荧光光谱
荧光 光谱
2）荧光偏振
（1）荧光偏振现象及用途 一旦用偏振光照射，从许多样品出射的光也是偏 振的。当样品各个方向出射的偏振光是不相同的，可 以说样品显示出偏振的特性。 研究偏振可以提供分子及周围环境更多的信息： 偏振光照射到荧光分子上，分子对光的吸收和发 射过程与分子框架相对偏振光的偏振方向相关。 荧光偏振可以用来测量蛋白质的变形，蛋白质的 结合以及蛋白质的内部动力学。
3）.荧光能量共振转移
4). 时间分辨光谱： 输入脉冲，然后进行对接收的信号进行相应分析。 时间分辨寿命；时间分辨各向异性。
荧光各向异性可以采用稳态测量，也可以用瞬态方 法进行测量。稳态测量是得到的是一个平均值，虽然 容易解释，但需要做很多假设。 瞬态测量是测量脉冲激发后的时间相关各向异性。 可以直接从实验数据中观察得到并进行解释。 各向异性与样品尺寸、形状以及标记分子的柔性 相关，需要从各种分子模型进行计算拟合。 各向异性衰减可以从TD或FD方法得到。 目前还是采用时间分辨进行测量。
2-3个数量级，比原子吸收分光光度法高103 ～104
倍，检测限可
分析成本低
设备简单，操作简单快速，计算机进行仪器控制和数据处理 提供激发光谱、发射光谱等许多信息
2).荧光光谱的特征 a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波
长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量 ( 如
荧光寿命
当某种物质被一束激光激发后,该物质的分子吸 收能量后从基态跃迁到某一激发态上,再以辐射跃迁 的形式发出荧光回到基态.当激发停止后,分子的荧光 强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间称为荧光 寿命.
5). 荧光标记
荧光光谱分析
百泰派克生物科技
荧光光谱分析
荧光光谱法（又称荧光分析法或分光荧光测定）是一种电磁光谱法，可以测量样品吸收光子后发出的光子强度。
实际上，大多数荧光分子是芳香族的，如蛋白质/肽中的色氨酸。
光学技术，如UV-Vis、圆二色谱（CD）、傅立叶变换红外（FTIR）和荧光光谱，都被用于获取被测化合物的结构、相互作用和动力学信息。
荧光光谱是研究溶液状态和显微镜下蛋白质/肽的实时结构和动力学的重要研究工具。
荧光光谱分析。
生物制药，特别是蛋白质和多肽类药物，在整个研发过程中都面临着独特的挑战。
在成功批准和上市之前，需要对治疗性蛋白质/肽的生物物理、生化特性和3D结构有透彻的了解，因为产品的活性、稳定性、毒性、功效和保质期会因结构-活性关系而受到影响。
与小分子不同，这些大分子需要多种分析方法结合进行分析。
荧光光谱法可应用于：1，通过改变荧光强度来探测结构变化或两个分子的结合；2，通过色氨酸荧光的波长定位色氨酸残基（在蛋白质表面或深埋在蛋白质内部）；3，通过荧光偏振和各向异性研究荧光团迁移率。
荧光发光光谱
荧光发光光谱荧光光谱（也称为荧光测定法或荧光分光光度计）是一种分析样品荧光的电磁光谱学。
它涉及使用一束光，通常是紫外线，激发某些化合物分子中的电子并使它们发光；通常但不一定是可见光。
一种补充技术是吸收光谱。
在单分子荧光光谱的特殊情况下，发射光的强度波动是从单个荧光团或荧光团对测量的。
测量荧光的设备称为荧光计。
分子具有称为能级的各种状态。
荧光光谱主要关注电子和振动状态。
通常，被检查的物质具有感兴趣的基电子态（低能态）和较高能的激发电子态。
在这些电子状态中的每一个中，都有各种振动状态。
在荧光中，物质首先通过吸收光子从其基态电子状态激发到处于激发电子状态的各种振动状态之一。
与其他分子的碰撞导致激发分子失去振动能量，直到它从激发电子态达到最低振动状态。
然后分子再次下降到基电子态的各种振动水平之一，在此过程中发射光子。
由于分子可能会下降到基态的几个振动能级中的任何一个，因此发射的光子将具有不同的能量，从而具有不同的频率。
因此，通过分析荧光光谱中发出的不同频率的光，以及它们的相对强度，可以确定不同振动能级的结构。
对于原子种类，过程是相似的；然而，由于原子种类没有振动能级，因此发射的光子通常与入射辐射处于相同的波长。
这种重新发射吸收的光子的过程是共振荧光，虽然它是原子荧光的特征，但也可以在分子荧光中看到。
在典型的荧光（发射）测量中，激发波长是固定的，而检测波长是变化的，而在荧光激发测量中，检测波长是固定的，而激发波长在感兴趣的区域中是变化的。
发射图是通过记录一系列激发波长产生的发射光谱并将它们组合在一起来测量的。
这是一个三维表面数据集：作为激发和发射波长函数的发射强度，通常描绘为等高线图。
荧光光谱
延迟荧光与普通荧光的区别主要在于 辐射寿命不同 。这种长寿命 的延迟荧光来源于从第一激发三重态（T1）重新生成的S1态的辐射跃 迁。即延迟荧光产生的过程为：
S1→T1→S1→S0+hνf
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延迟荧光 E型延迟荧光：
当第一激发单重态S1与第一激发三重态T1能差较小时，T1态有时可从 环境获取一定的热能后又达到能量更高的S1态。即
跃迁过程中电子自旋发生了改变、跃迁前后电子的轨道在空间不
重叠或轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的。
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失活的途径
电子处于激发态是不稳定状态，容易返回基态，在这个过程中通过
辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程就称为失活。
失活途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越 内转换
