毒载体•植物病毒载体第一节基因载体、报告基因与载体致死效应的概念一、基因载体外源DNA离开染色体是不能自主进行复制的，必须插入到复制子DNA中，做为复制子的一部分在受体菌中进行复制。
基因载体：指将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具。
根据其来源分为：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体等。
根据主要用途分为：克隆载体和表达载体。
根据性质分：温度敏感型载体、融合型表达载体、非融合型表达载体等。
载体的功能：1、运载目的基因进入宿主细胞。
2、为外源基因提供复制能力和整合能力。
3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的共性：1、能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。
当外源基因插入其DNA后，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性；2、易于从宿主细胞中分离，进行纯化；3、载体DNA序列中有适当的限制性酶切位点，最好是单一的酶切位点，并位于DNA复制的非必需区域内，可以在该位点上任意插入各种外源DNA片段，而不影响载体自身DNA的复制；4、具有能够观察的表性特征（报告基因或选择标记），在插入外源DNA后，这些特征可作为重组DNA的选择标志。
二、载体的报告基因基因工程中常利用载体上特地引入的一些具有特殊标志意义的基因，可证明载体已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其它细胞中识别区分甚至挑选出来。
这种具有标志意义的基因就称为报告基因或标记基因。
常用的报告基因：抗药性基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-半乳糖苷酶基因、人生长激素基因以及发光基因等。
三、载体的致死效应利用质粒或噬菌体载体进行基因克隆时，有时大量的克隆化基因（基因的合成消耗宿主细胞的营养和能量）和克隆化基因产物对宿主来说是有害的。
例如，大量表达的目的蛋白质能抑制宿主菌的生长，有的会使宿主菌中毒死亡，这就是载体的致死效应。
载体构建实验报告模板
载体构建实验报告模板实验目的本实验旨在探究不同载体构建的效果，并评估其在基因转染中的表现。
实验原理1. 载体构建：选择合适的载体，将目标基因序列插入载体中，然后经过酶切和连接等步骤构建完整的载体。
2. 细胞培养：选择适合的细胞系，进行细胞培养，使其处于最佳的生长状态。
3. 基因转染：将构建好的载体转染至目标细胞，使目标细胞表达目标基因。
实验步骤1. 载体构建- 根据实验需要，选择适合的载体。
常用的载体有质粒、病毒等。
- 执行酶切。
将载体和目标基因进行相应的酶切，并进行凝胶电泳以确认切割效果。
- 进行连接。
将切割好的载体与目标基因连接，生成完整的载体。
- 进行质粒提取，获取纯化后的载体。
2. 细胞培养- 根据实验需要，选择合适的细胞系进行培养。
常用的细胞系有HEK293、CHO等。
- 预处理培养皿。
将培养皿用70%乙醇消毒后，进行干燥。
- 细胞解冻。
取出冻存的细胞，放置在37摄氏度恒温培养箱中，使其迅速解冻。
- 细胞培养。
将解冻后的细胞转移到预处理的培养皿中，加入合适的培养基，使其在恒温培养箱中继续培养。
3. 基因转染- 收集细胞。
在细胞密度达到一定程度后，停止细胞培养，收集细胞供后续转染使用。
- 转染操作。
根据实验要求，选择不同的转染方法，如细胞破裂法、化学转染法等。
- 转染后处理。
转染一定时间后，根据实验需要，对细胞进行相关的处理，如加入抗生素筛选等。
- 观察结果。
根据实验设计，选取适当的时间点，观察目标基因的表达情况。
实验结果与分析1. 载体构建结果- 根据酶切和凝胶电泳结果，确认目标基因成功插入载体中。
- 质粒提取结果良好，获得了纯化的载体。
2. 基因转染结果- 观察细胞形态，发现转染后的细胞形态与未转染的细胞有所不同。
- 进行目标基因表达定量分析，发现转染组的表达量明显高于对照组。
- 进行功能性实验，如细胞增殖、凋亡等，发现转染组在某些方面与对照组有明显的差异。
实验总结通过本实验，我们成功构建了目标基因载体，并将其转染至细胞中。
基因表达载体的构建步骤
基因表达载体的构建步骤
基因表达载体的构建步骤：
①目的基因获取首先需从cDNA文库基因组DNA中PCR扩增出所需片段或通过化学合成方法得到纯净的目的基因；
