实验三 细菌纯种分离、培养和接种技术
【微生物实验】实验三微生物的接种分离和纯培养wzj
接种无菌操作步骤
3. 右手无名指、小指和手掌边夹住两试 管棉塞，轻轻拔出，试管口过火后移开， 仍靠近并面向火焰；
4. 将接种环伸入试管，稍冷后沾取少量 菌体。 5. 以下详见不同接种方法。
斜面接种技术
1. 用接种环经无菌操作从菌种斜面挑取少量 菌体； 2. 将接种环引入待接种的斜面，自下而上在 斜面上划一直线，再垂直于该直线连续划线； 3. 取出接种环，将试管口再次过火后塞上棉 塞，灼烧用过的接种环并放回原处； 4. 将棉塞塞紧，将斜面放入培养箱中培养。
平板活菌计数法步骤
0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml
菌悬液 10- 10- 10-
12
3
冷却至45 ℃左右
每皿约倒入15ml
沙保培养基
10- 10-5 10-6
40.5 ml 0.5 ml
0.5 ml
平板活菌计数法
待凝后倒置于28℃恒温培养48 hr后计数。 （选择菌落数在25～250个左右的平板计数）
3. 左手取一无菌培养皿，在火焰边稍稍打开 皿盖，倒入培养基15ml左右，放在桌面上 轻轻摇匀，待凝后即成平板；
琼脂平板划线分离法
4. 以无菌操作用接种环沾取待分离的混合 菌液；
5. 左手持培养皿底并使其面向火焰，依次轻 轻而迅速的一条条紧接着划线，划线距离 恰当（尽量靠近，但线与线勿碰到），划 过下面后不要回上去重复划；
实验菌种：大肠杆菌一支 酵母菌一支
斜面接种技术
斜面划线示意图
液体接种技术
1. 以无菌操作挑取少许菌体引入待接种的液 体培养基中，在接近液面处的试管壁上轻 轻摩擦，适当摇动，使之均匀分布在液体 中；
2. 塞紧棉塞后，放入恒温培养箱内培养。 实验菌种：大肠、酵母各一支
细菌的接种分离与培养实验报告实验结论
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微生物的分离、接种和培养技术
微生物的分离、接种和培养技术一、实验的目的和内容目的：掌握微生物接种和分离纯化技术，掌握无菌操作技术。
内容：用平板划线法分离微生物；学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、基本原理在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。
因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。
无菌操作是微生物接种技术的关键。
接种是将微生物或微生物悬液引入新鲜培养基的过程。
由于实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。
斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。
即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。
在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料及器材（一）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌。
（二）培养基：肉汤培养基试管斜面，肉汤半固体培养基，肉汤固体培养基试管斜面，肉汤固体培养基平板，查氏培养基试管斜面，查氏培养基平板。
易（三）仪器及其他工具：接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，标签纸，恒温培养箱等。
四、方法与步骤（一）接种。
1、试管菌种转接：试管细菌菌种转接主要用于菌种的活化、分离、纯化。
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。
（4）取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
（5）取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上棉塞。
（7）烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
纯种分离实验报告
一、实验目的1. 掌握纯种分离的基本原理和方法；2. 学习使用平板划线法和稀释涂布平板法进行纯种分离；3. 观察并记录分离过程中菌落的形态特征；4. 学会纯种菌的保藏方法。
二、实验原理纯种分离是微生物学中重要的基本操作，其目的是从混杂的微生物群体中分离出单个微生物个体，使其纯化。
纯种分离通常采用平板划线法和稀释涂布平板法进行。
1. 平板划线法：将微生物接种在固体培养基表面，用无菌的接种针或涂布器在培养基上划线，使微生物在培养基表面逐渐稀释，最终得到单个菌落。
2. 稀释涂布平板法：将微生物在无菌生理盐水中进行稀释，然后将稀释液均匀涂布在固体培养基表面，待菌落生长后，即可观察到单个菌落。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等；- 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、沙堡培养基等；- 生理盐水；- 灭菌器械：接种针、涂布器、酒精灯、无菌棉签等；- 其他：无菌操作台、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：- 离心机；- 高压蒸汽灭菌器；- 移液器；- 显微镜等。
