藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究
钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特研究
钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特*研究
为发展新型海洋*物,采用SephacrylS-200凝胶层析和羟基*灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行了分离和纯化,得到了藻蓝蛋白纯品.测定了藻蓝蛋白的氨基*组成和含量.藻蓝蛋白的紫外、可见吸收光谱表明其最大特征吸收波长为278,360,620nm.得到的藻蓝蛋白经等电聚焦显示为一条带,其等电点为pH＝4.3.还测量了藻蓝蛋白红外吸收光谱.研究所获得的藻蓝蛋白为后续开展临床应用提供了可靠的样品.
投诉
盐析法分离藻蓝蛋白的研究
35% 40%
45%
2.4
纯度(A620/A280)
2.3
2.2
2.1
2.0 5
10
15
硫酸铵饱和度/%
图 5 四步盐析 PC 纯度
70
45%
65
50% 55%
60%
60
回收率/%
55
50
45
40 5
10
15
硫酸铵饱和度/%
图 6 四步盐析 PC 回收率
3.8
33%
3.6
35% 27%
3.4
纯度(A620/A280)
3.2 盐析 在 藻 蓝 蛋 白 盐 析 过 程 中 ， 文 献 大 多 采 用 25%
硫酸铵去杂，50%硫酸铵沉淀PC。这种分离只是 用于其他纯化方法前的预处理，不能分离出高纯 度的PC。本实验采用多次分段盐析，虽回收率仅 有9.66%，但PC纯度高达3.92，考虑到盐析操作简 单，硫酸铵价格便宜，本实验还是具有很大的应
收稿日期： 2009-08-04 基金项目： 唐山市自然科学基金(04204501C-18)。 作者简介： 王巍杰(1967—)，女，硕士，副教授，主要从事药物和功能性食品的研究工作。
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2010 年 第 35 卷 第 5 期
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
提取物与应用
式中：A280，A620 分别代表波长在280 nm，620 nm处的吸光度。 o和t分别代表冷冻-融化后藻蓝蛋白粗 体液和经过盐析沉淀得到的藻蓝蛋白上 清液。
硫酸铵达到所需饱和度需加入的固体硫酸铵 为：X=G(S2-S1)/(1-AS2)
式中：X 表示将1 L 硫 酸 铵 饱 和 度 为 S1的 溶 液 提 高 到 S2时 所 需 加 入 的 固 体 硫 酸 铵 g 数； S1 表示原溶液中硫酸铵的饱和度； S2 表示加入固体硫酸铵后所需达到的 饱和度； G和A为常数，与温度有关，数值参照 严寒等[10]研究的“硫酸铵盐析公式参数 的校正”。
藻蓝蛋白的提取
藻蓝蛋白的提取方法1.PBS 缓冲液直接提取法(1)配制pH=6.0 的PBS 缓冲溶液。
(2)称取20 g 螺旋藻粉, 加入步骤( 1) 配制的缓冲溶液200 mL, 然后将其放在磁力搅拌器上搅拌 4 h, 将搅拌后的溶液置于离心机中10 000 g 离心10 min, 收集蓝色上清液。
(3) 将离心得到的上清液加洗涤剂洗涤, 再将洗涤后溶液进行过滤。
(4)将滤液用旋转真空蒸发仪蒸干, 可得蓝色固体,将固体置于干燥器中 1 h, 待完全干燥后取出, 将其研磨成蓝色粉末样品。
2藻蓝蛋白的富集分离2 .1螺旋藻细胞的破碎准确称取0 .5 g 螺旋藻粉, 加入100 mL 的pH =7 .0 、0 .01 mol/L 的H3PO4 缓冲液, 采用反复冻融(3 次)的方法对藻体细胞进行破碎, 在显微镜下观察计数细胞破碎率在90%以上即可.将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于4 000 r/min 离心20min , 倾倒上清液可得到含藻蛋白的粗提液.在568 、620 和650 nm处测粗提液的吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2.2 盐析法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(N H4)2SO4 溶液, 边加边搅拌, 以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 最终(NH4)2 SO4 溶液的质量浓度分别为20 %、40 %、50 %和60 %, 然后分别在20 ℃和40 ℃下对(NH4)2 SO4 盐析法沉淀藻蓝蛋白进行实验研究.在设置的温度和盐浓度下静置过夜, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min , 将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)溶解, 并倾倒于透析袋中, 再置于去离子水中透析24h(每隔4 h 更换一次去离子水);透析结束后, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .3 等电点法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0 .1 mo l/L 稀H2 SO4 溶液, 边加边搅拌,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 将藻蛋白粗提液pH调节为3 .0 、4 .0 和5 .0 , 即藻蓝蛋白的等电点附近,静置过夜, 于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min ;将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)充分溶解, 再于-4 ℃高速离心机中以10 000 r/min 离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .4 藻蓝蛋白的收率和分离因数分别计算藻蓝蛋白的收率(Y )、浓缩率(m)和分离因数(β):式(3)-(5)中, N(g/L)为藻液比, 0 和t 分别代表冷冻-融化后藻蛋白粗提液和经过盐析法沉淀或等电点法沉淀最终得到的藻蓝蛋白上清液.双水相萃取（1）藻蓝蛋白的初步提取。
藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究
藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究背景介绍藻类保健品作为一种为人们所关注的健康食品种类，近年来在市场上的需求量逐渐增加。
在藻类保健品中，藻蓝蛋白作为一种高效的保健成分，被广泛应用于运动营养补充品、心血管保健品、抗肿瘤等领域。
因此，提高藻类保健品中藻蓝蛋白的提取率，成为保健品生产企业的重要目标之一。
藻蓝蛋白藻蓝蛋白是全球广泛分布且相似的蓝色光合色素，主要存在于紫色藻、蓝藻等水生植物中。
藻蓝蛋白基于染色体的基因编码，其分子量为35-40kDa，是一种富含珍贵氨基酸的假单胺酸蛋白质。
藻蓝蛋白的生理活性主要表现在抗氧化、抗炎、抗原性、降低血糖、调节血脂、保护肝脏等多个方面。
盐析提取技术盐析法是常用的蛋白质分离和纯化方法，适用于对蛋白质进行快速的富集和分离。
在盐析方法中，利用蛋白质在不同盐类浓度下的稳定性差异而实现了富集和分离。
由于藻蓝蛋白对不同浓度的钾离子具有不同的亲和力，于是有学者用盐析法来提取纯化藻蓝蛋白，其提取效率和活性也得到了较好的保持。
盐析提取技术研究一项将盐析法应用于藻蓝蛋白的提取纯化研究表明，在盐析法中，影响藻蓝蛋白提取率的因素很多，包括盐类类型、盐类浓度、pH值、温度等。
其中，钾盐和钠盐是常用的盐类类型，其在不同条件下的选择和比例会影响藻蓝蛋白的提取率和纯度。
盐析提取出的藻蓝蛋白可以进一步经过SDS-PAGE电泳与ELISA检测方法来证明其提取效率和纯度。
在大量试验基础上，研究人员建立了一种高效的藻蓝蛋白盐析提取技术，其提取效率可以达到90%以上，纯度也可以保持在85%左右。
以藻蓝蛋白盐析提取技术为基础，进一步开展其生物活性、理化性质、抗氧化性质等方面的研究，有望为藻类保健品的开发和生产提供有力的技术支持。
藻蓝蛋白作为藻类保健品中一种极具活性的成分，其提取技术的研究和开发对于保健品生产企业的发展至关重要。
基于盐析方法的藻蓝蛋白提取技术不仅操作简单，而且能够提取高纯度、高效率的藻蓝蛋白。
粉末活性炭联合盐析法纯化藻蓝蛋白的研究
粉末活性炭联合盐析法纯化藻蓝蛋白的研究盛晶梦;张发宇;袁梦媛;汪家权【摘要】文章以巢湖新鲜蓝藻藻泥为处理材料,采取粉末活性炭联合盐析的方法提取纯化藻蓝蛋白.综合考虑粉末活性炭种类、粒径、添加量、处理时间、pH值及硫酸铵浓度等影响因素,通过一系列单因素试验研究了不同活性炭处理条件以及两步盐析中硫酸铵的浓度对藻蓝蛋白提纯的影响,对藻蓝蛋白的提纯条件进行了优化.结果表明:在粉末活性炭种类为煤质,粒径为400~500目,添加量为100 g/L,静置时间为10 min,pH值为70,两步盐析(NH4)2SO4的浓度分别为1 mol/L和2 mol/L 时,粉末活性炭联合盐析法提纯藻蓝蛋白的效果最好,藻蓝蛋白的纯度可达316,回收率为45%.%The extraction and purification of C-phycocyanin from fresh blue algae in Chaohu Lake were performed by the combined use of powdered activated carbon(PAC) treatment and saltprecipitation.Considering the PAC variety, particle size, dosage, treatment time, pH value and amount of substance concentration of (NH4)2SO4, the effects of different PAC treatment conditions and amount of substance concentration of (NH4)2SO4 in two-step salt precipitation on the extraction and purification of C-phycocyanin were studied by series of single factor experiments,and the extraction and purification conditions were optimized.The results showed that the effect of combined use of PAC and salt precipitation was best when the coal PAC particle size was 400-500 mesh, dosage was 100 g/L, treatment time was 10 min, pH value was 70 and the amount of substance concentration of (NH4)2SO4 in two-stepsalt precipitation were 1 mol/L and 2 mol/L, and the purity and recovery rate of C-phycocyanin were 316 and 45%.