外转换
振动弛豫
= s[Iεscs/(Isεc)]
s、 εs、cs和Is分别是参照物的荧光量子产率（已知）、摩尔消光系数、溶 液浓度和荧光强度； 、 ε 、c和I分别是被测物的荧光量子产率（未知）、摩 尔消光系数、溶液浓度和荧光强度。 参照物应是已知、无自吸收、无浓度猝灭、在被测物所用溶剂中可溶、易
纯化、稳定和对杂质不敏感的物质。常用的参照物如罗丹明B和喹啉硫酸氢盐
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大。
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无辐射跃迁失活的途径 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振 动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时 间一般为10-12 s。 内转换：多重度相同的电子能级中等能级间的无辐射 能级跃迁。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一 激发单重态的最低振动能级。
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分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 激发： 基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级 )：吸收 特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 失活： 激发态 →基态：多种途径和方式 (见能级图)；速 度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
荧光光谱的原理和应用
荧光光谱的原理和应用1. 荧光光谱的基本概念•荧光：荧光是指物质受到激发后，在短时间内吸收能量并发出较长波长的光。
•荧光光谱：荧光光谱是指在特定激发光源照射下，物质发出的荧光光在不同波长下的强度分布。
•荧光发射：当物质受到激发并返回基态时，通过辐射发出光的过程称为荧光发射。
2. 荧光光谱的原理2.1 荧光激发和发射•荧光激发：物质受到外界能量的激发，电子从基态上升到激发态。
•荧光发射：激发态电子回到基态的过程中，通过辐射发出光。
2.2 荧光激发与发射能级•电子能级：物质中的电子具有不同能量的电子能级。
•激发态：电子从基态跃迁到更高能级的状态称为激发态。
•发射态：电子从激发态回到基态的状态称为发射态。
2.3 荧光与分子结构•分子结构：不同分子结构对荧光发射的波长和强度有影响。
•良好的激发能量传递：分子结构中共轭体系的存在有助于良好的激发能量传递。
3. 荧光光谱的应用3.1 荧光光谱分析•分析特性：荧光光谱可以提供物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
•应用领域：荧光光谱分析广泛应用于环境监测、生物医学、食品安全等领域。
3.2 荧光探针和标记物•荧光探针：利用荧光探针可以对生物分子进行检测和定量分析。
•标记物应用：荧光标记物在生物学领域中的应用非常广泛，例如细胞成像、蛋白质定位研究等。
3.3 荧光荧光显微镜•荧光显微镜：利用荧光显微镜可以观察和研究生物样本中的荧光信号，无需对样本进行染色处理。
•应用领域：荧光显微镜被广泛应用于生物学、医学和材料科学领域。
3.4 荧光染料•荧光染料：具有良好荧光性能的化合物，可以用于荧光显微镜观察、荧光分析和药物研究等方面。
•应用领域：荧光染料广泛应用于细胞成像、分子探针、生物传感器等领域。
4. 总结荧光光谱是一种重要的光谱学技术，在科学研究和应用中具有广泛的应用前景。
通过荧光光谱可以获得物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
荧光光谱在环境监测、生物医学、食品安全等领域发挥着重要作用。
荧光光谱
OH H2C O HO O H2C OH HO OH O HO C H2 O OH OH OH O HO O HO CH2 O HO O CH2 HO OH O O OH HO O HO O HO H2C OH
OH
O
CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2
HO
OCH2CH2(OCH2CH2)n OH
β－CD∶OP 加合物的组成
用摩尔比法测定了βCD∶OP 二元体系的组 成. 由图4 可以看出, β - CD 与OP 的摩尔比为1∶1 , 说明在溶液中形成了 1∶1 的二元加合物,
加合物形成的机理及其结构
OP 疏水性烷基链的长 度、径度和体积分别为 1.036 nm、0.400 nm和 0.216 nm3 。 β- CD 空腔的深度 (0.780 nm) 、空腔口直 径(0.780 nm) 和体积 (0.346nm3 ) 相比, OP 的 疏水性烷基链中至多有 6 个碳被包络在空腔内, 其余未被包络部分和极 性头基位于空腔外
H2C
H2C
CH3 N
NpMA
PyMA
DMAA AMPS NpMA PyMA
AIBN DMF
乙醚
乙醇多次洗涤干燥
萘和芘标记聚电解质在水溶液中的紫外光谱和荧光光谱
在水溶液中的紫外吸收 光谱与小分子萘和芘的 光谱基本相同, 说明萘 和芘标记到聚电解质上 并没有对它们的光谱结 构产生明显影响, 而且 混合溶液表现出两者光 谱的迭加. 290 nm 处萘有一吸收带, 而芘的吸收很弱, 所以 在混合溶液中可用290 nm 激发萘; 343 nm 处仅 有芘的吸收, 因此可用 343 nm 选择性地激发芘.
