基因工程原理(徐晋麟) 课件归纳总结要点

第一章基因工程的分子生物学基础

1、基因工程（遗传工程、基因操作、重组DNA技术等）：细胞外用各种方法产

生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。

基因工程诞生的理论基础：①DNA双螺旋模型；②基因是可以转移的；③操作子模型的建立；④遗传密码子的破译。

基因工程的技术基础：①工具酶（DNA连接酶、内切酶、反转录酶）；②PCR 技术；③载体技术；基因转移技术。

2、DNA复制：①两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多氢键连接（G-C、

A-T）形成稳定DNA双链分子；②DNA合成的起始需要引物提供3，羟基，DNA聚合酶按照5→3方向合成DNA。

3、限制性内切酶：

I类酶II类酶III类酶

酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分

离

二亚基双功能识别位点二分非对称序列4-8bp序列，回文结构5-7bp非对称序列

切割位点距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识

别位点在识别位点下游24-26bp

限制性反应与甲基化反应互斥分开反应同时竟争

限制作用需要需要不需要

限制酶剪切：

黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端

结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（①5’突出的黏性末端；②3’突出的黏性末端。）

③平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段

具有平末端。

产生黏性末端的酶：

a、同尾酶：一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核

酸内切限制酶。

b、同裂酶：有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列，

这类酶称为同裂酶。

4、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成5′，3′磷酸二酯键的酶

①E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端）

利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物。

②T4 DNA连接酶（粘末端和平末端）

利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类。

在基因工程的实验中主要用T4 DNA连接酶。

5、核酸的分离纯化：通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶

液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。

细菌DNA的提取：细菌培养物的生长和收集→细胞提取物的制备→从细胞提取物中纯化DNA→DNA取样的浓缩→DNA浓度的测量（A260/A280=1.8）。凝胶电泳：（弱碱性条件）根据DNA或RNA 分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。

6、链终止法测序，技术路线与要求：

制备单链模板→将单链模板与一小段引物退火→加入DNA多聚酶，4种脱氧核苷酸，分别加入少量4种双脱氧核苷酸→将4种反应产物分别在4条泳道电泳→根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列。

7、Southern印迹（DNA印迹）：

(1) 提取组织中的DNA，并用内切酶消化，进行琼脂糖凝胶电泳；

(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上；

(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点；

(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针；

(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置，以及信号的强度。

应用：限制性片段长度多态性；确定基因组中基因的拷贝数。

Northern(RNA)印迹：检测基因的表达。

Western (蛋白质)印迹：把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。（蛋白表达量的检测，组织特异性蛋白定位的检测等）

8、实验：鉴定特定基因转录物的转录起点：

（通过核酸酶处理来研究DNA-RNA（RNA-RNA）杂交物）

a、确定转录起始的位置（首先将可能的包含转录起始点以及上游的DNA克隆

进入载体，获得单链的DNA片段；加入转录物，进行温育，退火，杂交；

用S1核酸酶降解单链部分，获得RNA-DNA杂合双链；通过碱变性，降解RNA；检测被RNA保护的DNA片段的长度；判断所克隆的DNA片段中转录起始点的位置。）

b、通过引物延伸来研究转录物，确定转录起始点（获知转录物的部分序列；设

计引物；通过反转录对引物延伸；对产物进行检测；确定转录的起始点位置。）

第二章原核生物分子克隆的宿主和载体系统

1、E. coli K12 的生物学：①革兰氏阴性细菌；②没有核膜和染色体；③一个环

状双链DNA分子，有一个复制起点；④细胞中能维持质粒DNA的复制；⑤生活周期较短，20min分裂一次；⑥能在发酵罐中高密度生长；⑦能在平板上培养出单克隆。

2、乳糖操纵子

利用β-半乳糖苷酶及其基因；

β-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中β-半乳糖苷酶的活性。

3、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷）

①当细菌不携带质粒时，在抗生素培养基上无法生长；

②当有质粒时，（1）多克隆位点MCS无外源片段插入，ɑ+w=完整lacZ；（2）MCS有外源片段插入（ɑ无功能，不能与ɑ互补，故不能分解X-gal），形成白色菌斑。

4、质粒的生物学：共价闭环，双链DNA分子；具有复制原点，能独立进行复

制，不依赖寄主的细胞复制周期；赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗性；

选择性标记。

拷贝数：①严谨型:少数拷贝存在于细胞中（1~几个）；②松弛型:多个拷贝存在于细胞中（≥10）。严谨型与松弛型是相对的。