【期刊名称】《合肥工业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(040)002【总页数】6页(P242-247)【关键词】粉末活性炭;两步盐析;提取纯化;藻蓝蛋白【作者】盛晶梦;张发宇;袁梦媛;汪家权【作者单位】合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学资源与环境工程学院,安徽合肥 230009【正文语种】中文【中图分类】TQ464.7我国是世界上多湖泊国家,湖泊富营养化已经成为我国最重要的水环境问题之一。
螺旋藻藻蓝蛋白的分离
螺旋藻藻蓝蛋白的分离摘要: 藻蓝蛋白(Phycocyanin)是一个具有生物活性功能的天然蓝色素蛋白,已被用作优质蛋白源,添加于食品和鱼饵料中, 具有抗氧化、增强人体免疫力等功能, 又可制成荧光探针, 用于免疫学、细胞生物学等领域。
本文主要介绍运用硫酸铵盐析与层析柱结合法从螺旋藻中分离提取藻蓝蛋白。
藻蓝蛋白是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素,一种特殊的色素蛋白, 由开链四吡咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合。
藻蓝蛋白在螺旋藻中的含量高达10%～20% , 是螺旋藻细胞中重要的光合作用的天然色素,在光合作用中能以近乎100% 的高效率把光能优先地传递给光系统。
藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业。
同时藻蓝蛋白具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等, 用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。
同时藻蓝蛋白还是一种无毒副作用的理想光敏剂。
由于藻蓝蛋白具有良好的开发前景, 在螺旋藻的含量较高, 螺旋藻中藻蓝蛋白的研究成了藻类蛋白研究的热点。
1工艺流程弃去下层墨绿色沉淀↗螺旋藻（加入提取液）→冻融→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入↗弃去蓝色沉淀(NH4)2SO4固体粉末（在溶液浓度达到20%）→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入(NH4)2SO4固体粉末（在浓度达到50％）→离心（10000r/min,15min）→取得深蓝色沉淀→加入蒸馏水→装入层析袋→蒸馏水中层析（4℃）→过柱纯化→结果检测↘弃去黄绿色上清液2分离纯化具体方法2.1取螺旋藻粉颗粒倒入塑料瓶中，加提取液。
2.2.将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次（实验中此步骤我们只做了一次，其余由老师帮做）,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。
实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液2.3.冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min，得到亮蓝色上清液，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。
其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。
肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。
天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。
与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。
分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。
因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。
藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。
一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。
整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。
有利于培养学生的学习兴趣。
二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。
1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。
鱼腥藻藻蓝蛋白提取优化和抑菌研究【文献综述】
鱼腥藻藻蓝蛋白提取优化和抑菌研究
[摘要] 本实验主要以鱼腥藻为实验材料，对鱼腥藻藻蓝蛋白的提取优化，分离纯 化和生理功能进行了概况研究. [关键词] 鱼腥藻；藻蓝蛋白；提取优化；分离纯化；生理功能
