酶学分析ALT分析Km值
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准确地测得Km值和υmax值。若将米氏方程式进行变换，将曲线作图改为 直线作图，便可容易地用图解法准确求得Km值和υmax值。最常用的是 双倒数作图法，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法，它将米氏方 程式等号两边取倒数，再以1/υ 对1/[S]作图，可得一直线，它在纵轴 上的截距为1/υmax，在横轴上的截距为-1/Km。
第四节
酶法分析
酶法分析是指应用酶作为工具的分析方 法，可以对酶的底物、辅酶、激活剂或抑制 剂进行定量分析。常用的方法有动力学分析 法、终点测定法和酶标免疫测定法。其中终 点测定法的应用最为普遍。所谓终点测定法
就是借助某种酶的作用，使被测物质定量地
进行转变。在转化完成后，测定底物、产物 或辅酶等物质的变化量。它可分为单酶反应 定量法和偶联酶反应定量法。
3．酶的转换数
指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数(μmol／s)，它相 当于一旦底物一酶(ES)中间复合物形成后，酶将底物转换为产物 的效率。
第三节
酶促反应动力学
酶促反应动力学研究的是酶促反 应速度及其影响因素。这些因素包括 底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活 剂、抑制剂等。酶促反应动力学的研 究具有重要的理论和实践意义。
2．可逆性抑制作用
可逆性抑制作用的抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可
逆性结合，使酶活性降低或消失。采用透析或超滤的方法可将抑制剂除 去，使酶恢复活性。可逆性抑制作用的类型大体可分为以下三种：
(1)竞争性抑制作用：抑制剂与酶的底物结构相似，可与底物 竞争酶的活性中心，从而阻碍酶与底物结合形成中间产物。这类抑 制作用使酶的Km增大，但不改变酶的υmax 。
一、酶的分离
1．材料的选取
在酶的分离过程中，首先应该考虑的一个问题是如何选择材料。同 一种酶在不同组织细胞中的含量可能相差千倍或上万倍，因此，如果不 是对某种酶在各组织中的含量进行比较分析或是某些特殊需要，一般选 择含量丰富的材料进行提纯。
2．细胞的破碎
常用的细胞破碎方法有：(1)绞碎、匀浆、高速组织捣碎机捣碎等； (2)对于细胞壁较厚的微生物材料，通常采用加石英砂研磨、超声波破碎、 反复冻融等方法；(3)对于细胞膜上的酶还可以采用有机溶剂处理、去垢 剂处理等。
第二节
酶的活力测定
一、酶活力与酶反应速度
1．酶活力 酶活力(Enzyme Activity)是指酶催化化学反应的能 力，也即酶催化某一化学反应的反应速度。检查酶的含量 及存在，不能直接用重量或体积来表示，通常用它催化某 一特定反应的速度来表示，即用酶的活力来表示。由于酶 活力受温度、pH等环境因素的影响很大，在进行酶活力测 定时，必须使这些因素保持恒定。
使酶失活的方法终止酶反应，但时问较难控制。该法工作
量大，本身包含一定的误差，对速度快的反应常不易得到 十分准确的结果。
2．比色法
比色法是根据底物和产物在某～波长上有明显的特征 吸收差别建立起来的连续观测方法。
3．荧光法
利用酶反应的底物、产物或辅助物具有荧光，通过测荧光强度变化来 测酶活力。例如，某些脱氢酶的辅酶NADH(或NADPH)的中性溶液能发出强 烈的蓝白色荧光(460nm)，而NAD＋(或NADP＋)则没有。用荧光法测酶活力 时，通常以单位时间内荧光强度的变化来表示。 荧光法的优点是灵敏度极高，比分光光度法还要高2～3个数量级，故 特别适用于酶量或底物量极低的快速酶分析。其缺点是：荧光读数与浓度 之间没有直接的比例关系，而且常因测定条件(如温度、散射、仪器等)的 不同而不同。
第四章
酶学分析
酶(Enzyme)是生物体内具有催化功能的蛋白质，又叫生物催 化剂。生物体内的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，因此 酶学的研究，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质以 及指导有关的医学实践和工农业生产都有重要意义。
第一节
酶的分离纯化