②载体骨架选择根据后续实验需求如原核表达真核细胞表达植物动物体内表达等挑选合适质粒作为载体骨架；
③双酶切处理使用限制性内切酶对载体DNA进行特异性切割产生与目的基因相同的粘性末端或平末端便于连接；
④凝胶电泳检测将酶切产物加入琼脂糖凝胶中通过电泳分离出预期大小片段并用EB染色紫外灯照射观察；
⑤回收纯化利用商业化试剂盒或自制酚氯仿异丙醇沉淀法回收去除杂蛋白小分子RNA等杂质获得高纯度DNA；
⑥DNA连接取等摩尔浓度的目的基因与载体在T4DNA连接酶缓冲液中孵育过夜使两者以磷酸二酯键相连；
⑦大肠杆菌转化将连接产物热击转入感受态细胞中涂布含相应抗生素的选择平板37度培养箱过夜长出克隆；
⑧阳性克隆筛选挑取单菌落PCR鉴定插入片段大小测序比对确认无误后扩大培养提取质粒保存备用；
⑨启动子匹配根据目的基因表达调控需要从启动子文库中选出与宿主细胞相容性好诱导性强的启动子片段；
⑩多顺反子构建有时为了实现联合表达还需将多个基因串联起来形成多顺反子结构其间用IRES元件连接；
⑪终止子添加在多顺反子3'端加上终止子序列帮助RNA聚合酶识别转录终止位点防止下游基因串扰；
⑫安全评估构建好完整表达载体后还需对其遗传稳定性毒性免疫原性进行评估确保对人体环境友好无害。
基因治疗中的基因载体开发与筛选技术
基因治疗中的基因载体开发与筛选技术概述：基因治疗是一种前沿的生物医学技术，旨在通过修复、替换或抑制异常基因来治疗各种遗传性疾病和某些获得性疾病。
在基因治疗过程中，选择适合的基因载体非常重要，因为它承载了需要传递的基因序列。
基因载体的开发与筛选技术在基因治疗中起着关键作用。
本文将探讨基因载体的开发与筛选技术，包括常用的基因载体类型、载体的设计和构建方法，以及相关的筛选技术。
1. 常用的基因载体类型基因载体是传递基因序列的工具，常用的基因载体类型包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒。
这些病毒具有高传染性和高转染效率，可以有效地将基因序列引入宿主细胞。
非病毒载体则包括质粒、合成纳米颗粒和液晶等，其传递效率较低，但具有较低的免疫原性和较高的容积产能。
2. 基因载体的设计和构建方法基因载体的设计和构建方法直接影响了其有效性和安全性。
对于病毒载体，常用的方法包括逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法、基因重组技术和病毒改造技术。
通过这些方法，可以将目标基因序列嵌入到病毒基因组中，并调控其表达水平。
非病毒载体的构建则通常涉及到质粒构建、载体包裹和修饰。
3. 基因载体的筛选技术为了确保基因载体的传递效率和稳定性，需要进行筛选。
常用的基因载体筛选技术包括荧光筛选、抗生素选择和PCR筛选等。
荧光筛选通常通过将荧光标记的基因与载体结合，以观察基因载体传递效果。
抗生素选择则是在质粒中引入抗生素抗性基因，通过抗生素的添加来筛选成功转染的细胞。
PCR筛选则是利用特定引物和扩增条件，扩增出目标基因的片段以鉴定是否成功导入。
4. 基因载体开发与筛选技术的应用基因载体开发与筛选技术在基因治疗领域具有广泛的应用。
例如，在癌症治疗中，使用病毒载体将抑癌基因引入肿瘤细胞，从而达到治疗的效果。
在遗传疾病治疗中，通过质粒载体将正常基因导入患者体内，以修复或替代受损的基因。
此外，基因载体开发与筛选技术也可以用于研究基因功能、生物标记物的检测和基因工程等领域。
酵母菌表面展示操作步骤之目标基因构建与载体构建
酵母菌表面展示操作步骤之目标基因构建与载体构建目标基因构建与载体构建是酵母菌表面展示操作的重要步骤。
在进行酵母菌表面展示实验之前，需要对目标基因进行构建，同时选择合适的载体进行基因的插入和转化。
本文将详细介绍目标基因构建与载体构建的操作步骤。
一、目标基因构建1.基因获取：首先需要从合适的来源中获得目标基因的DNA序列，可以通过基因合成、PCR扩增或从其他细菌或真菌中提取得到。
2.引物设计：根据目标基因的DNA序列设计引物。
引物需包含适当长度的序列和兼容于载体的限制性内切酶切位点。
3.PCR扩增：将目标基因的DNA序列用引物进行PCR扩增，得到PCR产物。
PCR反应体系的设计需依据PCR试剂盒的要求进行。
4.酶切与连接：根据PCR产物的长度和限制性内切酶切位点的位置，选择合适的限制性内切酶对PCR产物进行酶切。
然后使用DNA连接酶将酶切产物连接到合适的载体上。
5.转化：将连接好的目标基因载体构建物转化到合适的宿主酵母菌中。
转化方法可以是化学法，也可以是电转法。
6.鉴定：将转化后的酵母菌进行筛选和鉴定，通过PCR、酶切鉴定或测序确认目标基因是否成功构建到酵母菌中。
