酪蛋白的初步鉴定

酪蛋白

内容提要：蛋白质是由氨基酸构成的高分子化合物。蛋白质同氨基酸一样是两性电解质，调节蛋白质溶液的pH值可使蛋白质分子所带的正负电荷数目相等，即溶液中的蛋白质以兼性离子形式存在，在外加电场中既不向阴极也不向阳极移动。这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。在等电点条件下，蛋白质溶解度最小，因此就会有沉淀析出。牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。牛乳在pH 4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在乳中呈高分子状态。提取到酪蛋白后，可以用双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应来鉴定分析。

关键词：酪蛋白制备定性分析鉴定

1、实验目的

（1）学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。

（2）对酪蛋白进行分析鉴定。

2、实验原理

牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白食一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。

双缩脲：尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与铜离子结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

茚三酮反应：一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳、氨分子和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。反应的适宜ｐＨ为５－７，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同ｐＨ条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。

3、实验试剂、材料与器材

3、1试剂与材料

牛奶、95%乙醇、无水乙醚、乙醇-乙醚混合液（乙醇：乙醚=1：1 V/V）、

0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液

（先配制A液与B液。

A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称醋酸钠晶体54.44g，定容至2000mL。

B液：0.2mol/L醋酸溶液称优级纯醋酸年（含量大于99.8% ）12.0g定容至1000mL。

取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL。）

2%卵清蛋白溶液、10%氢氧化钠溶液、茚三酮溶液、甘氨酸溶液、苯酚溶液、浓硝酸溶液、色氨酸溶液

3、2器材

离心机、精密pH试纸、烧杯、抽滤装置、电炉

4、实验内容

4、1酪蛋白的制备

（1）将25mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7醋酸缓冲液25mL。用精密试纸或酸度计调pH值至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。离心15min(3000r/min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。

（2）用水洗沉淀三次，离心10min(3000r/min)，弃去上清液。

（3）在沉淀中加入约10mL乙醇，搅拌片刻，将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

（4）取1g酪蛋白，称湿重，进行鉴定。加入100mL蒸馏水，制成1%酪蛋白溶液。

4、2定性分析

（1）双缩脲反应：取两支洁净的试管编号为１、２，分别加入1mL酪蛋白溶液和1mL卵清蛋白溶液，再分别加入2mL10%氢氧化钠和2滴硫酸铜溶液，观察现象。

（2）茚三酮反应：取三支洁净的试管编号为１、２、３，分别加入1mL酪蛋白溶液、1mL卵清蛋白溶液和1mL甘氨酸溶液，再分别加入0.5mL茚三酮溶液。用沸水浴加热1—2分钟，观察现象。

（3）黄色反应：

５、实验结果

（１）双缩脲反应：试管１——溶液变为淡蓝色；试管２——溶液变为淡蓝紫色。

（２）茚三酮反应：试管１——溶液变为淡蓝色；试管２——溶液变为淡蓝色，试管３――溶液变为蓝紫色。

（３）黄色反应：试管１――出现白色沉淀；试管２－－出现黄色沉淀；试管３――无明显现象；试管４――溶液变为黄色。

［参考文献］

王秀奇、秦淑媛、高天慧、颜卉君主编，《基础生物化学实验》，高等教育出版社，２００６年，Ｐ１２５－１３０，Ｐ１４６－１４８。

刑其毅等主编，《基础有机化学》第三版下册，北京高等教育出版社，2005年，Ｐ 983。

杨荣武主编，《生物化学原理》，北京高等教育出版社，２００４年，Ｐ10。