荧光分析法 PPT

荧光分析法 (Fluorometry)
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第一次记录荧光现象的是 16世纪西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes ， 1575 年 他 提 到 在 含 有 一 种 称 为 “ Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝 色。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～10 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
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非辐射能量传递过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式 由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发 生振动弛豫的时间10-12 s。 振动弛豫只能在同一电子能阶内进行 内部能量转换（内转换）：当两个电子激发态 之间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠 时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转 移至低电子能级的过程。
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一、荧光分析法的基本原理
（一）、荧光产生
1.
分子的电子能级与激发过程
在室温时，大多数分子处在电子基态的最低振动
能级，当受到一定的辐射能作用就会发生能级之 间的跃迁。 在基态时 , 电子成对地填充在能量最低的各轨道。 根据保利不相容原理 , 一个给定轨道中的两个电 子必定具有相反的自旋 , 其自旋量子数 S 分别为 1/2和 -1/2, 其总的自旋量子数S总=0
内转换 振动弛豫 系间窜越
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
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3 2 1 V＝0
吸光
无辐射跃迁
3 2 1 V＝0
无辐射跃迁
吸光
荧光
3 2 1 V＝0
荧光的产生
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
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辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长 长； l ‘2 > l 2 > l 1 ；
能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的 基态处于单重态；
基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级)：
吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；
激发态→基态：通过辐射跃迁和无辐射跃迁等
方式释放多余的能量而返回至基态。
S0→T1 禁阻跃迁；通过其他途径进入；进入
的几率小。
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内转换 S2
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荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
620
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3.激发光谱与发射光谱的关系
（1）.斯托克斯位移(Stokes shift) 荧光发射波长总比激发光波长的现象，振动弛豫和内转换 消耗了能量。 （2）.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级 图l
目录
荧光分析法的基本原理
（一）、荧光产生
（二）、荧光激发光谱与发射光谱
（三）、荧光的产生与分子结构的关系 （四）、影响荧光强度的外部因素 （五）、荧光分光光度计及其使用 （六）、荧光定量分析方法及实例
（七）、荧光分析法的发展
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几个概念
光致发光：有些物质受到光照射时，除吸收某种波长的
种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不
是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。
1867 年， Goppelsroder 进行了历史上首次的荧光分析工作，
应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
1.荧光检测的基本原理
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2.荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum)：固定测量波长， 将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射 下所发射的荧光强度的变化，以IF —λ激发作图，便 可得到荧光物质的激发光谱。 发射光谱或荧光光谱（fluorescence spectrum)：固 定激发光波长和强度, 让物质发射的荧光通过单色 分光,以测定不同波长的荧光强度, 以IF—λ荧光作图 ，便可得到荧光物质的荧光光谱。
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,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l ‘2 )。
基态的多重性 2S+1=1, 这种状态称为单重态，以
S0表示
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当基态电子激发到某高能级时, 将有两种激发态：
自旋相反多重性为1，称为激发单重态，用S表示

自旋平行多重性为M=2× 1+1=3，称为激发三重态 （triplet state）用T表示
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2.
荧光的产生
平行自旋比相反自旋稳定(洪特规则)，三重态
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外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁；
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
体系间跨越：处在激发态的电子发生自旋反转
而使分子的多重性发生变化的过程。 S1的最低振动能级同T1的最高振动能级重叠， 则有可能发生体系间跨越（S1 → T1）
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（二）、荧光激发光谱与发射光谱
光外还会发射出比原来吸收波长更长的光，当激发光停 止照射后，这种光线随之消失。这种现象称为光致发光。 最常见的是荧光和磷光。
荧光：物质分子接受光子能量激发后，从激发态的最低
振动能级返回基态时发射出的光。
荧光分析法：基于对化合物的荧光光谱测量建立起来的
来自百度文库
分析方法。
分类：分子荧光和原子荧光。
根据激发光的波长范围可分为紫外-可见荧光；红外 荧光和X射线荧光。