四、实验方法与步骤1. 实验前准备（1）配制培养基：根据实验要求，选择合适的培养基，按照比例称量，加入蒸馏水溶解，调节pH值，高压蒸汽灭菌后备用。
（2）准备实验器材：接种针、涂布器、酒精灯、无菌棉签等。
2. 平板划线法分离纯种（1）将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基和沙堡培养基上，培养24小时。
（2）将培养好的菌液用接种针在培养基表面划线，重复3-5次，每次划线前需灼烧接种针。
（3）将划线后的培养基倒置，放入培养箱中培养24小时。
（4）观察并记录菌落形态特征，选取单菌落进行纯化。
3. 稀释涂布平板法分离纯种（1）将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基和沙堡培养基上，培养24小时。
（2）用无菌生理盐水将菌液进行10倍、100倍、1000倍稀释。
（3）取适量稀释液用涂布器均匀涂布在培养基表面。
细菌的分离纯化和接种实验
环工综合实验细菌的分离纯化和接种实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验原理问答题：1.为什么湖水用10－4、10－5、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低的浓度？答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中的微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个个体生长而成的，从而方便计数。
2.为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?答：第一，为了防止重力对菌落的生成产生影响；第二，为了防止培养基中的水分蒸发后凝结在壁上，滴落后影响菌的生长和形态观察；第三，防止培养基干涸。
3.微生物常用接种方式有哪些？进行微生物接种应该注意哪些方面？答：⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种，三点接种，浇混接种，液体接种，注射接种，活体接种等。
⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理，接种过程必须在煤气灯旁进行，接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到的器材和菌种培养基有序编号放置，操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品的接触，往培养基是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。
四、实验步骤1.制备细菌稀释液：使用5ml移液管加4.5ml无菌水放入贴有10-3、10-4、10-5、10-6标签的小试管中，用一根1ml的无菌移液管吸取10-2的湖水稀释液0.5ml放入贴有10-3标签的小试六、思考题1.氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillusferrooxidans,T.f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。
广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水（pH<4）中最为常见。
其化能自养，专性好氧，嗜酸，革兰氏阴性，，主要利用利用CO2为碳源，并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。
请思考其分离纯化的方法和步骤。
答：采取酸性矿坑水或实验室浸矿培养液作为菌液，在实验室用9K或Leathen 培养基反复分离纯化。
细菌的分离纯化和接种实验
环工综合实验细菌得分离纯化与接种实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验原理问答题：１、为什么湖水用10－4、１0-5、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低得浓度？答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中得微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在,否则一个菌落就不只就是代表一个个体生长而成得，从而方便计数。
2、为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?答：第一，为了防止重力对菌落得生成产生影响;第二,为了防止培养基中得水分蒸发后凝结在壁上,滴落后影响菌得生长与形态观察;第三，防止培养基干涸。
３、微生物常用接种方式有哪些?进行微生物接种应该注意哪些方面?答:⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种,三点接种,浇混接种，液体接种,注射接种,活体接种等。
⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理,接种过程必须在煤气灯旁进行,接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到得器材与菌种培养基有序编号放置,操作时应避免已经灭菌处理得材料用具与周围得物品得接触，往培养基就是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。
