1、细菌的形态结构观察和染色

思
考
题
( 一 ) 为什么必须用培养 24 h 以内的菌体进行革兰氏染 为什么必须用培养24 24h 色？ 要得到正确的革兰氏染色结果， ( 二 ) 要得到正确的革兰氏染色结果 ， 必须注意哪些操 哪一步是关键步骤？为什么？ 作？哪一步是关键步骤？为什么？
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1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 8. 9.
10. 接通电源。 接通电源。 打开主开关。 打开主开关。 转动光强调节钮，使亮度适中。 转动光强调节钮，使亮度适中。 把标本固定在载物台上。 把标本固定在载物台上。 11. 用低倍物镜， 用低倍物镜，旋转粗调和微调 来进行对焦。 来进行对焦。 12. 调节双目镜筒间距和视度差。 调节双目镜筒间距和视度差。 再适当调节照明度。 再适当调节照明度。 使焦点正确地对准标本。 使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 调节孔径光阑。 13. 依次用低、 高倍镜观察。 依次用低、中、高倍镜观察。
实验内容
了解鞭毛染色的方法和步骤） 鞭毛染色的方法和步骤 （了解鞭毛染色的方法和步骤）
1．载片的清洗：将载片洗净浸泡在95％乙醇中备用。 载片的清洗：将载片洗净浸泡在95％乙醇中备用。 95 实验菌种的准备： 2．实验菌种的准备：将枯草芽孢杆菌在新制备的肉膏蛋白胨斜面培养基上 斜面下部要有少量冷凝水) 连续移种3 每次培养12 18h 12～ ( 斜面下部要有少量冷凝水) ，连续移种3 ～4次，每次培养12～18 h， 最后一次培养12 16h 12～ 最后一次培养12～16h。 制片：擦干载片，在载片一端加一滴蒸馏水， 3．制片：擦干载片，在载片一端加一滴蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔底 部有水部分的菌体(注意不要挑出培养基) 将接种环悬放在水滴中片刻， 部有水部分的菌体(注意不要挑出培养基)，将接种环悬放在水滴中片刻， 将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端， 将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，可再返转一次使菌液流 经面积扩大，然后放平，自然干燥。 经面积扩大，然后放平，自然干燥。 染色（利夫森氏染色法） 用蜡笔将涂菌区圈起，滴加染液， 4．染色（利夫森氏染色法） ：用蜡笔将涂菌区圈起，滴加染液，过数分钟 当染液的1 以上区域表面出现金属光泽膜时， 后，当染液的1/2以上区域表面出现金属光泽膜时，用水轻轻将金属膜 及染液冲洗干净，自然干燥。 及染液冲洗干净，自然干燥。 镜检镜检时应在涂片上按顺序进行观察， 镜检镜检时应在涂片上按顺序进行观察，经常是在部分涂片区的菌体染 出鞭毛，菌体及鞭毛均为红色。 出鞭毛，菌体及鞭毛均为红色。
奥林帕斯( 奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜 )
荧光发射装置 摄像头 双筒目镜 镜筒 镜臂 物镜转换器 物镜 电源 载物台 视场光阑
光强调节钮 粗调节器 载物台调节纽 细调节器 镜座 孔径光阑
奥林帕斯生物显微镜的使用方法
油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后， 油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后， 下降载物台，在标本中央滴一滴香柏油， 下降载物台，在标本中央滴一滴香柏油， 使油镜镜头浸入香柏油中， 使油镜镜头浸入香柏油中，再细调至看 清物象为止。 清物象为止。 换片：另换新片，必须从第9 换片：另换新片，必须从第9条开始操 作。 观察完毕，下降载物台， 观察完毕，下降载物台，取下载物台上 的载玻片， 的目镜对准载物台， 的载玻片，将4×的目镜对准载物台， 再用擦镜纸擦去镜头上的油， 再用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦 镜纸沾取少量乙醇/ 水擦去残留的油， 镜纸沾取少量乙醇 / 水擦去残留的油 ， 最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/ 最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/水。 用毕复原：先将电压调节旋钮复原， 用毕复原：先将电压调节旋钮复原，关 闭主开关，切断电源。 闭主开关，切断电源。
实 验 材 料Ⅰ
(一)菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
(二)染液
1.简单染色：草酸铵结晶紫染液。 1.简单染色：草酸铵结晶紫染液。 简单染色 2.革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、 2.革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、 革兰氏染色 95％乙醇、蕃红染液。 95％乙醇、蕃红染液。
油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。 油镜，即油浸接物镜。 当光线由反光镜通过玻片 与镜头之间的空气时， 与镜头之间的空气时 ， 由 于空气与玻片的密度不同， 于空气与玻片的密度不同 ， 使光线受到曲折， 使光线受到曲折 ， 发生散 降低了视野的照明度。 射 ， 降低了视野的照明度 。 若中间的介质是一层油 （其折射率与玻片的相 近 ） ， 则几乎不发生折射， 则几乎不发生折射 ， 增加了视野的进光量， 增加了视野的进光量 ， 从 而使物象更加清晰。 而使物象更加清晰。
微生物名称 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 形状 大小 含水程度 菌落颜色 透明度 与培养基结合程度 嗅味
(二)绘图：画出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞形态 绘图：画出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、 图。 记录3种菌的革兰氏染色结果；分辨出革兰氏阳性菌或阴性菌。 (三)记录3种菌的革兰氏染色结果；分辨出革兰氏阳性菌或阴性菌。如 果染色结果不理想，请分析原因。 果染色结果不理想，请分析原因。
实验内容
(三)简单染色(只做金黄色葡萄球菌)。 简单染色(只做金黄色葡萄球菌) 革兰氏染色法： 大肠杆菌、 ( 四 ) 革兰氏染色法 ： 大肠杆菌 、 枯草芽孢 杆菌和金黄色葡萄球菌。 杆菌和金黄色葡萄球菌。
实验报告内容
(一)画表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌落特征。 画表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌落特征。
显微镜保养和使用中的注意事项
1. 2. 3.