330 nm 为中心的发射带 是萘的荧光, 360～ 440 nm 是单体态芘的发射光 谱, 480 nm 是芘激基缔 合物的发射光谱.
荧光光谱名词解释
荧光光谱名词解释
以下是几个与荧光光谱相关的常见名词的解释：
1. 荧光：荧光是指物质吸收光能后，在经历激发态到基态跃迁过程中发出的光辐射。
这种光辐射通常具有较长的波长，可见光范围内的颜色。
2. 激发：激发是指将物质从基态转移到激发态，使其能级上升，通常是通过吸收光能或其他能量来实现。
激发是产生荧光的前提条件。
3. 激发光源：激发光源是用于激发荧光的光源。
常见的激发光源包括紫外线灯、激光器和白炽灯等。
激发光源的选择通常取决于所研究的物质的特性和所需的激发波长。
4. 荧光发射：荧光发射是指物质在激发后返回基态时所发出的光辐射。
荧光发射的波长范围通常比激发光波长长，且具有特定的荧光峰。
5. 荧光光谱：荧光光谱是通过测量荧光发射强度随波长的变化而得到的图谱。
荧光光谱可以提供有关物质荧光性质的信
息，如发射波长、发射强度和荧光峰的位置等。
6. 荧光光谱峰：荧光光谱峰指荧光发射谱中最强的发射峰。
荧光光谱峰的位置和强度可以提供关于物质结构和荧光特性的重要信息。
7. 荧光量子产率：荧光量子产率是指物质发生荧光的效率，即荧光发射光子数与吸收光子数之比。
荧光量子产率越高，表示物质更有效地发出荧光。
以上是一些与荧光光谱相关的名词解释。
荧光光谱是研究物质荧光性质和特征的重要工具，广泛应用于生物化学、材料科学、分析化学等领域。
荧光激发光谱和发射光谱
荧光激发光谱（ex）和发射光谱（em）1、荧光和磷光均为发光光谱，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱来确定。
绘制激发光谱时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱（excitation, ex）。
激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。
当然，在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态的分子数目是最多的，这说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光。
2、如果固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光发射光谱（emission, em）。
在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。
3、荧光（磷光）发射光谱特征：（1）Stokes 位移：在溶液中，分子荧光波长总是大于激发光的波长，这种波长移动的现象称为Stokes 位移。
这是由于激发分子通过振动弛豫和内转换损失了部分激发能，也由于溶液中溶剂分子与激发分子的碰撞，也会有能量的损失。
因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
（2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关：因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到不同的电子激发态，而具有几个吸收带。
由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能级（荧光光谱的定义：从第一振动激发单重态跃迁到基态各个振动能级），所以荧光发射光谱与激发波长无关。
（3）镜像规则：通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。
荧光为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个振动能级而形成，其形状与基态振动能级分布有关。
荧光光谱缩写
荧光光谱缩写荧光光谱缩写（FluorescenceSpectroscopy）是一种研究物质结构和活性的常用技术，它可以获得物质中离子、激发态、和荧光能带等高分辨率的光谱信息，常用于鉴定、分析和研究物质结构和活性。
荧光光谱是基于物质本身能够吸收光谱，然后发射出对应频率长度的光谱，来测量物质结构和活性。
它是一种无损测量技术，可以在原位测量，无需样品的剥离，能够获得物质结构和活性的高精度数据。
荧光光谱研究的结果包括吸收光谱、激发态、和荧光能带等信息。
吸收光谱是根据物质的结构，在不同的频率长度入射的光，物质会有不同程度的吸收，研究其吸收率变化可以了解物质的结构。
激发态是物质中激发态电子在不同跃迁时发出的能量，研究其激发态，可以获得更多关于物质结构的信息。
荧光能带是激发态电子跃迁到其它能态时，所释放的能量的波长范围，研究荧光能带可以了解物质中活性的程度和结构变化。
荧光光谱研究广泛用于地球科学、材料科学、生物科学、分析化学等领域，也经常被应用在大气物质、生物样品和地质样品等实际工程中。
其优势是在不同温度，物质中吸收光谱、激发态、和荧光能带的变化可以被准确测量，可以帮助科学家研究物质的动态性质和结构变化，能够获取有关物质结构的定量数据。