四、实验步骤１、制备细菌稀释液:ﻭ使用5mｌ移液管加４、5ｍl无菌水放入贴有10—3、１0—4、10－5、10-6标签得小试管中,用一根1ml得无菌移液管吸取１0-2得湖水稀释液0、5ml放入贴有1０-３标签得小试管中，1ｍl得无菌移液管吸洗三次以混匀。
然后用另外一支1ｍl得无菌移液管从贴有１0-３标签得小试管中吸取10-3得湖水稀释液0、5ml放入贴1０—4标签得小试管中，吸洗三次以混匀。
同法依次连续稀释六、思考题１、氧化亚铁硫杆菌( Thｉoｂaciｌlｕsfｅrrooxiｄans,Ｔ、f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。
广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉与沉积硫内，尤以金属硫化矿与煤矿等酸性矿坑水(pH<4）中最为常见。
其化能自养,专性好氧，嗜酸,革兰氏阴性,,主要利用利用CＯ2为碳源,并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。
微生物实验中的接种分离和培养操作步骤
微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
细菌的分离纯化和接种实验
细菌的分离纯化和接种实验引言细菌的分离纯化和接种实验是微生物学研究中常用的实验方法之一。
通过这个实验，我们可以将混合细菌群体中的某种特定细菌分离出来，并进行纯化和培养。
本文将介绍细菌的分离纯化和接种实验的步骤和注意事项。
材料和方法实验材料•需要分离的混合细菌样品•无菌培养基•培养皿•灭菌的培养液•灭菌的试管和移液器•灭菌的培养箱•实验台实验步骤1.准备工作–消毒实验台和所需实验用具，保证实验环境无菌。
–准备好无菌培养基和培养皿。
2.分离细菌–从混合细菌样品中取一小部分，加入无菌培养基中。
–用无菌的移液器均匀涂抹混合液在无菌培养皿上。
–将培养皿密封好，放入灭菌的培养箱中进行培养。
3.纯化细菌–经过一段时间的培养，观察培养皿中的菌落情况。
–选择一个孤立的菌落，用无菌的移液器将其转移到另一个无菌培养皿中。
–重复上述步骤，直至获得纯化的菌落。
4.培养细菌–将纯化的菌落转移到新的无菌培养基中。
–用无菌的移液器均匀涂抹细菌液在无菌培养皿上。
–将培养皿密封好，放入灭菌的培养箱中进行培养。
5.接种实验–准备好待接种的培养基和细菌培养液。
–用无菌的移液器取适量的细菌培养液，加入到待接种的培养基中。
–轻轻摇动培养基，使细菌均匀分布。
–将接种好的培养基放入培养箱中进行培养。
6.结果分析–经过一段时间的培养，观察接种后的培养基中细菌的生长情况。
–记录菌落的数量和形态特征，如颜色、形状等。
注意事项•实验过程中要保持实验环境的无菌状态，严禁对细菌样品和培养基进行交叉污染。
•实验操作要轻柔，避免对细菌造成机械损伤。
•实验结束后，要对实验用具进行正确的处理和消毒，防止细菌的传播和感染。
结论细菌的分离纯化和接种实验是微生物学研究中常用的实验方法。
通过这个实验，我们可以从混合细菌群体中分离出特定细菌，并进行纯化和培养。
这些分离纯化的细菌可以用于后续的微生物学研究和实验，为我们深入了解细菌的特性和功能提供了重要的基础。
在实验操作过程中，我们要严格遵守无菌操作的要求，保证实验的可靠性和准确性。
细菌的纯种分离培养和接种技术实验报告
细菌的纯种分离培养和接种技术实验报告一、实验目的本实验旨在掌握细菌的纯种分离培养和接种技术，了解细菌的形态特征及生长习性，并能够正确使用细菌培养基和培养设备。
二、实验原理1. 细菌纯种分离：将混合菌涂于琼脂平板上，经过培养后，可以观察到不同形态和颜色的菌落。
选取单个菌落进行多次传代，最终得到纯种菌株。
2. 细菌培养基：含有必需营养物质的液体或固体培养基，可以提供适宜的环境促进细菌生长繁殖。
3. 细菌接种：将细菌转移到新的培养基中，以便于观察其生长情况。
三、实验步骤1. 准备工作：清洁工作台、消毒琼脂平板和试管等设备。
2. 分离纯种：取一支无菌铅笔，在琼脂平板上划出几条直线。
用无菌铅丝在混合液体中沾取少量后，在平板上均匀涂抹，避免相互重叠。
将琼脂平板倒置在恒温箱中，以适宜的温度和时间进行培养。
3. 传代：观察到菌落后，用无菌铅笔在菌落周围划出一圈。
用无菌铅丝沾取少量菌落，划过圈内，再均匀涂抹于新的琼脂平板上。
重复以上步骤多次，直至得到纯种细菌。
4. 培养：将培养基加热消毒后倒入试管中，待其冷却后，在试管口处焊接一根无菌铁针。
用无菌铁针沾取少量细菌接种于培养基中，放入恒温箱中进行培养。
5. 观察：观察培养基上的细菌生长情况、形态特征和颜色等。
四、实验注意事项1. 实验前要进行必要的清洁和消毒工作。
2. 操作时要保持无菌状态，避免污染。
3. 培养箱应设置适宜的温度和湿度，并定期消毒。
4. 实验结束后要及时清理和消毒设备和工作台。
五、实验结果经过分离和传代，成功得到纯种细菌。
在培养基上观察到细菌的形态特征、颜色和生长情况，并能够正确进行接种操作。
六、实验总结本实验通过对细菌纯种分离培养和接种技术的学习和掌握，使我们更加深入地了解了细菌的形态特征和生长习性，同时也提高了我们的操作技能。
在今后的学习和研究中，这些知识和技能将会发挥重要作用。
实验三：细菌分离接种技术和培养
实验三 细菌分离、接种技术和培养法
目的要求：
1、掌握细菌分离培养的基本要领和方法。
2、掌握平板划线、斜面培养基等接种方法。
3、熟悉细菌分离培养的环境和条件。
实验内容：
1、 细菌划线分离培养：连续划线分离培养法 分区划线分离培养法
2、 纯培养获得与移植：试管间的斜面移植； 可疑菌落纯培养移植
