高产木聚糖酶菌株的筛选及其产酶特性试验

高产木聚糖酶菌株的筛选及其产酶特性试验

Selection of high xylanase yielding bacterium strain and its enzyme producing

property

虢国成

GUO Guo-cheng

（长沙理工大学生物与食品工程学院，湖南长沙410076）

（College of Biology and food Engineering,Changsha University of Science and Technology,Changsha,Hunan410076,China）

摘要：寻找一种新的产木聚糖酶菌并从整体上降低木聚糖酶的生产成本.本试验以湖南岳阳某厂的土壤为样品，利用透明圈比较法和DNS法相结合，筛选出26株产木聚糖酶菌，并从中分离、纯化出一株高产木聚糖酶菌—S6，通过对S6菌株的发酵条件和产酶规律的试验,结果表明：S6菌株产酶的最优条件是以自制玉米半纤维素为碳源、添加0.2%硝酸铵、pH值为5.5浓度为0.01mol/L的柠檬酸－磷酸二氢钠缓冲体系的培养基中，28℃培养75h，菌生长进入对数期，酶活最大，达到156.2 U/mL。

关键词：高产木聚糖酶菌；筛选；产酶特性

Abstract:Objective and methods:Taking sample from Hunan Yueyang Pulp and Paper-made Factory and Yueyang Tree Cultivation Factory as raw materials,a strain of high xylanase yielding bacteria was screened and purified from26strains of xylanase yielding bacteria by means of clearing halo comparison and DNS.Results: Optimal fermentation condition and property of enzyme producing were investigated, experimental results showed that the optimal fermentation condition of S6is as follows:using the corn as the sole carbon,adding0.2%NH4NO3with a pH value of 5.5,0.01mol/L concentration of citric acid-NaH2PO4solution,cultivation temperature of28℃in loarithmic phase fors75h.Conclusion:Bacterium strain possessing a enzyme activity of156.2U/mL was achieved.

Keyword:High xylanase yielding bacrerium;Screen;Enzyme producing property

木聚糖是一种多聚五碳糖,是半纤维素的一种主要成分,在自然界中占植物干重的35%，是自然界中第二丰富的再生物质资源[1～2]。微生物产生的木聚糖酶能将木聚糖水解成寡聚木糖和木糖[3～4]。现已广泛在饲料工业,造纸业，印染工业，食品工业等中[5]。

本试验采集湖南岳阳造纸厂和岳阳锯木厂的土壤样品，经以自制玉米芯半纤维素为唯一碳源的筛选培养基选择培养，分离出耐酸性高产木聚糖酶菌，通过对该菌性质和培养条件的优化试验，为更好的把握菌种产酶情况，寻找一种新的产木聚糖酶菌和从整体上降低木聚糖酶的生产成本提供一定的理论基础。

1材料与设备

1.1试验原料

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作者简介：虢国成(1958-)，男，长沙理工大学生物与食品工程学院讲师。

E-mail:guoguocheng2006@

收稿日期：2008-01-27

土样：湖南岳阳造纸厂和岳阳锯木厂的土壤堆料厂。

1.2培养基[6，7]

1.2.1筛选培养基10%自制玉米半纤维（见1.4），0.2%NaNO 3，0.1%K 2HPO 4，0.05%KCl，

0.05%MgSO 4·7H 2O，0.01%FeSO 4·7H 2O，pH 5.0～5.5。用于筛选产木聚糖酶菌种和

菌种性质分析。

1.2.2复筛培养基0.5%木聚糖（Sigma），0.2%NaNO 3，0.1%K 2HPO 4，0.05%KCl，

0.05%MgSO 4·7H 2O，0.01%FeSO 4·7H 2O，pH 5.0～5.5。用于产木聚糖酶菌的复筛。

1.2.3斜面、平板培养基20%马铃薯，2%葡萄糖，2.0%琼脂，pH 5.0～5.5。用于菌种分离、纯化和保藏。

1.2.4发酵培养基6%自制玉米半纤维（见1.4），5%麸皮，0.2%NaNO 3，0.1%K 2HPO 4，0.05%KCl，0.05%MgSO 4·7H 2O，0.01%FeSO 4·7H 2O，pH 5.0～5.5。用于菌种的扩

大培养。

上述培养基均在121℃灭菌20min。

1.3主要仪器

京制00000249号电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；

YXQ-LS-18S 自动手提式灭菌器：上海博讯；

HZQ-F160全温立式振荡培养箱：太仓华美生化仪器厂；

101A-3ET 电热鼓风恒温干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；

HG303-4电热恒温培养箱：南京实验仪器厂；

净化工作台：安徽蚌埠市瑞风净化设备工程有限公司；

HH-60数显恒温搅拌循环水箱：常州国华；

722型紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；

TGL16台式高速冷冻离心机:湖南仪器仪表总厂离心机厂。

1.4主要试剂

木聚糖（Sigma公司），木糖（Sigma公司），硝酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钾，硫酸铁，琼脂，酒石酸钾钠，3,5-二硝基水杨酸，氢氧化钠，苯酚，亚硫酸钠，磷酸氢二钠，柠檬酸液，刚果红；

半纤维素：以玉米芯为原料，参照文献[8，9]自制；

DNS 试剂:2.08%NaOH,0.6%3,5-二羟基水杨酸，36.4%酒石酸钾钠,0.5%苯酚,0.5%无水亚硫酸钠，蒸馏水配制,避光放置1周后使用；

市售蔗渣、麸皮、玉米芯、稻草。

（除特别说明外，皆为分析纯）

2试验方法

2.1出发菌种的筛选

2.1.1菌种的初筛分别采集岳阳造纸厂内草料场的腐叶烂草，岳阳锯木厂的锯木堆、杉树堆、木材堆、乱木堆3cm内的土壤样品5份。称取各土壤样品10g至90mL 的无菌生理盐水中，摇匀，并分别稀释至10-5、10-6、10-7倍。取各稀释梯度菌悬液0.1mL涂布于已灭菌的筛选培养基平板中，28℃静置培养72h。利用透明圈法，对菌种进行挑选[10]。

2.1.2菌种的复筛将挑选的菌种，分别接入复筛液体培养基和平板培养基中，28℃下培养72h，测定菌种产酶能力（O.D 540大小表示）和D/d（透明圈直径/菌落

直径)值，从中筛选高产木聚糖酶菌株，并对其进行分离、纯化。接种于斜面培养基上，4～6℃冰箱保藏，备用。

2.2酶活力测定[11，12]