酶的化学本质是蛋白质，故 适用于蛋白质的分离纯化方法一 般也适用于酶的分离纯化。
1．米-曼氏方程式
1913年，L.Michaelis和M.L.Menten提出了反应速度与底物浓度关系 的数学方程式，即著名的米一曼氏方程式，简称米氏方程式，即：
式中υmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏 常数，υ是在不同[S]时的反应速度。
2．Km值和υmax值的测定
由于底物浓度对反应速度影响的关系曲线是矩形双曲线，因此很难
4．电化学法
包括离子选择性电极测定法、氧电极测定法及电流测 定法等。
5．同位素法
用同位素标记底物，随着酶催化反应的进行，一部分标记的
底物将转化为产物。反应终止后，分离底物和产物，测底物的放 射性减少量或产物的放射性增加量。常用于底物标记的同位素有
3H、14C、32P、35S和131I。同位素法的特点是灵敏度极高，但操作
一是测定完成一定量反应所需的时间，即在一定条件 下将全部底物转化为产物所需的时间。所需的时间愈短， 酶活力愈高；反之则活力愈低。由于反应时间很难精确控 制，这种方法很少应用。 另一种方法是测定在最适宜条件下，单位时间内底物 的减少量或产物的增加量。由于在实验中底物往往是过量 的，反应中底物的转化仅占总底物的极小一部分，不易测 准；而产物则从无到有，只要方法足够灵敏就可以准确测 定，故常采用后一种方法。酶促反应速度的单位是浓度／ 单位时间。
从组织中抽提所需要的酶往往用缓冲液抽提，这样可以避免由于 pH的突然变化而导致酶的失活。低温(O～4℃)操作更宜。
二、酶的纯化
随着科学技术水平的不断提高，酶的分离纯化手段也不断
增加，尽管方法多样，但大致可归纳为以下几类：
1．沉淀法
2．层析法
3．电泳法 4．结晶
1．沉淀法 常用的有盐析法、聚乙二醇沉淀法、等电点沉淀法、 有机溶剂沉淀法、热变性沉淀法等。
二、测定方法
测定产物增加量或底物减少量的方法很多，常用的方法有 化学滴定、比色、比旋光度、气体测压、紫外吸收测定、电化学 法、荧光测定及同位素技术等。具体选择哪一种方法，要根据底 物或产物的物理化学性质而定。
1．化学法
这是一种取样法。终止酶反应通常采用加入酶的变性 剂的方法。如果反应底物或产物热稳定性好，也可用加热
一、单酶反应定量法
1．底物含量的测定 单酶反应只应用一种酶进行催化，如下式所示
S
E
P
用这种反应作底物定量时，可以测定底物的减少量，也可 以测定产物的增加量。对含有辅酶的酶，测定辅酶的变化量也 是有效的方法。
最适pH也不是酶的特性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类与 浓度，以及酶的纯度等因素的影响。溶液pH高于或低于最适pH时， 酶的活性降低，远离最适pH时甚至会导致酶的变性失活。因此在测 定酶的活性时，应选用pH适宜的缓冲液以保持酶活性的相对恒定。
五、激活剂对反应速度的影响
使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂 (activator)，可分为必需激活剂和非必需激活剂。必需激活剂大多 为金属离子，如Mg2+、K+、Mn2+等，它们对酶促反应是不可缺少的， 否则将测不到酶的活性。非必需激活剂是指激活剂不存在时，酶仍有 一定的催化活性，但它的存在能提高酶的催化活性。
烦琐、费时，有放射性，操作者须特别小心。
三、酶的活力单位(U)及比活力
酶活力的大小也即酶量的大小，用酶的活力单位来度量。
1．酶的活力单位
Biblioteka Baidu
1976年国际酶学生化学会委员会规定：1个酶活力单位，是 指在特定条件下，1分钟内能将l微摩尔(μmol)底物转化为产物 所需的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。 在临床上酶活力单位常用习惯表示法。如对血清谷丙转氨酶
3．电泳法 电泳法是利用酶蛋白所带电荷和分子量大小与其他杂蛋白 的不同而达到分离的目的。酶纯化中常用的电泳有聚丙烯酰胺 凝胶电泳、等电聚焦等，详见本书第二章。
4．结晶
结晶主要是利用酶蛋白在硫酸铵等溶液中的溶解度随
着温度升高而降低的特性将酶进行提纯。达到一定纯度的 酶才可以结晶，同时结晶本身也是一种提纯的方法。用于 结晶的酶制剂只要纯度达到50X以上就可以了。
2．酶反应速度
酶活力测定常采用测反应初速度的方法。底物浓度的变化在