Staphylococcus epidermidis on blood agar With on hemolysis
细菌纯培养
细菌斜面 纯培养法
细菌纯培养
液体培养基
半固体培养基穿刺培养
实验报告：
1、细菌分离培养和纯培养的实验过程。 2、本次细菌分离培养的结果。
细菌划线分离培养
Streptococcus pyogenes on blood agar, illustration b-hemolysis.
Streptococcus pneumoniae on blood agar, illustration a-hemolysis.
Staphylococcus aureus on blood agar, illustration b-hemolysis.
3、 液体培养基增菌和培养（示教）
4、 半固体培养基穿刺培养（示教）
说明：
病原菌的人工培养一般采用35～37℃，培养时间多数为18～24 h，但有 时需根据菌种及培养目的作最佳选择，如细菌的药物敏感试验则应选用对数 期的培养物。将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散 作用，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。一般 经过18～24 h培养后，单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团，称为 菌落（colony）。挑取一个菌落，移种到另一培养基中，生长出来的细菌均 为纯种，称为纯培养（pure culture）。从混杂的微生物群体中获得只含有 某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。微生物在固体培养 基生长形成的单个菌落一般是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取 单菌落而获得一种纯培养。
分离纯培养与接种的技术整理
接种技术的无菌操作
(3)、在涂布平板法中要注意三角玻璃棒的灭 菌及将菌液均匀分散至整个平板表面 （4）、在倾注平板法中摇培养皿时要注意适当 4） 用力度及摇的方向有序（前后左右）确保菌悬 液和培养基不会沾到培养皿上盖，以防影响培 养及观察
5）培养方面 a.注意培养皿的倒置培养 b.控制好不同的培养基的培养时间和 培养温度
３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或 穿刺接种 研究微生物的动力时常采用此法。做穿 刺接种时，用的接种工具是接种针。用 的培养基一般是半固体培养基。它的做 法是：用接种针蘸取少
4 ）液体接种
从固体培养基中将菌洗下， 倒入液体培养基中，或者从液体培养物中， 用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液 体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可 称为液体接种。
分离纯培养与接种技术
小组成员：陈爱艺（组长） 洪青青、赵丽娜、王燕春
该技术的主要内容介绍
该技术可分为两部分：分别为分离纯培养技术 和接种技术 1 1、分离纯培养技术 含有一种以上的微生物培养物称为混合培养 物。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个 亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养。分离纯 化是从混杂的微生物群体中获得微生物单一菌 株纯培养，把特定的微生物从自然界混杂存在 的状态中分离、纯化出来的纯培养技术
d.稀释摇管法
先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热 使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右， 使琼脂熔化后冷却并保持在 ℃左右，将待分 离的材料用这些试管进行梯度稀释， 离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速 摇动均匀，冷凝后， 摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭 菌液体石蜡和固体石蜡的混合物， 菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和 空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。 空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间
实验三 细菌纯种分离、培养和接种技术
实验三细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
二、实验原理水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37°C24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。
水的大肠菌群数是指lOOmL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
三、实验材料1、菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