藻蓝蛋白是一种深蓝色粉末，色泽美观。它既是一种蛋白质，又是一种极好的天 然食用色素，同时又是良好的保健食品。据科学研究表明，藻蓝蛋白具有刺激红细胞 集落生成，类似红细胞生成素的作用；藻蓝蛋白具有补血、调整白血球和提高淋巴细 胞活性的作用；增加体能、促进红血球增长，能增进机体免疫功能，促进生长发育； 藻蓝蛋白还具有抑制某些癌细胞的作用；具有很高的营养价值和医疗价值。藻蓝蛋白 作为天然食用色素，它可以改善食品的色泽，不仅能提高食品的档次，而且能增加食 品中的功能成份。藻蓝蛋白是少见的色素蛋白之一。它不仅颜色鲜艳，而且本身是一 种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。藻蓝蛋白是水溶性色 素，清亮鲜艳，外观悦目可爱，可作为食品、化妆品的添加剂。
目前藻蓝蛋白的产品绝大部分来自螺旋藻，但由于螺旋藻需在碱性环境(pH11)下 生产，在培养过程中需添加大量 NaHCO3，不仅增加成本，同时产品中残留的 NaHCO3 不易去除干净。不适合作食品添加剂及药物等使用。同时，生产中螺旋藻藻 体要清洗三遍才能用于提取，因此培养基和清洗液的排放也会对环境造成污染。鱼腥 藻(Anabeana)属淡水藻，培养过程中操作简单易控制，生长速度快、产量高、成本 低、适应性强，一年四季均可生产，其中藻蓝蛋白含量高于螺旋藻，同时鱼腥藻还具 有固氮能力，产生的有机氮作为饲料蛋白。因此，利用鱼腥藻提取藻蓝蛋白，不仅可 以避免采用螺旋藻提取藻蓝蛋白的高成本，高污染的弊端，也可大大降低成本，是一 种价廉易得的藻蓝蛋白资源。
1 藻蓝蛋白的提取方法
藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究
藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究
概述
藻类保健品中常含有藻蓝蛋白，该蛋白质对人体健康具有重要作用，如提高免
疫力、抗氧化等。
因此，研究藻蓝蛋白盐析提取技术对于藻类保健品的生产具有重要的意义。
盐析提取技术
盐析提取技术是指通过控制溶液中盐的浓度和类型，使蛋白质由水相沉淀而得
到的提取方式。
盐析提取技术的优点在于：有效、简单、成本低。
盐浓度的选择
盐浓度的选择对藻蓝蛋白的盐析提取非常重要。
通常，盐浓度过低会导致蛋白
质在上清液中分散，无法得到充分的分离。
而盐浓度过高则会使蛋白质在浓度过大对蛋白质的空间结构造成破坏。
因此，需要在实验中通过调整盐浓度来找到一个最合适的值。
在实验中，可以
选择硫酸铵或氯化钠等盐类进行调整。
pH值的影响
除了盐浓度，对于盐析提取技术而言，pH值对于蛋白质的分离同样具有重要
的作用。
不同的蛋白质在不同的pH值下具有不同的电荷，因此在不同的pH值下
对蛋白质的分离效果也不同。
通过对不同pH值下的蛋白质分离情况的观察，可以找到最适合藻蓝蛋白盐析
提取的pH值，并最终得到高纯度的藻蓝蛋白。
结论
藻蓝蛋白在藻类保健品中有广泛的应用，通过盐析提取技术可以得到纯度高、
效能好的藻蓝蛋白。
在实验中，盐浓度以及pH值的调整对于蛋白质分离至关重要。
不同的藻蓝蛋白需要进行不同条件下的提取，在实践中需要根据实际情况进行调整。
论螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法研究
论螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法研究作者：陈军峰来源：《科学与财富》2018年第14期摘要：螺旋藻藻蓝蛋白是一种具有抗氧化、增强机体免疫力、抗癌、保肝等功能的物质，且可用于食品、医疗等领域，具有较高的利用价值，对改善公众健康具有积极的作用。
而螺旋藻藻蓝蛋白在具体的生产中，提取纯化方法是影响螺旋藻藻蓝蛋白产量的重要因素。
故此，文章展开对螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化方法的分析，结合相关研究内容分别对提取方法和纯化技术进行阐述，旨在为螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化提供参考，推动螺旋藻藻蓝蛋白产量提升。
关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；提取方法；纯化技术螺旋藻为丝状多细胞螺旋形原核藻类生物，具有较高的蛋白含量，且螺旋藻本身具有较好的繁殖能力，可为螺旋藻大范围繁育提供基础。
而螺旋藻藻蓝蛋白则是一种安全，且无毒副作用的蛋白资源，可应用到诸多领域中。
当前，国内外研究者对螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化较多，并取得了一定的成就。
基于此，螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法展开研究与分析，分析具体几种纯化技术，详细内容如下。
1螺旋藻藻蓝蛋白的相关研究1.1螺旋藻藻蓝蛋白结构藻蓝蛋白包含一个蛋白与一个发色团，其中蛋白是由分子量18Mu与20Mu的α和β亚基构成，且二者之间相互作用，使得单体形成，且单体间由多台连接，形成多聚体。
藻蓝蛋白的亚基体内以多聚体形式存在，包含三聚体、六聚体等。
且藻蓝蛋白的聚集态受到PH值、蛋白质浓度等因素影响。
1.2藻蓝蛋白的生理活性藻蓝蛋白是一种安全、无毒的蛋白资源，其具有显著的生理活性特征，先对藻蓝蛋白的生理活性展开分析，详细内容如下。
（1）抗氧化性。
相关研究表明，藻蓝蛋白可清除过氧化亚硝酸阴离子，如ONOO-，且研究中还发现，随着藻蓝蛋白的含量增加，其抗氧化活性也得到明显增加。
说明藻蓝蛋白的具有可清除有毒自由基的功能，且其本身无毒无害，可作为治疗药剂使用。
（2）抗炎性。
研究人员对藻蓝蛋白的抗炎性进行分析，发现藻蓝蛋白对活性氧具有清除行为。
太湖蓝藻藻蓝蛋白的提取及纯化
太 湖 蓝 藻 藻 蓝 蛋 白 的 提 取 及 纯 化