荧光光谱的研究有很多种技术，包括单量子荧光（Single-Photon Fluorescence）、多量子荧光（Multiphoton Fluorescence）、多光子共振荧光（Multiphoton Resonance Fluorescence）、共振能量转移荧光（Resonance Energy Transfer Fluorescence）等，被广泛应用在各种研究领域，用来检测并了解物质的结构和活性。
荧光光谱研究结合了物理和化学，是一种重要的物质研究手段，它可以提供近似于分析化学实验的结果，不仅可用于鉴定、分析和研究物质结构和活性，还可以用于其它科学研究中，比如药物研究、水处理、空气治理等。
荧光光谱原理
荧光光谱原理荧光光谱原理荧光光谱是一种常见的分析方法，常用于化学、生物学、药学等领域。
下面，我们将详细介绍荧光光谱的原理及其应用。
一、荧光现象的基本原理荧光现象是指某些物质受到激发后，能够发出比激发光波长长的荧光。
这种现象的实现需要三个条件：激发光源，荧光物质及荧光检测系统。
其中，荧光物质是关键，只有某些物质具有这种特性。
二、荧光光谱图的基本构成荧光光谱图是用荧光物质受到特定波长的激发后，发出荧光的辐射能量与波长之间关系的曲线图。
其基本构成有以下四个参数：激发波长，发射波长，发射强度及荧光寿命。
激发波长：又称刺激波长，是激发荧光物质时所使用的波长。
发射波长：是荧光物质在受到激发后所发出的荧光辐射波长。
发射强度：是荧光物质发射的荧光辐射强度。
荧光寿命：是荧光物质在激发后发射荧光的时间长度。
三、荧光光谱的应用1. 化学分析：荧光光谱可以用于药物、生化试剂的分析，还可以用来探测污染物质和有毒化合物。
如气相色谱-荧光检测法(GC-FLD)检测环境中苯骈克星的浓度。
2. 生物医学：荧光光谱可以用于细胞成像、蛋白质分析、DNA测序、荧光定量PCR等领域。
如荧光定量多聚酶链式反应(qPCR)检测病毒RNA的表达水平。
3. 材料检测：荧光光谱可以用于材料表面缺陷的检测、矿物物质含量的分析等，如纳米粒子的荧光检测。
四、荧光光谱技术的优越性与传统的分析技术相比，荧光光谱技术具有很多优势，如高灵敏度、快速、准确性高、无需预处理、不易受样品污染等。
综上所述，荧光光谱技术在许多领域都有着广泛的应用前景。
相信在未来的发展中，荧光光谱技术将会更加成熟和完善，驱动着科技的进步和实践的发展。
荧光光谱
（一）荧光光度法
（3）.影响生物荧光的因素 3.1.样本种类 3.2.生物新陈代谢水平 3.3.环境温度 3.4.pH 3.5.处理方式
（二）荧光物质
荧光发色团---能够发射出荧光的物质 荧光物质分为： 自体荧光发色团 荧光探针（药物荧光剂）
（二）荧光物质
（1）自体荧光发色团 1.1自体荧光的定义 1.2产生自体荧光的三个条件： 组织中包含足够浓度的内源性荧光物质 组织能吸收激发的光量子 组织能辐射出次级光量子
（二）荧光物质
（2）荧光探针 荧光探针的定义 荧光检测中的荧光探针：微环境探针--环境黏度和极化率 分子运动探针--分子动力学 结构探针--分子静力学
（二）荧光物质
（3）量子点 有机染料的两个缺点 量子点的优点： 发射光谱覆盖范围广 同时检测不同种类的生物信息 持续时间长 反复多次激发，动态观察
（三）荧光光度计
测量对象：物质的激发光谱、发射光谱、时间分辨荧光光谱 荧光光度计的构成：光源、单色器、样品仓、 检测器、机械装置、控制电路
（三）荧光光谱的应用
荧光光谱分类： （1）稳态荧光光谱 1.1自体荧光光谱 1.2药物荧光光谱 （2）瞬态荧光光谱
（三）荧光光谱的应用
3.1自体荧光光谱的应用 --光谱学诊断或光活检，区分在正常组织和癌变组织 3.2药物荧光光谱的应用 --光敏剂，信号较强，特征明确，易于区分差异 3.3瞬态荧光光谱的应用 --荧光寿命的差异
荧光光谱
结构
1.荧光光度法 2.荧光物质 3理及特点： 1.1.荧光的定义---某些物质被一定波长的光照射时，会在短 时间内发射出波长比入射光长的光，这种光叫荧光。 1.2荧光的产生 三个过程 1.3荧光光谱的特点 1.光谱形状与激发光波长无关 2.光谱形状与吸收光谱形状相似但不一定重合
荧光光谱原理
荧光光谱原理荧光光谱是一种分析样品中荧光物质的方法，它是利用物质在受到激发后发出的荧光来进行分析的。
荧光光谱原理是基于物质分子在吸收能量后从基态跃迁到激发态，然后再从激发态跃迁回基态时发出荧光的原理。
在这个过程中，分子的激发态能级和基态能级之间的能量差决定了荧光发射的波长，因此荧光光谱可以用来研究分子的结构、环境和相互作用等信息。
荧光光谱的原理可以用来解释荧光物质的发光特性。
当荧光物质受到激发后，其分子内部的电子会跃迁到激发态，这个过程需要吸收一定的能量。
当分子从激发态跃迁回基态时，会释放出能量，这部分能量就以荧光的形式发射出来。
荧光发射的波长和强度可以提供关于样品的信息，比如样品的组成、纯度、浓度等。
荧光光谱的原理还可以用来解释荧光物质的激发和发射过程。
在激发过程中，荧光物质吸收能量，使得分子内部的电子跃迁到激发态。
这个过程是一个快速的过程，通常在纳秒到皮秒的时间尺度内完成。
而在发射过程中，分子从激发态跃迁回基态，释放出荧光。
