仪器分析高效液相色谱法 (2)

高效液相色谱仪1
高效液相色谱仪2
高效液相色谱仪3
高效液相色谱仪4
一、高效液相色谱法的特点
二、流程及主要部件
1.流程
2. 主要部件： （1）高压输液泵： 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调 、 耐腐蚀等特性。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极 细，因此对流动相阻力很大，为使流动相 较快流动，必须配备有高压输液系统。它 是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由 储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动 阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部 件。
高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分 析气体和沸点较低的化合物，它们仅占 有机物总数的20％。对于占有机物总数 近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩 尔质量大的物质，目前主要采用高效液 相色谱法进行分离和分析。
（2）液相色谱能完成难度较高的分离 工作，因为：
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的， 不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和 作用，样品分子只与固定相相互作用。而 在液相色谱中，流动相液体也与固定相争 夺样品分子，为提高选择性增加了一个因 素。也可选用不同比例的两种或两种以上 的液体作流动相，增大分离的选择性。
例如分离苯的羟基化合物，7个组分 只需1min就可完成。
对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长 约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为 30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20 种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需 lh之内即可完成。
又如用25cm× 0.46 cm 的Lichrosorb －ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在 不到0.5h内分离出尿中104个组分。
对于一个好的高压输液泵应符合密 封性好，输出流量恒定，压力平稳，可 调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀 等要求。
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。
恒流泵特点是在一定操作条件下，输 出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化 无关；
恒压泵是指能保持输出压力恒定，但 其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留 时间的重视性差，它们各有优缺点。
②液相色谱固定相类型多，如离子交换色 谱和排阻色谱等。 作为分析时选择余地 大；而气相色谱不太可能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的 温度，一般有利于色谱分离条件的选择。
（3）由于液体的扩散性比气体的小 105倍，因此wk.baidu.com溶质在液相中的传质速率 慢，柱外效应就显得特别重要；而在气 相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。
目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流
泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械
往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（2）进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多
（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外 效应）较突出。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起 的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道 及检测器中存在死体积。
仪器分析高效液相色谱法
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60 年代末70年代初发展起来的一种新型分离 分析技术，随着不断改进与发展，目前已 成为应用极为广泛的化学分离分析的重要 手段。
一、液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统也 由两相——固定相和流动相组成。液相 色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合 固定相（或在惰性载体表面涂上一层液 膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流 动相是各种溶剂。
高效液相色谱法的仪器设备费 用昂贵，操作严格，这是它的主要 缺点。
高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构示意如 下图。一般可分为4个主要部分：高 压输液系统，进样系统，分离系统 和检测系统。此外还配有辅助装置： 如梯度淋洗，自动进样及数据处理 等。
其工作过程如下：首先高压泵 将贮液器中流动相溶剂经过进样器 送入色谱柱，然后从控制器的出口 流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同 时带入色谱柱进行分离，然后依先 后顺序进入检测器，记录仪将检测 器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样 系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高 效液相色谱法中对进样技术要求较严。
进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐 高压的六通阀进样装置，
其结构如图所示：
（3）分离系统—色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包 括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、 不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其 他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得 较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～ 5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内 径较大，可达25mm 以上。
被分离混合物由流动相液体推动进 入色谱柱。根据各组分在固定相及流动 相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。
色谱分离的实质是样品分子（以下称 溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以 及固定相分子间的作用，作用力的大小， 决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分 为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化 合键合色谱、离子交换色谱以及分子排 阻色谱等类型。
它是在经典液相色谱基础上，引入了气 相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、 高效固定相和高灵敏度检测器，因而具 备速度快、效率高、灵敏度高、操作自 动化的特点。为了更好地了解高效液相 色谱法优越性，现从两方面进行比较：
高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱 法的最大优点在于高速、高效、高灵敏 度、高自动化。高速是指在分析速度上 比经典液相色谱法快数百倍。由于经典 色谱是重力加料，流出速度极慢；而高 效液相色谱配备了高压输液设备，流速 最高可达 103cm·min-1。
（4）液相色谱中制备样品简单，回收 样品也比较容易，而且回收是定量的，
适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通
用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。
在实际应用中，这两种色谱技术是互相
补充的。
目前高效液相色谱法已被广泛 应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大分子物质，例如蛋白质、 核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、 高聚物、染料及药物等物质的分离 和分析。