2、大肠菌群的测定：1)培养基：①乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g,乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL,水1000mL,pH7.4。
制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH,加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL,,并倒置放入一个杜氏小管，121C灭菌15min。
②伊红美蓝琼脂培养基：制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装.121C灭菌15min备用。
平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。
四、实验方法1、水样的采集：1）自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min,以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
细菌的纯种分离
2.0g，水 100ml,pH7.2-7.4.
灭菌条件：121 摄氏度（相对蒸气压力为 0.103MPa）,20min.
(2)加棉塞、包装后灭菌。
4.斜面的制作 灭菌后如需制成斜面培养基，应在培养基冷却至 50-60 摄氏度，将试管搁置成 一定的斜度，斜面高度不超过试管总高度的 1∕3。
（三）稀释水的制备
细菌的纯种分离、培养和接种技术及菌落形态的观察
班级：09 环科二班 姓名：李建文 学号：200930260213 一、 实验目的：
（1）熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 （2）了解配制微生物培养基的基本原理，掌握常规的配制、分装培养基的方法。
（3）学会各类物品的包装、配制（稀释水等）和灭菌技术。 （4）从湖水中分离、培养微生物，掌握常用的分离微生物的方法。 （5）学会接种技术。 （6）观察分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落形态特征。 （7）通过观察和比较细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的菌落特征，
（1） 分装试管：将培养基趁热加至漏斗中。分装时左手并排地拿数根试管，
右手控制弹簧夹，将培养基依次加入各试管，用于制造斜面培养基时，一般装
量不超过试管高度（15mm*150mm）的 1∕5.分装时谨防培养基沾在管口上，否
则会使棉塞沾上培养基而造成染菌。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，Nacl
达到初步鉴别上述微生物的能力
二、 实验原理：
1、培养基原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖 的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水， 按一定的体积分数配制而成。调整合适的 pH，经高温灭菌后以备培养微生 物之用。本实验配制固体培养基，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体 培养基中加入凝固剂使呈固态。通常加入质量浓度 15-20g∕L 的琼脂为固体 培养基。
细菌接种、分离纯化和培养技术(2)
细菌接种、分离纯化和培养技术（2）２、涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。
（图３－５，b）３、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。
用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
（图３－６）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
（图３－７）４、富集培养法富集培养法的方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。
所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。
在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
图３－６平板划线分离法1.斜线法>2.曲线法>3.方格法>4.放射法>5.四格法５、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。
然后快速冷却，并进行接种。
接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。
另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。
有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
三、培养微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ等。
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理微生物纯种分离、培养及接种技术是微生物学中最基本的实验技术之一。
其目的是从混合的微生物菌群中分离出单一的微生物菌落，并在适宜的培养条件下进行纯化和生长，以获得纯种微生物。