荧光发射的波长和强度受到激发光的波长和强度的影响，因此可以用来研究激发光和荧光物质之间的相互作用。
除了用来研究荧光物质的发光特性和激发发射过程外，荧光光谱的原理还可以用来研究分子的结构和环境。
由于不同的分子在激发后会发出不同波长的荧光，因此可以通过测量荧光发射的波长来研究分子的结构。
此外，分子的环境也会影响其激发和发射过程，因此可以通过荧光光谱来研究分子的环境信息。
总之，荧光光谱原理是基于分子在受到激发后发出的荧光来进行分析的。
通过研究荧光发射的波长和强度，可以得到关于样品的信息，比如样品的组成、纯度、浓度、结构和环境等。
荧光光谱在化学、生物、环境等领域都有广泛的应用，是一种重要的分析方法。
荧光光谱
10
荧光熄灭
碰撞熄灭 能量转移 氧的熄灭 自熄灭和自吸收
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荧光分光光度计
基本结构 光源 单色器 吸收池 检测器
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二、荧光仪器（光源与检测器处于相互垂直的位置） 荧光仪器（光源与检测器处于相互垂直的位置）
光源
第一单色器 或滤光片
激发
记录仪 荧光 第二单色器 或滤光片
样品池 样品池
1）光源：氙灯、高压汞灯、激光； ）光源：氙灯、高压汞灯、激光； 2）样品池：石英（低荧光材料）； ）样品池：石英（低荧光材料） 3）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器； ）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器； 4）检测器：光电倍增管。 ）检测器：光电倍增管。
5
荧光分析的特点： 荧光分析的特点：
灵敏度高：视不同物质，检测下限在 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001µg/mL 之间。 之间。可 见比UV-Vis的灵敏度高得多！WHY？ 的灵敏度高得多！ 见比 的灵敏度高得多 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、 荧光量 子效率、荧光寿命等。 子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、 增强荧 光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、 光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、 干扰测量的因素较多。
1、定性分析 、 任何荧（ 光都具有两种特征光谱： 任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与 发射光谱。它们是荧（ 光定性分析的基础。 发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时， 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择 最适宜的激发波长。 最适宜的激发波长。 2、定量分析 、 If=Kc 该式只有在εlc＜＜ ＜＜0.05才成立，即荧光分析必须在极 才成立， 该式只有在 ＜＜ 才成立 稀的溶液中才可以用于定量测定，否则校正曲线弯曲。 稀的溶液中才可以用于定量测定，否则校正曲线弯曲。
荧光光谱
(4)系间跨跃 系间跨跃 系间跨越指的是不同多重度状态间 的一种无辐射跃迁过程．它涉及受激电 子自旋状态的改变．如S1到T 1，使原来 两个自旋配对的电子不再配对．这种跃 迁是禁阻的，但如果两个电子能态的振 动能层有较大的重叠时，如图中激发单 重态S1的最低振动能层与激发三重态T1 的较高振动能层重叠，则可能通过自旋 －轨道耦合等作用使S1态转入 T1态的某 一振动能层．
（2）非共振荧光
当荧光与激发光的波长不相同时，产生非共振荧光； 分为：直跃线荧光、阶跃线荧光、anti-Stokes荧光三种； 直跃线荧光（Stokes荧光） 直跃线荧光（Stokes荧光）：跃回到高于基态的亚稳态时 荧光 所发射的荧光；荧光波长大于激发线波长（荧光能量间隔小 于激发线能量间隔）； a b c d
激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移 Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比 激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 . 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生 不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃 迁回到基态，产生波长一定的荧光。 c. 镜像规则 . 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似； 基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