韩士群 李辉 东 ， 严 少华 夏 明珠 ， ，
（ ．江苏省农业科学 院农 业资源与环境研究所 ， １ 江苏 南京 ２０ １ １０４；２ 南京理工 大学 工业 化学研究 所 ， ． 江苏 南京 ２ ０ １ ） １０ ４
摘要 ： 为利 用太湖打捞蓝藻 的蛋 白质 资源 ， 用冻融 破壁 、 采 絮凝 、 析 、 析 、 水相萃取 等方 法制备荧光 试 盐 透 双
ＨＡＮ ｉｑ ， ＬＩＨｕ — ｏ ｇ ’ Ｓｈ ． ｕｎ ｉｄ ｎ ， ＹＡＮ ｈ ｏ ｈ ， ＸＩ Ｍｉ ｇ ｚ Ｓ ａ — ｕａ Ａ ｎ —ｈｕ
（ ．ｎｔｕ ｇｉ ｌ ｒｌ ｅ ｕｃ ｎ ｎｉ ｎ ｅｔｌ ｃ ｎｅ， ｉｎ ｓ Ａ ａ ｅ ｙｏＡ ｒ ｕｔｒｌ ｃ ｎｅ， ａｊ ｇ２ ０ １ ， ｈｎ １ Ｉｓｔｔ ｏ ｒ ｕｔ ａ Ｒ ｓ ｒ ａ ｄＥ ｖ ｏｍ ｎａ ｉ ｃｓ Ｊａ ｇｕ ｃｄｍ ｆ ｇｉ ｌ ａ ｉ ｃｓ Ｎ ｎｉ １０ ４ Ｃ ｉ ｉ ｅ ｆＡ ｃ ｕ ｏ ｅ ｒ Ｓｅ ｃ ｕ Ｓｅ ｎ ａ；２ Ｉｓ ｔｔｏ Ｉｄｓ ．ｎｔｕｅ ｎ ｕ－ ｉ ｆ ｔａ ｈｍｉｒ，Ｎ ｎｎ ｎｖｒｔ Ｓｉ ｃ Ｔｃｎｌｇ ， ａ ｎ １０４，Ｃ ｉ ｒ ｌ ｅ ｓｙ ａｊ ｇ Ｕ ｉ ｓｙｏ ｃ ｎｅ＆ ｅｈ ｏ ｙ Ｎ ｇ２ ０ １ ｉ Ｃ ｔ ｉ ｅｉ ｆ ｅ ｏ ｈｎ ａ）
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螺旋藻中藻蓝蛋白的生理功能及其提取纯化研究进展
Ｃ－ 藻蓝蛋白包 含 了 一 个 蛋 白 和 一 个 发 色 团 ， 当 藻胆蛋白从机体中分离纯化出来后， 由于已经没有 邻近的受体来转化收集过来的能量， 这种水溶性的 亮颜色的胆蛋白就变得高度的荧光性［３］。藻胆 蛋白的 光谱学和结构特性使得它具有独特的定性和定量特 征， 如在可见光谱的广泛吸收， 大的消光系数， 高度 的荧光量子效能， 大斯托克斯位移， 藻胆蛋白中多 重色团之间非常小的荧光猝灭。这些特性使得藻胆 蛋白在作为荧光标记时大有前途。自从在 ２０ 世纪 ８０ 年代将蛋白应用到免疫测定、单细胞分析和流式细 胞仪的分离， 将蛋白作为荧光探针在生物的各领域 都显示了很大的前景， 如将多色流式细胞技术用于 细胞分析和分类等。同时， 一些新的藻胆蛋白探针 或共轭物的发展提高了在稀释状态下藻胆蛋白的稳 定性 ， 如 Ｌｉ Ｓｕｎ 等［３］曾 用 甲 醛 使 亚 基 之 间 化 学 交 联 ， 提高了其在变性条件下的稳定性。
［１］ 孙庆杰．天 然 神 经 酰 胺 的 研 究 与 开 发［Ｊ］．中 国 油 脂，２００３， ２８（２）：６０－ ６１
［２］ 蒲云峰，钟耕，张伟敏．神 经 酰 胺 的 功 能 和 应 用［Ｊ］．粮 食 与 油脂，２００５，（７）：１４－ １６
［３］ 周 全，陈 国 强．解 脂 假 丝 酵 母 中 神 经 酰 胺 的 鉴 别 和 定 量 分析［Ｊ］．微生物学报，２００４，４４（５）：６９２－ ６９４
提取物与应用
螺旋藻中藻蓝蛋白的 生理功能及其提取纯化研究进展
卓素珍， 张 虹 （浙江工商大学食品生物与环境工程学院， 杭州 ３１００３５）
摘要： 藻蓝蛋白是螺旋藻的主要组成成分， 它的生理功能已经得到多方面的证实。对藻蓝蛋白的结
构、抗氧化、抗炎等生理活性及其提取纯化工艺作了较为系统的综述， 以期为藻蓝蛋白的进一步研
藻蓝蛋白的提取与纯化
藻蓝蛋白的提取与纯化螺旋藻粉提取藻蓝蛋白摘要：藻蓝蛋白是一种可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记的多用途蛋白。
本实验旨在找出最适螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白的工业提取工艺。
对藻蓝蛋白的提取，本课题组采用了反复冻融法、水提法、缓冲液法，以找出提取效率高，成本低的方法。
实验结果显示，反复冻融三次的藻蓝蛋白浓度A620/A280分别为：0.819/1.871、0.597/1.676、0.245/0.629;水提法三次的A620/280分别为：0.842/1.768、0.650/1.136、0.177/0.737;缓冲液提取三次的A620/A280分别为：1.040/2.102、0.260/0.630、0.052/0.247。
在蛋白质的分离时，采用两步盐析法，盐析前A620=1.143，A280=1.983；两步盐析后，A620=2.203，A280=1.492。
最后在纯化方法上选择了羟基磷灰石柱分离，得到蛋白样品A620=1.379，A280=0.528。
关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；二次盐析；柱分离介绍：藻蓝蛋白既是一种蛋白质，又是一种很好的天然食用色素，同时又是极好的保健食品。
藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。
21世纪初，在欧美、日本等国，藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素，并被制成生化药品。
因为藻蓝蛋白为胞内蛋白，所以细胞破碎技术是直接影响蛋白提取得率的关键因素之一。
藻蓝蛋白的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等【1】。
本实验通过反复冻融、水提法和缓冲液法对螺旋藻细胞进行破碎提取藻蓝蛋白，对各条件下得到的蛋白溶出率进行了比较分析，确定了各条件下蛋白提取的最佳条件。
在藻蓝蛋白的分离时，主要是把蛋白质与提取液中其他物质分离。
红毛藻藻蓝蛋白的提取方法研究