一、实验器材和试剂1.灭菌针2.毛细胞计数板3.显微镜4.平板接种器、针头5.无菌匀浆棒、吸管6.细菌培养基7.消毒液二、实验步骤1. 样品处理及制备首先需要选择一份待测试的样品，包括土样、水样、空气、食品等，然后将样品采集到无菌容器中，再将其送到实验室。
在进行样品处理之前，需要先进行简单的初步处理，将样品进行稀释或者过滤，将其中的杂质和大颗粒物去除，以利于后续实验的操作。
接下来需要进行制备培养基，根据不同的微生物种类，需要选择适当的培养基进行培养。
通常情况下，我们可以使用凝胶培养基、液体培养基、甜菜汁培养基等，以满足微生物在不同环境下生长所需的营养物和成分。
2.分离纯化分离纯化是该实验的关键步骤。
将经过预处理的样品移到无菌试管中，打开试管口，加入适量的制备好的培养基，然后利用匀浆棒或吸管将混合物均匀混合。
然后利用平板接种器将混合物接种到培养基平板上，使其密切接触。
然后将接种好的平板置于恒温箱中，以利于微生物的生长和营养物质的自我繁殖。
在接种后2-7天内，不同类型的微生物将在培养基平板上生长出不同的菌落，每一种菌落都代表一种单一的微生物。
将这些菌落分离提取，并再次进行培养，就能得到单纯的微生物菌种。
3.纯种微生物菌种接种在获得单纯的微生物菌种之后，需要将其再次接种到培养基中进行培育。
将相应体积的纯种菌种接种到培养基平板上，使其能够生长繁殖。
在接种后约24小时内，微生物将在培养基中生长出许多菌落。
根据菌落的特征和形态，可以对不同的微生物进行鉴定和分类。
如果需要进行更加深入的分析，可以对微生物菌种进行进一步培养、萃取定量和测序等工作，以获取更多的相关信息。
三、实验注意事项1. 实验前需要保证实验室内部环境和仪器均为无菌状态。
实验三细菌的分离培养及移植复习过程
利用还原能力强的化学物质，将ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ境或培养基内的氧气消耗，或还 原氧化型物质，降低氧化-还原电势。
• 焦性没食子酸法: 平板培养法、Buchner氏试管法、史氏厌氧培养 法、平皿厌氧培养法 、玻罐或干燥器法
• 李伏夫（B.M.JIbBOB）氏法 (1) 硫乙醇酸钠法：液体培养基法、固体培养基法
两个概念：
在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基 本技术之一。
分离：从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的 方法；
纯培养：一株菌种或一个培养物中所有的细菌 都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
划线培养时注意问题：
• 左手持皿，用左手拇指、食指及中指将平皿揭 开约呈20°的角度(图1)；
• 右手持接种环，灼烧冷却后从混合培养肉汤中 取少量涂布于培养基边缘，开始划线(图2)；
（二）细菌在明胶柱穿刺培养中的生长表现
取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱， 置22℃温箱 中培养后观察其液化情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相同(见图9)。
（三）细菌在液体培养基中的生长表现
将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤 中，培养后观察其生长情况(见图10)。
2.琼脂斜面上生长表现 将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上（自底部 向上划一直线），培养后观察其生长表现。(见图7 )
3．琼脂柱穿刺培养中的生长表现 将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中 ，培养后观察其生长表现。(见图8)
图7 琼脂斜面培养的菌落表现
图8 琼脂柱穿刺培养的菌落表现 1.线状；2．棘状；3．珠状； 4．绒毛状；5．根状
图9 细菌明胶柱穿刺培养生长表现 图10 细菌在肉汤中生长表现
细菌的接种及分离培养
细菌的分离—平板划线法
分区划线法： 连续划线法：
第一区划线
灭菌接种环
第二区划线
灭菌接种环
第三区划线
灭菌接种环
1.分区划线法
2.连续划线法
（三）细菌的纯种接种法
当细菌分离成纯种后，常需要接种到相关的培养基中，以测试其各种生物学性状。一般可用斜面、半固体、液体培养基来检验细菌的培养特性，相应培养基的接种方法有三种。Biblioteka 03044
3
一般培养（需氧培养）：
培养温度：35℃（采用恒温培养箱）
培养时间：18～24h
二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱
厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等
3
4
四、细菌培养法
细菌在固体培养基中的生长现象
菌落： 定义：指单个细菌在平板培养基上37℃18-24h的生长繁殖，形成单一的肉眼可见的细菌集团。 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。
实 验 6
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细菌培养法
一、目的要求
单击此处添加副标题
1、掌握细菌的一般培养法； 2、掌握细菌培养的接种方法，进一步熟悉无菌操作技术。
3
菌种：葡萄球菌培养物、大肠杆菌培养物、枯草杆菌培养物、变形杆菌培养物；
实验器材：接种环、接种针、酒精灯；