荧光光谱原理和应用
荧光光谱原理和应用荧光光谱是一种重要的光学分析技术，它基于物质在受到激发后，发出特定波长的荧光。
荧光光谱在生物学、化学、物理学以及环境科学等领域都有广泛的应用。
本文将介绍荧光光谱的原理、仪器以及一些常见的应用。
荧光光谱的原理是基于分子激发态的能量转移和电子跃迁。
当分子或原子被外界激发后，电子从基态跃迁到激发态。
在这个过程中，电子会吸收能量，然后再次释放出来。
如果能量以荧光的形式释放出来，那么就可以通过测量荧光的强度和波长来分析样品的性质。
荧光光谱的测量通常使用荧光光谱仪。
这种仪器由激发光源、样品腔、单色器、光电探测器等部分组成。
首先，激发光源会产生特定波长的光，并照射在样品上。
样品会吸收部分能量，然后在经过电子跃迁后发出荧光。
这些荧光会通过单色器进行分光，然后被光电探测器接收并转化为电信号。
最后，荧光光谱会通过数据处理和分析得到。
荧光光谱在许多领域都有重要的应用。
在生物学中，荧光染料被广泛应用于细胞和蛋白质的荧光探针。
通过测量荧光信号的强度和波长，可以研究细胞内分子的定位、相互作用以及代谢活动等。
在药物研发中，荧光标记可以用于筛选药物分子并研究其靶标和代谢途径。
在环境科学中，荧光光谱可以用于检测水质中有机物的污染程度。
此外，荧光光谱还可以用于食品和农产品的质量检测、酶活性测定以及材料科学等领域。
除了上述应用，荧光光谱还有许多其他的应用。
例如，在矿物学中，通过测量矿物的荧光光谱可以确定它们的成分以及高温和辐射暴露的历史。
在化学分析中，荧光标记被用于检测和测定微量金属离子。
此外，荧光光谱还可以通过测量物质的荧光光谱，来研究物质的结构、性质以及相互作用。
总之，荧光光谱是一种重要的光学分析技术，它基于分子在电子跃迁过程中发射荧光的原理。
荧光光谱仪是用于测量荧光的仪器，通过测量荧光信号的强度和波长，可以获得样品的信息。
荧光光谱在生物学、化学、物理学以及环境科学等领域都有广泛的应用，可以用于研究细胞、药物、水质等方面的问题。
荧光光谱技术介绍
荧光光谱技术概述 荧光光谱的分类与特点 荧光光谱实验技术 荧光光谱分析方法 荧光光谱技术的应用案例
contents
目 录
01
荧光光谱技术概述
定义
荧光光谱技术是一种通过测量物质吸收光后发射的荧光光谱来研究物质性质的技术。
原理
当物质吸收特定波长的光后，会通过电子跃迁至激发态，当电子返回到较低能态时，会释放出特定波长的荧光。荧光光谱的特性和强度与物质的结构和组成密切相关。
定义与原理
用于检测生物分子结构和功能，如蛋白质、DNA和细胞代谢物等。
生物医学研究
用于检测水体、土壤和空气中的污染物，如重金属、有机物和农药等。
环境监测
用于分析化学物质的结构和组成，如有机化合物、无机离子和金属配合物等。
化学分析
用于检测食品中的添加剂、农药残留和营养成分等。
食品工业
荧光光谱技术的应用领域
原子荧光光谱法的基本原理是原子吸收特定波长的辐射能后跃迁至激发态，随后返回基态时发射出特定波长的荧光。通过测量荧光强度，可以确定待测元素的浓度。
原子荧光光谱法在实践中需要解决一些问题，如光谱干扰、仪器噪声和基体效应等。为了提高测量的准确性和可靠性，需要采取相应的措施来减小这些因素的影响。
原子荧光光谱法通过测量待测元素原子在辐射能激发下产生的荧光强度，来定量分析待测元素在样品中的含量。其优点包括较高的灵敏度、较好的选择性以及较低的检测限。
19世纪末
荧光现象的发现。
20世纪初
荧光光谱仪器的初步研制。
20世纪中叶
荧光光谱技术开始应用于化学和生物学研究。
21世纪初
高灵敏度、高分辨率荧光光谱仪器的出现和应用领域的拓展。
荧光光谱分析
荧光光谱分析引言荧光光谱分析是一种利用物质在受到激发时发射的荧光来分析其性质的方法。
通过测量物质在不同激发波长下的荧光光谱，可以获得有关该物质分子结构、光物理性质以及环境因素对荧光行为的影响的信息。
本文将介绍荧光光谱分析的原理、仪器和应用。
原理荧光光谱分析基于物质分子在受到激发时发射荧光的原理。
当物质受到激发波长的光照射时，其分子内的电子被激发到高能级，随后返回基态时发射荧光。
不同分子结构、物理性质和环境因素会影响荧光的发射行为，因此通过测量荧光光谱可以得到有关物质性质的信息。
荧光光谱分析可以分为荧光发射光谱和荧光激发光谱。
荧光发射光谱是在固定的激发波长下测量物质发射的荧光光谱，用于研究物质的荧光特性。
荧光激发光谱是测量物质在不同的激发波长下发射的荧光光谱，用于研究物质的光物理性质和分子结构。
仪器荧光光谱分析通常使用荧光光谱仪进行测量。
荧光光谱仪包括激发光源、样品室、光学系统和检测器。
激发光源通常可以使用氘灯、氙灯或激光器，用于激发样品的荧光。
样品室是放置样品的空间，通常使用四面透明的石英室。
光学系统包括分光镜、滤光片和光电二极管等组件，用于收集和分析荧光信号。
检测器负责将荧光信号转换为电信号，并传输到计算机进行数据处理和分析。
应用荧光光谱分析在许多领域都有广泛的应用。
以下是一些典型的应用领域：生物领域荧光光谱分析在生物领域中被广泛应用于分析生物样品的成分和性质。