!"#$%"$ &%’ ($")%*+*,- *. /**’ 0%’1234的影响大， 多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。 冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程 中， 细胞内外的液态水形成冰晶体， 造成体积膨大， 对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通 透 性 加大， 内容物流出。藻体冻结过程中首先是从最容易 生成细小冰晶体的地方开始， 然后冰晶体逐渐变大， 向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和 细 胞 膜胀破、 压破。每次冻融最容易生成细小冰晶体的地 方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位 是 不 同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细 胞 膜 产生破坏， 因而多次冻融能使破碎效果提高。冻融时 先 用 /"//#+234 5 6 缓 冲 液 间增加虽能使冰晶变大，但由于受细胞内外水 分 含 量的限制， 冰晶的长大是有限度的， 因而对细胞壁和 细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区 域 较 少， 效果较差， 所以冻融时间对冻融效果影响不大。 准确称取一定量的红毛
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钙、 硝酸钠、 氢氧化钠、 盐酸等试剂 十二烷基苯磺酸钠） BXB （
为化学纯，市售；国产
XQCQS]J 离子交换树脂， B#-"4/#‘ PS9KK 葡聚糖凝胶。
组织捣碎机， 超声波细 XFU<K 蛋 白 核 酸 分 析 仪 ， 胞破碎机， 5PTS9U 高速台式离心机， X\SBJU 型电热 恒温水浴锅， EIBJ2 型酸度计， HC9KK< 型电子 天 平 ， 松下电冰箱等。
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藻蓝蛋白 实验报告
藻蓝蛋白的分离与纯化姓名：郭均学院：食品与生物工程班级：食安 09-2学号：200906041069藻蓝蛋白的分离与纯化一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白的一般提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的分析技术。
二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普遍存在于藻蓝蛋白中的光合辅助色素，也是一种天天然色素蛋白，具有水溶性，可用作视频着色剂。
此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。
藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。
另外它还有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。
利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸收水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可以中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于各种蛋白颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。
研究表明可用25%硫酸铵饱和度沉淀除去杂质，55%硫酸铵沉淀藻蓝蛋白。
盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。
最常用脱盐的方法是透析。
蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，故不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂志透析掉。
蛋白质含量测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等），本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质含量与595nm处吸光值成正比。
离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM纤维素），阴离子交换剂有弱碱性的二乙胺基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。
从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研究
从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研
究
胡一兵;胡鸿钧;李夜光;耿亚红
【期刊名称】《植物科学学报》
【年(卷),期】2002(020)004
【摘要】采用新鲜藻丝为原料和分段梯度盐析分离纯化钝顶螺旋藻Sp(NS)-90020的藻蓝蛋白(PC),经羟基磷灰石一次层析,能使提取的PC的纯度大于普遍认可的标准.由于该工艺流程较为简单,适合藻蓝蛋白的大量生产.藻胆蛋白经Sephadex凝胶过滤后的可达电泳纯度标准.经SDS-PAGE测得PC, APC的分子量分别约为38,33 kD.