4. 5. 6.
不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 观察标本时，必须依次用低、 高倍镜，最后用油镜。 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当 目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器， 目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以 免压碎玻片或损伤镜面。 免压碎玻片或损伤镜面。 光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤 光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命， 并且无法进行图像采集。 害，并且无法进行图像采集。 观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯， 观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同 时聚焦。 时聚焦。 观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上， 观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不 能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。 能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。
基 本 原 理
(一)简单染色法原理 (二)革兰氏染色法原理 (三)抗酸染色原理 (四)芽孢染色原理 (五)荚膜染色原理 (六)鞭毛染色原理
染色剂和染色原理
微生物染色常用染料如下表： 微生物染色常用染料如下表：
实验内容
（简单染色的方法和步骤） 简单染色的方法和步骤）
涂片
自然干燥 自然干燥
微火固定
实 验 材 料 Ⅱ
(三)标本
细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。 细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。
(四)其他物品
无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、 无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、 吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。 吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。
实验内容
(一) 成片观察 (1)观察细菌三型涂片 比较球菌、 观察细菌三型涂片， (1)观察细菌三型涂片，比较球菌、杆菌和 螺旋菌的形态。 螺旋菌的形态。 (2)观察四联球菌的形态及排列方式 观察四联球菌的形态及排列方式。 (2)观察四联球菌的形态及排列方式。 (3)观察苏云金芽孢杆菌的芽孢， 观察苏云金芽孢杆菌的芽孢 (3)观察苏云金芽孢杆菌的芽孢，褐球固氮 菌的荚膜的形态。 菌的荚膜的形态。
实验一 细菌的形态 结构观察和染色
目 的 要 求
观察细菌菌落的特征。 观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理 及操作步骤。 及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法， 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽 荚膜及鞭毛染色。 孢、荚膜及鞭毛染色。
实验内容
了解芽孢染色的方法和步骤） 芽孢染色的方法和步骤 （了解芽孢染色的方法和步骤）
孔雀绿染色法：取一干净载片， 孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴 按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀， 水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀， 制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6 7.6％ 制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀 绿饱和水溶液，间断加热染色10min 10min后 绿饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染 液勿使涂片干燥) 用水冲洗。再用0.5 0.5％ 液勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色 lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色， lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营 养体呈现红色。 养体呈现红色。
实验内容
了解抗酸染色的方法和步骤） 抗酸染色的方法和步骤 （了解抗酸染色的方法和步骤）
1．制片 将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80℃恒温水浴3h杀死菌体。 3h杀死菌体 将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80℃恒温水浴3h杀死菌体。取 菌悬液涂片，自然干燥。 菌悬液涂片，自然干燥。 2．染色 滴加石炭酸复红染液2 覆盖涂片， 滴加石炭酸复红染液2滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出 不断补充染液，加热8 10min，弃染液。 现，不断补充染液，加热8～10min，弃染液。 3．脱色 盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。 用3％盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。 4．水洗 滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。 滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。 5．复染 加美蓝染液染lmin lmin。 加美蓝染液染lmin。 水洗后自然干燥、 6．水洗后自然干燥、镜检 草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照， 草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成 蓝色。 蓝色。
实验内容
了解荚膜染色的方法和步骤） 荚膜染色的方法和步骤 （了解荚膜染色的方法和步骤）
1．制片
加一滴6％葡萄糖水溶液于载片一端，挑取少量胶质芽孢杆菌与其混合， 加一滴6 葡萄糖水溶液于载片一端，挑取少量胶质芽孢杆菌与其混合， 再加一滴黑色素充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层， 再加一滴黑色素充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层，自然干 燥。 2．固定 滴加l 滴加l～2滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。 滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。 lmin 3．染色，冲洗 染色， 滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。 滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。 有荚膜的菌、菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。 有荚膜的菌、菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。 无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩， 无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能出现一圈狭窄的不 着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。 着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。
染色l 染色 min 冲洗 吸干 镜检
实验内容
（革兰氏染色的方法 和步骤） 和步骤）
涂片，干燥、 涂片，干燥、固定 草酸铵结晶紫染液染色lmin， 草酸铵结晶紫染液染色lmin，用 水冲洗 用革氏碘液媒染lmin，用水冲去 用革氏碘液媒染 ， 碘液 用95％乙醇脱色 ％乙醇脱色10-30s，至乙醇 ， 液不呈现紫色 蕃红染液复染lmin，用水冲洗 ， 蕃红染液复染 吸干并镜检
实验内容
观察平板上的细菌菌落， ( 二 ) 观察平板上的细菌菌落 ， 识别大肠杆 菌 、 枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌 的菌落特征。 的菌落特征。 注意菌落的形状、 高度、 大小、 颜色， 注意菌落的形状 、 高度 、 大小 、 颜色 ， 是否湿润、 光泽、 透明度、 是否湿润 、 光泽 、 透明度 、 边缘状况 等等。 等等。