二、载体构建1.载体选择：根据实验需要和目标基因的特性选择合适的载体。
常见的载体有质粒、表达载体和融合载体等。
根据酵母菌表面展示的要求，选择带有适当信号肽序列的表达载体。
2.载体线性化：将选择好的载体进行限制性内切酶切，得到线性化的载体。
酶切位点需确保不影响目标基因的插入。
3.目标基因插入：将目标基因与线性化的载体进行连接。
连接方法可以是连接酶，也可以是依靠重叠延伸原理进行连接。
连接反应需进行相关的酶切鉴定和测序验证。
4.转化：将连接好的载体构建物转化到合适的宿主酵母菌中，转化方法可选择化学法或电转法。
5.鉴定：转化后的酵母菌进行筛选和鉴定，通过PCR、酶切鉴定或测序确认目标基因是否成功插入到载体中。
总结：目标基因构建与载体构建是酵母菌表面展示操作的重要步骤。
基因表达载体的构建
02
转化后，目的基因需要在宿主 细胞中复制和表达，这一过程 需要适当的诱导剂和调控元件 。
03
表达产物可以是目的基因的蛋 白质产物，也可以是RNA产物 ，具体取决于目的基因的性质 和实验需求。
表达产物的检测
01 表达产物的检测可以通过免疫学方法、生物化学 方法、分子生物学方法等多种手段进行。
02 检测的目的包括确定目的基因是否成功表达、表 达产物的性质和含量等。
基因表达载体的构建
• 基因表达载体概述 • 基因表达载体构建流程 • 克隆基因的表达 • 基因表达载体的应用与展望
01
基因表达载体概述
基因表达载体的定义
基因表达载体是用于将目的基因导入 细胞并使其表达的载体，通常由质粒 或病毒等构成。
它能够将目的基因带到细胞内，并在 细胞内复制和扩增，从而使目的基因 在细胞内得到表达。
THANKS
感谢观看
01
宿主细胞应具备繁殖快速、容易培养、容易转染等 特性，以便于基因表达产物的生产。
02
宿主细胞应具备低免疫原性，以减少免疫反应对基 因表达产物的影响。
03
宿主细胞应具备对表达产物的加工和分泌能力，以 便于表达产物的纯化和收集。
转化与表达
01
转化是将目的基因导入宿主细 胞中的过程，常用的方法有电 穿孔法、显微注射法、脂质体 法等。
02
基因表达载体构建流程
选择克隆位点
确定目的基因的长度和结构
01
根据基因序列，选择合适的克隆位点，确保目的基因的完整性
和功能性。
考虑载体的大小和性质
02
根据实验需求，选择适合的载体，确保载体能够容纳目的基因
并具有所需的特性。
确定克隆位点的位置
高中生物基因工程知识点总结
高中生物基因工程知识点总结基因工程是现代生物技术的核心领域之一，在高中生物课程中占据着重要的地位。
它是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
接下来，我们将对高中生物基因工程的相关知识点进行详细总结。
一、基因工程的工具1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）限制酶能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
限制酶具有特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。
2、 DNA 连接酶DNA 连接酶的作用是将两个具有相同末端的 DNA 片段连接起来，形成磷酸二酯键。
常用的 DNA 连接酶有 E·coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。
3、载体载体的作用是将目的基因导入受体细胞。
常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
载体需要具备的条件包括：能够在受体细胞中复制并稳定保存；具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有标记基因，便于重组 DNA 的鉴定和选择。
二、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取目的基因是指人们所需要的编码蛋白质的结构基因。
获取目的基因的方法主要有从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增目的基因和人工合成法。
从基因文库中获取目的基因是指将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
可以根据目的基因的有关信息，从基因文库中获取目的基因。
PCR 技术全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。