例如，荧光光谱可以用于分析蛋白质、核酸、细胞器和药物等的结构和相互作用。
荧光标记技术也是生物荧光光谱分析的重要应用之一。
环境监测荧光光谱分析可以用于环境监测和污染物分析。
通过测量水、空气等样品的荧光光谱，可以获得有关污染物浓度、分布和性质的信息。
荧光光谱分析在水质监测、大气污染物分析以及土壤污染检测等方面具有重要应用价值。
材料科学荧光光谱分析在材料科学中用于分析材料的结构和性质。
例如，荧光光谱可以用于研究材料的能带结构、杂质掺杂和缺陷等。
荧光光谱实验报告
荧光光谱实验报告荧光光谱实验报告引言荧光光谱是一种重要的分析方法，它通过测量物质在受激发后发射的荧光光的强度和波长，可以提供有关物质结构和性质的信息。
本实验旨在通过测量不同荧光染料的荧光光谱，探究其荧光特性，并进一步了解荧光光谱在分析中的应用。
实验方法1. 实验仪器和荧光染料的准备在本实验中，我们使用了荧光光谱仪、荧光染料溶液和溶剂。
首先，我们准备了不同浓度的荧光染料溶液，以便进行测量。
然后，我们将荧光染料溶液和溶剂混合均匀，以保证荧光染料的溶解度和稳定性。
2. 实验操作步骤（1）将荧光染料溶液倒入荧光光谱仪的样品室中。
（2）调整荧光光谱仪的参数，如激发波长、发射波长、积分时间等。
（3）开始测量，记录荧光光谱的强度和波长数据。
（4）重复上述步骤，测量不同浓度的荧光染料溶液的荧光光谱。
实验结果与讨论我们分别测量了三种不同荧光染料的荧光光谱，并得到了如下结果。
1. 荧光染料A的荧光光谱荧光染料A在激发波长为450nm时，发射波长为520nm，峰值强度为100。
随着荧光染料A浓度的增加，荧光光谱的峰值强度逐渐增加，但发射波长保持不变。
这表明荧光染料A的荧光特性与浓度有关，但并不受激发波长的影响。
2. 荧光染料B的荧光光谱荧光染料B在激发波长为500nm时，发射波长为580nm，峰值强度为150。
与荧光染料A不同的是，随着荧光染料B浓度的增加，荧光光谱的峰值强度不仅增加，发射波长也发生了红移。
这说明荧光染料B的荧光特性与浓度和激发波长都有关。
3. 荧光染料C的荧光光谱荧光染料C在激发波长为550nm时，发射波长为650nm，峰值强度为200。
与前两种荧光染料不同的是，荧光染料C的荧光光谱峰值强度随着浓度的增加呈现先增加后减小的趋势。
这可能与荧光染料C在高浓度下发生聚集体形成有关。
结论通过本实验，我们发现不同荧光染料的荧光特性受多种因素影响，包括浓度、激发波长和溶液环境等。
荧光光谱的测量可以提供物质结构和性质的信息，因此在分析中有着广泛的应用。
荧光光谱法特点
荧光光谱法特点
荧光光谱法是一种重要的分析技术，它基于样品分子在受激发后，从高能量态返回基态时所发射出的荧光辐射。
荧光光谱法的特点包括： 1. 高灵敏度：荧光信号的强度通常比吸收信号强得多，因此荧
光光谱法可以检测到低浓度的化合物。
2. 高选择性：荧光探针的选择性很高，可以用于检测特定的化
合物或生物分子。
3. 宽线性范围：荧光强度与化合物浓度呈线性关系，在一定范
围内可以测定不同浓度的样品。
4. 高分辨率：荧光光谱法可以检测不同的荧光发射波长，因此
可以分辨出不同的荧光成分。
5. 非破坏性：荧光光谱法不需要破坏样品，因此可以用于分析
生物分子。
荧光光谱法已广泛应用于生物、医药、环境、食品等领域，成为了一种非常重要的分析技术。
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出浓度；
比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
3.激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移 （什么是stokes位移？） 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激
发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l
AES－热致发光，激发态原子数遵守波尔兹曼分布、发射光
谱比较复杂。
荧光分析法
某些物质受紫外光或可见光激发后能发射出比激发光 波长波长的辐射，即荧光。光致发光 激发光－待测物质分子成为激发态时所吸收的光 发射光－处于激发态的分子回到基态时所产生的光。 荧光法测定的是受光激发后所发射的荧光的强弱，而不是测定激 发光的强弱。凡能产生荧光的化合的，均可采用荧光分析法进行 定性或定量。
荧光&磷光法
Fluorescence & phosphorescence
荧光与发射光谱的关系
荧光光谱法（FS）－原子吸收光能激发在返回基态时，所发 射的荧光强度进行定量和定性的发射光谱法。
FS & AES
共性：均为发射光谱
FS-光致发光，吸收具有选择性、激发态原子数不遵守波尔
兹曼分布、发射光谱比较简单。
I0 F KQ ln KQI 0 bc kc I0 I A
F, fluorescence intensity; K, constant, I0, excitation intensity; , molar absorbance constant; b, optical path; c, concentration.