培养基：普通琼脂平板、试管斜面、液体培养基、半固体培养基；
菌落与菌苔
菌落（S型）
菌苔
菌落（R型）
菌落的形态特征有助于细菌的鉴别
细菌在液体培养基中的生长现象
实验3：细菌的分离与纯化
实验3 微生物的纯种分离培养微生物广泛地分布在自然界的土样、水体、空气、动植物体表及人体、动物体的排泄物中。
它们以单个的菌体、无性孢子和芽孢的形式存在。
由于单一的自然界环境并不能完全满足微生物对水、空气、营养物质、温度、pH的综合要求，它们往往以“散居”的状态出现，而不能形成人们肉眼可直接观察到菌落。
不同的自然环境中，微生物的种类和数量差异很大。
肥沃的土壤，富养化的水体，是许多微生物麇集、孳生的场所，在这里存活着能分解淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素、木质素、果胶、农药、含磷有机物（卵磷脂、肌醇、核酸等）、石油以及溶解铜矿的细菌、放线菌、真菌等多种类的微生物，如何根据微生物的生理要求，按照人类的需求，将它们从自然界中分离出来，获得纯种，发挥微生物的特长为人类的生产和生活服务，是微生物研究中最基础的实验技术。
一、实验目的：1．学会将混杂的各种微生物分离成纯种，统计分析样品中微生物的种类和数量的方法。
2．学会从菌落及培养特征区分细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。
3．学会好氧微生物平板及斜面培养的方法。
二、实验原理：在自然界中，微生物的种类很多，数量很大，为了获得单个菌体，首先必须把要分离的材料进行适当的释放，按其生长所需要的条件，使其在平板上，由一个菌体繁殖成单个菌落，这样，就能从中挑选出所需要的纯种，由于细菌、放线菌和霉菌所要求的营养条件不同，利用不同的培养基制成平板进行分离，然后从菌落形态上的差异，可以把细菌、放线菌和霉菌三大类群区分并可计算出其数量，分别接种到试管斜面上，然后，在平板上反复进行分离培养，最后可获得纯种。
三、实验材料和用具：1．材料（1）土壤样品（2）培养基：①牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基（%）牛肉膏0.3-0.5g蛋白胨 1.0gNaCl 0.5g琼脂 2.0g蒸馏水100mLpH 7.2-7.4，0.1Mpa 压力，灭菌20-30分钟。
配制液体培养基时不加琼脂；半固体培养基加0.3-0.5%琼脂。
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实验三细菌纯种分离、培养和接种技术
一、实验目的
(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
二、实验原理
水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
三、实验材料
1、菌落总数的测定：
1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
2、大肠菌群的测定：
1)培养基：
①乳糖胆盐蛋白胨培养基：
蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。
制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，121℃灭菌15min。
②伊红美蓝琼脂培养基：
制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。
四、实验方法
1、水样的采集：
1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。
如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。
2、细菌总数的测定：
1)水样稀释及培养：
①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释；
②根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
2)计算方法：
作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。
3)计数的报告：
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。
如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。
若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。
为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示。
3、大肠菌群的测定(多管发酵法)：
①初步发酵试验：
在10支装有10mL的乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入稀释后的水样1mL。
摇匀后，37℃培养24h。
②平板分离：
经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37℃培养18—24h。
大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
③复发酵试验：
将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
五、实验结果
1、自来水中细菌总数计算。
2、湖水水样初发酵现象观察。