利用 PCR 技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。
人工合成法包括反转录法和化学合成法。
反转录法是以目的基因转录的 mRNA 为模板，反转录成互补的单链 DNA，然后在酶的作用下合成双链 DNA。
构建载体-个人总结
构建载体抽质粒载体→酶切载体与外源DNA→载体的去磷酸化→连接载体与外源DNA→制备感受态细胞→连接子转化感受态细胞→重组子筛选及鉴定（PCR检测，酶切检测，测序检测）。
（二）具体步骤及相应原理A．质粒抽提1）原理细菌培养物的生长（从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期即可）→细菌的收集（离心）及裂解（离子型或非离子型去污剂、有机溶剂、碱处理或加热处理等方法，方法取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后纯化质粒的方法）→质粒DNA的分离和纯化（1）碱裂解法solution I ：重悬细菌solution II：其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开solution III：中和作用，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。
Solution I: Tris.HCl （pH 7.5）50 mMEDTA 10 mM螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基\;EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境RNase A 100 µg/ml建议：检查配送的RNAse A是否完全加入到Buffer A1中，加入RNAse A后，Buffer A1/RNAse A应该存放在4度，如果存放时间过长，或者没有正确存放，请重新加入RNAse A；Solution II: NaOH 0.2 M(促使染色体DNA与质粒DNA的变性)SDS 1 %(变性沉淀蛋白质,但SDS抑制核糖核酸酶，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
gfp融合基因 -回复
gfp融合基因-回复什么是gfp融合基因？GFP融合基因是一种常用的研究生物学领域的技术手段，它能够将报告基因gfp（绿色荧光蛋白）与感兴趣的基因相连，从而使得该基因在生物体内表达时可以产生绿色荧光。
这种技术的应用广泛，可以用于研究基因的转录、翻译和定位等。
下面将对gfp融合基因的制备和应用过程进行详细解析。
一、gfp融合基因构建1. 选择合适的载体：在构建gfp融合基因时，首先需要选择一个合适的载体，通常可以选择常用的质粒载体，如pEGFP-C1或pEGFP-N1等。
这些载体具有高效的转染和表达能力，适用于多种生物体系。
2. 制备模板：接下来，需要制备感兴趣的基因的DNA模板。
可以通过PCR扩增、酶切片段或合成DNA片段的方式获得。
3. 进行连接：将gfp和基因片段按照设计的连接方式进行连接。
一般情况下，可以利用同源重组或PCR扩增的方法进行连接。
连接时需要注意选择正确的连接位点，避免破坏gfp和基因的功能。
4. 进行双酶切：将连接产物进行双酶切，以验证连接是否成功。
双酶切时需要选择合适的限制酶，将连接产物切割为预期大小的特异性片段。
5. 克隆验证：将切割后的连接产物进行电泳分析，验证连接的正确性。
当连接成功时，连接产物将会产生与预期大小相符的片段。
6. 测序验证：为了进一步确认gfp融合基因的正确性，可以将连接产物进行测序验证。
通过测序，可以得到gfp和基因的序列信息，确保其与设计一致。
二、gfp融合基因的应用1. 转染：将gfp融合基因导入到感兴趣的生物体系中，通常采用转染的方式。
可以选择适合该生物体系的转染方法，如病毒转染、化学转染或电穿孔等。
2. 表达检测：通过检测绿色荧光的表达情况，可以判断gfp融合基因是否被成功表达。
可以通过荧光显微镜观察，或者进行流式细胞仪等技术的检测。
3. 研究基因功能：通过诱导gfp融合基因的表达，可以研究其在生物体内的功能。
例如，可以观察该基因的转录和翻译过程，或者通过定位研究其在细胞中的分布情况。
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2、质粒的构建
（1） 天然存在的两种质粒