起始浓度的5％以内的速度为初速度。底物浓度太低时，5％以下 的底物浓度变化不易测准，所以在测酶活力时，往往使底物浓度 足够大，这样酶促反应对于底物来说是零级反应，而对于酶来说 却是一级反应，由此测得的速度就能较可靠地反映酶的活力。
测定酶活力有两种方法：
酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应进行的时间有关。酶可 以在短时间内耐受较高的温度。相反，延长反应时间，最适温度便降低。
四、pH对反应速度的影响
酶分子中的许多极性基团在不同的pH条件下解离状态不同，所
带电荷的种类和数量也各不相同，酶活性中心的某些必需基团往往
仅在某一解离状态时才具有最大的催化作用。此时的环境pH称为酶 促反应的最适pH。动物体内多数酶的最适pH接近中性。
(1)盐析法：
盐析用的盐通常有硫酸铵和氯化钠等。由于硫酸铵溶解度 大，对大部分酶无毒副作用，且在浓度较高时对一些酶还有稳
定作用，易透析除去，故盐析绝大多数都用硫酸铵。
(2)聚乙二醇沉淀法： 聚乙二醇是最常用的分离核酸和蛋白质的沉淀剂。在部 分纯化的酶溶液中，缓慢加入聚乙二醇，使溶液达到混浊， 可以使某些酶以结晶的形式沉淀下来，使酶的提纯效果提高 3～5倍，且很少引起酶的失活。
二、酶浓度对反应速度的影响
在酶促反应系统中，当底物浓度大大超过酶的浓度，使酶被底物饱 和时，反应速度与酶的浓度成正比例关系。
三、温度对反应速度的影响
酶是生物催化剂，温度对酶促反应速度具有双重影响。温度升高时， 一方面可加快酶促反应速度，同时也增加酶的变性。综合这两种因素，酶 促反应速度最快时的环境温度称为酶促反应的最适温度。温血动物中酶的 最适温度多在35～40℃之间。温度高于最适温度时，反应速度则因酶变性 而降低。
(3)等电点(pI)沉淀法：
酶蛋白在等电点处溶解度最小，易于沉淀，因此可以通过调节介质的pH
值对酶进行提纯。但由于蛋白质在pI附近一定范围的pH值溶液中都可发生沉 淀，而且相当多蛋白质的pI很接近，所以该法的提纯效果及回收率均不理想，
一般只用在酶的粗分离阶段。
(4)有机溶剂沉淀法： 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮和甲醇等。该法是一种比较有效的分离 提纯方法。为了避免酶蛋白变性，须在低温(-5～-10℃)下进行分离提纯。
(ALT)活力单位按King氏法定义为：每100ml血清在37℃，pH-7.4
条件下与底物作用60 min，生成1μmo1丙酮酸为1个活力单位。
2．酶的比活力
比活力的大小，就是酶含量的大小，即酶蛋白所具有的酶活 力，一般用活力单位／毫克蛋白(U／mg蛋白)来表示，有时也用 每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示(单位／ 克或单位／毫升)。
一、底物浓度对反应速度的影响
在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度影响的关系曲线呈 矩形双曲线。在底物浓度较低时，反应速度随底物浓度的增加而急剧上 升，两者成正比关系；随着底物浓度的进一步增高，应速度的增幅度不 断下降；如果继续加大底物浓度，反应速度将不再增加，此时酶的活性 中心已被底物饱和。
六、抑制剂对反应速度的影响
凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的 抑制剂。根据抑制剂与酶结合的紧密程度不同，对酶的抑制作用分为 可逆性抑制与不可逆性抑制两类。
1．不可逆性抑制作用
不可逆性抑制作用的抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心
以外的必需基团相结合，使酶失活。此种抑制剂不能用透析、超滤等方 法予以去除。
(2)非竞争性抑制作用：抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合， 不影响酶与底物的结合，酶和底物的结合也不影响酶与抑制剂的结
合。这类抑制作用使酶的 υmax 降低，但不影响酶的Km。
3．反竞争性抑制作用
抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使中问产物的量下降。 这类抑制作用同时降低反应的 υmax 和Km值。
(5)热变性沉淀法：