发态的二振动能级
之间的跃迁几率最 大，相反迁也然
蒽的激发光谱和荧光光谱
蒽的激发光谱和荧光光谱
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
500 nm
三、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光分析必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）：
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常 数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用， 故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强 的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环上 有供电基，使荧光增强。
吸收滤光片- 可见光谱区使用 干涉滤光片- 全光谱区使用
截止滤光片(cutoff filter) 带通滤光片(bandpass filter) 全息滤光片（notch filter）
分光系统
分光系统
其他部件
样品池 单色器
检测器
其他类型荧光检测器
激光诱导荧光检测 发光二极管诱导荧光检测
动
四、影响荧光强度的外部因素
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加
温度升高，非辐射的几 率增强，荧光几率减少
四、影响荧光强度的外部因素
3.溶液pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制
大多数荧光反应都受溶液酸碱度的影响，故荧光分析需在适合的
酸碱度溶液中进行。最适当的酸碱度必须由实验来确定。所用酸的
S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； l
‘ > 2
l 2> l 1；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（ T1 → S0跃迁）；
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
四、影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将
使化合物的荧光发生变化；
① 溶剂不纯 ② 溶剂的选择（极性）－测定荧光光谱时一定要注明所用溶剂。 许多共轭芳族化合物，激发时发生了π→π*跃迁，其荧光光谱受溶 剂极性的影响较大。荧光光谱随溶剂的极性增大而向长波方向移
内转换 S2 S1 能 量 吸 收
内转换 振动弛豫 系间跨越
T1 发 射 荧 光
T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
荧光&磷光法的基本原理
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
1GB=1024MB 1TB=1024GB
1961年，中国大陆第一台激光器在中科院长春光机所研制成功； 1964年 首次出现“激光”这一词语
中国研制成功的新一代激光武器是国际上最先进的激光武器之一，可有效对付超
高速战略侦察机；能使F－117隐形飞机的激光制导、红外导弹完全失灵。
种类也影响荧光的强度，例如，奎宁在硫酸溶液中的荧光较在盐酸 中的要强些。
四、影响荧光强度的外部因素
4.溶液pH的影响
悬浮物－光散射
溶解氧－荧光淬灭
pH值
5.玻璃器皿的影响
高度洁净
荧光淬灭
浓度过大导致“自熄灭”（即荧光淬灭）效应 即样品浓度超过一值后，荧光强度不再增加反而减小
Positive-Signal Indirect Fluorometric Detection in Ion Chromatography. Anal. Chem. 1987, 59, 1362-1364.
2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能
级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l ‘2 )。 c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）
成镜像对称关系。
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布与第 一激发态上的各振动能级分布类似
基态上的零 振动能级与第一激
时间分辨荧光检测
其他类型荧光检测器
激光诱导荧光检测 发光二极管诱导荧光检测
时间分辨荧光检测
光化学衍生荧光检测
激光诱导荧光检测
Laser-induced fluorescence detection 激光
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation，LASER）
Moderate sensitivity; offers structural information High sensitivity
Relative low sensitivity
Restriction in buffer choice
CL
--
10-8 10-12
Not universal
激光的特点
溶剂 溶液 玻璃容器 温度
荧光衍生
荧光法的缺陷： 可产生荧光的物质非常有限，就是只有少数化合 物能发射荧光。
解决的途径：
化学衍生－通过加入某试剂与待测药物发生化学反应或物
理缔合，生产物能够产生荧光。 A+B C hv A+B A-B hv
光子衍生
Basic principle of fluorescence
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至 低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激
发单重态的最低振动能级。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移 能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多为
磷光检测
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （ 1 ）通常借助于荧光和磷光
寿命的差别，采用磷光镜的装
置将荧光隔开。 （ 2 ）采用脉冲光源和可控检 测及时间分辨技术。
激发光源
UV-VIS
氙灯、高压汞灯（365 nm）
分光系统
滤光片（filter）
浓度很低时，将括号项近似处理后：
If = 2.3 I0 l c = Kc
设IF为荧光强度； I0入射紫外线强度； It为透过溶液后紫外线强度； Ia为溶液吸收紫外线； C为溶液中被测物质的浓度； l为溶液层的厚度。
荧光的定量方法
标准曲线法：
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，
Q，荧光物质的量子效率；I0，激发光强度；IA，样品吸收的光能；，荧光物质 的摩尔吸收系数；b，光程，c，浓度，K常数
荧光分析法的特点