A、colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制 20-30/cell B、pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复 制5copy/cell
（2） 质粒人工构建的目的
pBR322为4.36kb的环状双链DNA。
普通型载体pBR322的结构图
HindIII BamHI PstI SalI ScaI Amp
r
pBR322
(4.36 kb)
ori
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
复制起始点 ori
Amp
遗传标记
基因载体
三）质 粒 （plasmid）
质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体 而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子 （Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）。
★不是细菌生长所必需的
★可赋予细菌抵御外界因素不利影响的菌体的溶菌性周期
前噬菌体
温和噬菌体的溶源性周期
二） λ－DNA载体的构建
λ 噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt， 感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48 531bp，含 50多个基因。
建立λ克隆载体前需要解决两个问题： 1） λDNA分子只能增加5%的大小，即只能插 入3kb的DNA分子。 2） λ基因组非常大，对于每一种酶来讲都含 有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段， 连接不能形成λ基因组。
4) 高速离心，沉淀噬菌体
5) 苯酚抽提，释放λ-DNA
6) 乙醇或异丙醇沉淀DNA
四）λ-DNA作为载体的优点
1)体外包装病毒颗粒，高效感染E.coli
2) 装载外源能力为25kb，大于质粒
3) 筛选方便 4) 重组λ-DNA分子提取容易
五）cos质粒 （cosmid）
1、cos质粒的构建 cos质粒
Amp r Tcr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
Amp r Tc s
重组DNA
利 用 抗 性 基 因 进 行 重 组 子 的 筛 选
3、质粒的制备
实验室一般使用两种方法制备质粒
（1） 碱裂解法 （2） 沸水浴法
（1）碱裂解法
原理：利用溶菌酶在NaOH与SDS的混合溶液中破坏 细菌外壁，去除染色体DNA及变性蛋白质，离心，苯
筛选结果模式图
蓝 菌 落
蓝白菌落 筛选白色菌落
二、噬菌体载体与黏粒载体
一）噬菌体载体
λ噬菌体是大 肠杆菌的噬菌体， 它由外壳蛋白和 λ-DNA组成
噬菌体 (电镜图）
1、λ-DNA的物理图谱
λ-DNA为线状双链DNA 分子，两端各有一个12核苷 酸的互补单链（粘性末端） GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA，称为 cos区，全长48.5kb。 特点是功能相近的基因在基 因组中聚集在一起。
5）细菌在加有Amp+X-Gal的培养 基上生长以进行筛选
筛选会有三种结果： 一是要插入的序列自连，结果没有 菌落形成； 二是切开的质粒重连，结果表现为 蓝色菌落； 三是要插入的序列与质粒相连，产 生白色的抗氨苄青霉素菌落。
Amp+X-Gal+IPTG培养基的筛选菌落法
倒平板
加IPTG和X-GAL
乳糖和诱导物IPTG的化学结构
isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside
X-gal
X-gal水解
筛选结果
• 蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表
达出由完好的α LacZ序列编码的功能 性的 α 片段 • 白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉 素菌，质粒上α LacZ序列上有插入片 段
cos 位 点 的 作 用
2、感染周期
噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细 胞，将其DNA导入 ： （1）吸附 （2）DNA注入 （3）DNA复制 （4）包装: 只能包装λ-DNA分子的75%-105%