对于热稳定酶(如酵母醇脱氢酶)，可利用温度控制，将杂蛋白变性沉 淀除去。该法提纯效果很好，但在操作时要防止局部过热，一般用比变性
温度高l0℃的水浴迅速升温，在变性温度下保持一定时间后，用冰迅速冷
却。
2．层析法
酶纯化中常用的层析法有：吸附层析、离子交换层析、 凝胶层析及亲和层析等，详见本书第三章。
第四节
酶法分析
酶法分析是指应用酶作为工具的分析方 法，可以对酶的底物、辅酶、激活剂或抑制 剂进行定量分析。常用的方法有动力学分析 法、终点测定法和酶标免疫测定法。其中终 点测定法的应用最为普遍。所谓终点测定法
就是借助某种酶的作用，使被测物质定量地
进行转变。在转化完成后，测定底物、产物 或辅酶等物质的变化量。它可分为单酶反应 定量法和偶联酶反应定量法。
3．酶的转换数
指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数(μmol／s)，它相 当于一旦底物一酶(ES)中间复合物形成后，酶将底物转换为产物 的效率。
第三节
酶促反应动力学
酶促反应动力学研究的是酶促反 应速度及其影响因素。这些因素包括 底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活 剂、抑制剂等。酶促反应动力学的研 究具有重要的理论和实践意义。
2．可逆性抑制作用
可逆性抑制作用的抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可
逆性结合，使酶活性降低或消失。采用透析或超滤的方法可将抑制剂除 去，使酶恢复活性。可逆性抑制作用的类型大体可分为以下三种：
(1)竞争性抑制作用：抑制剂与酶的底物结构相似，可与底物 竞争酶的活性中心，从而阻碍酶与底物结合形成中间产物。这类抑 制作用使酶的Km增大，但不改变酶的υmax 。
一、酶的分离
1．材料的选取
在酶的分离过程中，首先应该考虑的一个问题是如何选择材料。同 一种酶在不同组织细胞中的含量可能相差千倍或上万倍，因此，如果不 是对某种酶在各组织中的含量进行比较分析或是某些特殊需要，一般选 择含量丰富的材料进行提纯。
2．细胞的破碎
常用的细胞破碎方法有：(1)绞碎、匀浆、高速组织捣碎机捣碎等； (2)对于细胞壁较厚的微生物材料，通常采用加石英砂研磨、超声波破碎、 反复冻融等方法；(3)对于细胞膜上的酶还可以采用有机溶剂处理、去垢 剂处理等。
第二节
酶的活力测定
一、酶活力与酶反应速度
1．酶活力 酶活力(Enzyme Activity)是指酶催化化学反应的能 力，也即酶催化某一化学反应的反应速度。检查酶的含量 及存在，不能直接用重量或体积来表示，通常用它催化某 一特定反应的速度来表示，即用酶的活力来表示。由于酶 活力受温度、pH等环境因素的影响很大，在进行酶活力测 定时，必须使这些因素保持恒定。
使酶失活的方法终止酶反应，但时问较难控制。该法工作
量大，本身包含一定的误差，对速度快的反应常不易得到 十分准确的结果。
2．比色法
比色法是根据底物和产物在某～波长上有明显的特征 吸收差别建立起来的连续观测方法。
3．荧光法
利用酶反应的底物、产物或辅助物具有荧光，通过测荧光强度变化来 测酶活力。例如，某些脱氢酶的辅酶NADH(或NADPH)的中性溶液能发出强 烈的蓝白色荧光(460nm)，而NAD＋(或NADP＋)则没有。用荧光法测酶活力 时，通常以单位时间内荧光强度的变化来表示。 荧光法的优点是灵敏度极高，比分光光度法还要高2～3个数量级，故 特别适用于酶量或底物量极低的快速酶分析。其缺点是：荧光读数与浓度 之间没有直接的比例关系，而且常因测定条件(如温度、散射、仪器等)的 不同而不同。
第四章
酶学分析
酶(Enzyme)是生物体内具有催化功能的蛋白质，又叫生物催 化剂。生物体内的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，因此 酶学的研究，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质以 及指导有关的医学实践和工农业生产都有重要意义。
第一节
酶的分离纯化
酶的化学本质是蛋白质，故 适用于蛋白质的分离纯化方法一 般也适用于酶的分离纯化。
1．米-曼氏方程式
1913年，L.Michaelis和M.L.Menten提出了反应速度与底物浓度关系 的数学方程式，即著名的米一曼氏方程式，简称米氏方程式，即：