【总页数】4页(P299-302)
【作者】胡一兵;胡鸿钧;李夜光;耿亚红
【作者单位】中国科学院武汉植物研究所,武汉,430074;湖北民族学院生物科学与技术学院,恩施,445000;中国科学院武汉植物研究所,武汉,430074;中国科学院武汉植物研究所,武汉,430074;中国科学院武汉植物研究所,武汉,430074
【正文语种】中文
【中图分类】Q946;Q949.22
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学校代码：11059学号：0802012040Hefei University本科毕业论文BACH ELO R DI SSERTATIO N论文题目：藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究学位类别：工学学士学科专业：生物工程作者姓名：导师姓名：夏潇潇完成时间：二零一二年五月目录摘要 (Ⅰ)Abstract (Ⅱ)1 引言 (1)1.1 螺旋藻的简介 (1)1.2 藻蓝蛋白介绍 (2)1.3 藻蓝蛋白的提取方法 (2)1.4 研究的意义、目的和内容 (3)1.4.1 研究的意义 (3)1.4.2 研究的目的 (3)1.4.3 研究的内容 (3)2 材料与方法 (4)2.1 原料和仪器 (4)2.1.1 原料 (4)2.1.2 主要仪器 (4)2.1.3 主要试剂 (4)2.2 实验方法 (5)2.2.1 原料中总蛋白质含量的测定 (5)2.2.2 螺旋藻的前处理及藻蓝蛋白计算 (5)2.2.3不同盐的提取实验 (6)2.2.4 冻融次数实验 (6)2.2.5 盐浓度实验 (6)2.2.6 提取次数实验 (7)3 结果与分析 (8)3.1 原料中总蛋白质含量结果与分析 (8)3.2 不同盐的提取实验结果与分析 (8)3.3 盐浓度实验结果与分析 (9)3.4 冻融次数实验结果与分析 (13)3.5 提取次数实验结果与分析 (18)3.6 总结 (22)5 结论 (23)参考文献 (24)致谢 (26)摘要本文对螺旋藻精片中藻蓝蛋白的提取工艺进行研究，考察不同盐、不同浓度、冻融次数、提取次数对藻蓝蛋白提取率的影响。
可知：针对不同盐的最佳提取条件分别为：氯化钠：浓度30%，冻融次数6次，提取次数3次；磷酸钾：浓度50%，冻融次数6次，提取次数4次；硫酸铵：浓度40%，冻融次数6次，提取次数6次；硝酸钾：浓度40%，冻融次数8次，提取次数6次。
在最优提取条件下，氯化钠、磷酸钾、硫酸铵和硝酸钾的提取率分别为11.00%、10.87%、11.767%和10.837%，其中硫酸铵的提取率最高，可将约98%的藻蓝蛋白提取出来。
关键词：藻蓝蛋白；盐析；冻融；提取；得率Abstractthis article research about the extraction process of Spirulina film and the extraction rate of different salts, different concentration, freezing and thawing times, the number of extraction; I Against the best Extracting conditions, respectively ①Sodium chloride: 30% concentration, freezing and thawing 6 times, three times the number of extraction; ②Potassium phosphate: 50% concentration, freezing and thawing 6 times, and extracted 4 times; ③Ammonium sulfate: 40% concentration, freezing and thawing 6 times, six times the number of extraction;④Potassium nitrate: 40% concentration, freezing and thawing times eight times, six times the number of extraction. Under the best extracting condition, the extraction rate of Sodium chloride; Potassium phosphate; Ammonium sulfate; Potassium nitrate are 11.00%.10.87%.11.767% and 10.837%,respectively.Ammonium ,sulfate can be extracted. The extraction rate about 98% of the phycocyanin .Key words：phycocyanin; salting; freezing and thawing; extraction; yield1 引言1.1 螺旋藻的简介螺旋藻（如图1），是存在于地球已逾30亿年的低等水生藻类植物，属于蓝藻门，颤藻科。