即包装范围为36.4kb-50.9kb的DNA （5）裂解
吸附
穿入
成熟、释放
生物合成
毒性噬菌体的溶菌性周期
2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
二）载体应具备的特征条件
1.能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或 整合位点 3.长度尽可能小，以提高其载装能力 4.具有多种单一的酶切位点 5.具有合适的选择性标记
多克隆位点
polylinker
3) 携带质粒的选择标记，便于筛选
4) 多种单一酶切位点，便于克隆
Thank You!
1、质粒的基本特性
（1）自主复制性
携带有自己的复制起始区（ori）
控制质粒拷贝数的基因
能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
（2）不相容性
同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容
不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存
（3）可扩增性
质粒就其复制方式而言分为两类
松弛型复制
严谨型复制
（4）可转移性
第三章 基因载体的选择与构建
一、载体的功能、特征及质粒载体
克隆载体（clony vector）：具有在细胞内进行 自我复制的DNA分子，起运送目的基因到受体 细胞的作用。
目前基因工程中常用的载体有： 细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、 病毒载体、人工染色体等。
一）载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞
含有λ -DNA两端cos区的质粒
能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb～ 6kb）载体
组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连 接入的λ cos位点
Cos质粒pJB8
2、λDNA的体外包装
3、 考斯质粒的优越性
1) 体外包装，高效导入受体细胞 2) 装载比质粒或λ-DNA大得多的外源片段
Ⅰ. 缩短长度
缩短多余片段提高装载量。
（a）插入型载体
（b）取代型载体
Ⅱ.修饰酶切识别位点
多余的酶切位点必须被修饰
自然选择法
通过自然选择法筛选无EcorI识别位点的λ-噬菌体
三）λ-DNA的抽提
1) 大肠杆菌培养至对数生长期 2) 加入λ-噬菌体或重组λ-噬菌体悬浮液，37℃ 培养1hr
3) 用新鲜培养稀释，继续培养4-12hr
天然质粒存在缺陷 不适合用作基因工程的载体 必须对之进行改造构建 方法:重组，“拼拼接接，挖肉补疮”
（a）加入合适的选择标记基因
（b）增加或减少合适的酶切位点
（c）缩短长度，增加装载量
（d）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷 贝为多拷贝
（e）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基 因元件
例如：pBR322
酚－氯仿溶液处理，乙醇或异丙醇沉淀水相质粒。
特点：质粒较纯，收得率高，繁琐，且 有开环现象
（2） 沸水浴法
特点：质粒不纯，收得率低，且制备规模小， 但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。
4、典型的质粒克隆技术
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 4) 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 5) 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选
1）用限制性酶消化 DNA 样品
粘性末端
2 ） 用 限 制 性 内 切 酶 消 化 质 粒 DNA
3）连接样品DNA和质粒DNA的消 化产物
冷循环器
4）用连接产物转化大肠杆菌感 受态细胞
转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以 促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进 DNA 吸收。