式中υmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏 常数，υ是在不同[S]时的反应速度。
2．Km值和υmax值的测定
由于底物浓度对反应速度影响的关系曲线是矩形双曲线，因此很难
4．电化学法
包括离子选择性电极测定法、氧电极测定法及电流测 定法等。
5．同位素法
用同位素标记底物，随着酶催化反应的进行，一部分标记的
底物将转化为产物。反应终止后，分离底物和产物，测底物的放 射性减少量或产物的放射性增加量。常用于底物标记的同位素有
3H、14C、32P、35S和131I。同位素法的特点是灵敏度极高，但操作
一是测定完成一定量反应所需的时间，即在一定条件 下将全部底物转化为产物所需的时间。所需的时间愈短， 酶活力愈高；反之则活力愈低。由于反应时间很难精确控 制，这种方法很少应用。 另一种方法是测定在最适宜条件下，单位时间内底物 的减少量或产物的增加量。由于在实验中底物往往是过量 的，反应中底物的转化仅占总底物的极小一部分，不易测 准；而产物则从无到有，只要方法足够灵敏就可以准确测 定，故常采用后一种方法。酶促反应速度的单位是浓度／ 单位时间。
从组织中抽提所需要的酶往往用缓冲液抽提，这样可以避免由于 pH的突然变化而导致酶的失活。低温(O～4℃)操作更宜。
二、酶的纯化
随着科学技术水平的不断提高，酶的分离纯化手段也不断
增加，尽管方法多样，但大致可归纳为以下几类：
1．沉淀法
2．层析法
3．电泳法 4．结晶
1．沉淀法 常用的有盐析法、聚乙二醇沉淀法、等电点沉淀法、 有机溶剂沉淀法、热变性沉淀法等。
二、测定方法
测定产物增加量或底物减少量的方法很多，常用的方法有 化学滴定、比色、比旋光度、气体测压、紫外吸收测定、电化学 法、荧光测定及同位素技术等。具体选择哪一种方法，要根据底 物或产物的物理化学性质而定。
1．化学法
这是一种取样法。终止酶反应通常采用加入酶的变性 剂的方法。如果反应底物或产物热稳定性好，也可用加热
一、单酶反应定量法
1．底物含量的测定 单酶反应只应用一种酶进行催化，如下式所示
S
E
P
用这种反应作底物定量时，可以测定底物的减少量，也可 以测定产物的增加量。对含有辅酶的酶，测定辅酶的变化量也 是有效的方法。
最适pH也不是酶的特性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类与 浓度，以及酶的纯度等因素的影响。溶液pH高于或低于最适pH时， 酶的活性降低，远离最适pH时甚至会导致酶的变性失活。因此在测 定酶的活性时，应选用pH适宜的缓冲液以保持酶活性的相对恒定。
五、激活剂对反应速度的影响
使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂 (activator)，可分为必需激活剂和非必需激活剂。必需激活剂大多 为金属离子，如Mg2+、K+、Mn2+等，它们对酶促反应是不可缺少的， 否则将测不到酶的活性。非必需激活剂是指激活剂不存在时，酶仍有 一定的催化活性，但它的存在能提高酶的催化活性。
烦琐、费时，有放射性，操作者须特别小心。
三、酶的活力单位(U)及比活力
酶活力的大小也即酶量的大小，用酶的活力单位来度量。
1．酶的活力单位
Biblioteka Baidu
1976年国际酶学生化学会委员会规定：1个酶活力单位，是 指在特定条件下，1分钟内能将l微摩尔(μmol)底物转化为产物 所需的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。 在临床上酶活力单位常用习惯表示法。如对血清谷丙转氨酶
3．电泳法 电泳法是利用酶蛋白所带电荷和分子量大小与其他杂蛋白 的不同而达到分离的目的。酶纯化中常用的电泳有聚丙烯酰胺 凝胶电泳、等电聚焦等，详见本书第二章。
4．结晶
结晶主要是利用酶蛋白在硫酸铵等溶液中的溶解度随
着温度升高而降低的特性将酶进行提纯。达到一定纯度的 酶才可以结晶，同时结晶本身也是一种提纯的方法。用于 结晶的酶制剂只要纯度达到50X以上就可以了。
2．酶反应速度
酶活力测定常采用测反应初速度的方法。底物浓度的变化在
起始浓度的5％以内的速度为初速度。底物浓度太低时，5％以下 的底物浓度变化不易测准，所以在测酶活力时，往往使底物浓度 足够大，这样酶促反应对于底物来说是零级反应，而对于酶来说 却是一级反应，由此测得的速度就能较可靠地反映酶的活力。
测定酶活力有两种方法：
酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应进行的时间有关。酶可 以在短时间内耐受较高的温度。相反，延长反应时间，最适温度便降低。
四、pH对反应速度的影响
酶分子中的许多极性基团在不同的pH条件下解离状态不同，所
带电荷的种类和数量也各不相同，酶活性中心的某些必需基团往往
仅在某一解离状态时才具有最大的催化作用。此时的环境pH称为酶 促反应的最适pH。动物体内多数酶的最适pH接近中性。
(1)盐析法：
盐析用的盐通常有硫酸铵和氯化钠等。由于硫酸铵溶解度 大，对大部分酶无毒副作用，且在浓度较高时对一些酶还有稳
定作用，易透析除去，故盐析绝大多数都用硫酸铵。
(2)聚乙二醇沉淀法： 聚乙二醇是最常用的分离核酸和蛋白质的沉淀剂。在部 分纯化的酶溶液中，缓慢加入聚乙二醇，使溶液达到混浊， 可以使某些酶以结晶的形式沉淀下来，使酶的提纯效果提高 3～5倍，且很少引起酶的失活。
二、酶浓度对反应速度的影响
在酶促反应系统中，当底物浓度大大超过酶的浓度，使酶被底物饱 和时，反应速度与酶的浓度成正比例关系。
三、温度对反应速度的影响
酶是生物催化剂，温度对酶促反应速度具有双重影响。温度升高时， 一方面可加快酶促反应速度，同时也增加酶的变性。综合这两种因素，酶 促反应速度最快时的环境温度称为酶促反应的最适温度。温血动物中酶的 最适温度多在35～40℃之间。温度高于最适温度时，反应速度则因酶变性 而降低。
(3)等电点(pI)沉淀法：
酶蛋白在等电点处溶解度最小，易于沉淀，因此可以通过调节介质的pH
值对酶进行提纯。但由于蛋白质在pI附近一定范围的pH值溶液中都可发生沉 淀，而且相当多蛋白质的pI很接近，所以该法的提纯效果及回收率均不理想，
一般只用在酶的粗分离阶段。
(4)有机溶剂沉淀法： 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮和甲醇等。该法是一种比较有效的分离 提纯方法。为了避免酶蛋白变性，须在低温(-5～-10℃)下进行分离提纯。
(ALT)活力单位按King氏法定义为：每100ml血清在37℃，pH-7.4
条件下与底物作用60 min，生成1μmo1丙酮酸为1个活力单位。
2．酶的比活力
比活力的大小，就是酶含量的大小，即酶蛋白所具有的酶活 力，一般用活力单位／毫克蛋白(U／mg蛋白)来表示，有时也用 每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示(单位／ 克或单位／毫升)。
一、底物浓度对反应速度的影响
在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度影响的关系曲线呈 矩形双曲线。在底物浓度较低时，反应速度随底物浓度的增加而急剧上 升，两者成正比关系；随着底物浓度的进一步增高，应速度的增幅度不 断下降；如果继续加大底物浓度，反应速度将不再增加，此时酶的活性 中心已被底物饱和。
六、抑制剂对反应速度的影响
凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的 抑制剂。根据抑制剂与酶结合的紧密程度不同，对酶的抑制作用分为 可逆性抑制与不可逆性抑制两类。
1．不可逆性抑制作用
不可逆性抑制作用的抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心
以外的必需基团相结合，使酶失活。此种抑制剂不能用透析、超滤等方 法予以去除。
(2)非竞争性抑制作用：抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合， 不影响酶与底物的结合，酶和底物的结合也不影响酶与抑制剂的结
合。这类抑制作用使酶的 υmax 降低，但不影响酶的Km。
3．反竞争性抑制作用
抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使中问产物的量下降。 这类抑制作用同时降低反应的 υmax 和Km值。
(5)热变性沉淀法：
对于热稳定酶(如酵母醇脱氢酶)，可利用温度控制，将杂蛋白变性沉 淀除去。该法提纯效果很好，但在操作时要防止局部过热，一般用比变性
温度高l0℃的水浴迅速升温，在变性温度下保持一定时间后，用冰迅速冷
却。
2．层析法
酶纯化中常用的层析法有：吸附层析、离子交换层析、 凝胶层析及亲和层析等，详见本书第三章。