它们与细菌一样，细胞内没有真正的细胞核，所以又称蓝细菌。
蓝藻的细胞结构原始，且非常简单，是地球上最早出现的光合生物，其外观为蓝绿色，显微镜观察呈螺旋状，故而得其名[1]。
在非洲的乍得湖和墨西哥的Texcoco湖畔（图2），当地居民用螺旋藻作为食物来源已有一百年的历史。
螺旋藻因其丰富、优质的蛋白质而被联合国粮农组织和世界食品协会誉为“人类最理想和最优秀的食品”；国际儿童基金会则称“螺旋藻可以安全根除儿童营养不良”；Clement博士称其为大自然为人类早就准备好的一份“超级营养包”、“微型的营养宝库”；1973年第二届国际微生物蛋白质会议确认“螺旋藻是最佳蛋白质来源之一”、“螺旋藻是人类迄今为止所发现的最优秀的纯天然保健食品源”[2]。
图1显微镜下的螺旋藻图2螺旋藻的生长地螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，其蛋白质含量为56%~77%；总脂肪含量约7%，脂肪酸为5.7%，并且其中大多为多不饱和脂肪酸，亚油酸、γ-亚麻酸，螺旋藻中碳水化合物的含量为16.5%,并含有丰富的多糖[2]；维生素B1.55mg/kg、维生素B2.40mg/kg、维生素B6.3mg/kg、维生素B12.2mg/kg、泛酸11mg/kg、叶酸0.5mg/kg、烟酸113mg/kg、肌醇350mg/kg、生物素0.4mg/kg、维生素E190mg/kg、胡萝卜素4000mg/kg [3-7]。
螺旋藻是超碱性食品，可维持血液中酸碱值的平衡，降低胆固醇，减轻高血压和心脏病症状或减少其发病几率；有效改善胃病症状，对抗各种腹泻和便秘，防治贫血，帮助脂肪代谢，有效对抗心脑血管疾病，预防脂肪肝和肝硬化，降低血糖，预防糖尿病；预防因服用镇定剂、抗生素、抗癌剂等对肾机能的损害；减轻汞及药物对肾的毒性，使人体免受重金属的毒害；减肥，美容，去暗疮、黄褐斑，抗衰老。
螺旋藻中尤以蛋白质含量最为丰富，是大豆蛋白质的两倍，是目前已知植物中蛋白质含量最高的一种[4-6]。
1.2 藻蓝蛋白的介绍螺旋藻中的蛋白质被称为藻蓝蛋白体，它由多种藻蓝蛋白及连接蛋白或多肽组成，藻蓝蛋白是强荧光的色素-蛋白络合物，能捕获光能。
根据他们存在的不同发色团又把藻蓝蛋白分为三大类[11]：藻红蛋白(吸光度480~570nm)、藻蓝蛋白(吸光度590~630nm)、藻红蓝蛋白(吸光度560~600nm)和别藻蓝蛋白(吸光度620~665nm)。
其中藻蓝蛋白占总藻蓝蛋白中的20%左右。
藻蓝蛋白包含了一个蛋白和一个发色团，而蛋白是由分子量分别在18Ku和20Ku的α和β亚基组成。
藻蓝蛋白是一种重要的藻蓝蛋白，参与藻类高效的光传递过程，分离纯化藻蓝蛋白对于研究其结构以及模拟其生理功能有重要意义，作为一种荧光物质，藻蓝蛋白在生物标记等方面也有广阔的应用前景[12]。
1.3藻蓝蛋白的提取方法螺旋藻受其细胞壁的保护，采用机械方法很难达到破壁效果，所以目前提取藻蓝蛋白的方法通常有采用化学破壁法、溶胀法和反复冻融法等[13-16]。
①化学破壁法：是用化学缓冲液破坏细胞壁后提取藻蓝蛋白的方法。
虽然它可有效破壁，但也给下一步分离造成了很大麻烦，需要花费较多的工序，使运行成本大幅上升。
②溶胀法：是利用原料溶解，在一定条件下膨胀的性质进行破碎的方法。
该种方法需要的实验周期较长，实验条件要求高。
③超声法：是利用超声波粉碎技术控制仪器的频率、能量和波发射间歇周期，经过一定时间来使细胞破碎。
该方法操作简单，易控制，但单一使用此方法，必须使用高能量、低频率的超声仪才能达到理想的细胞破碎率，这会增加成本。
④反复冻融法：是将含有水分的螺旋藻置于0℃以下冻结成冰，然后取出在0℃以上解冻，利用水在-20℃﹣27℃的膨胀特性，破壁析出藻蓝蛋白。
这种技术完全采用了物理方法将螺旋藻的细胞壁破裂，不使用任何化学添加剂，同时耗费的能源很少，因此方法很简单，容易实施，保全了螺旋藻的固有成分，藻蓝蛋白的生物活性不受破坏。
此方法所需要的设备简单，整个破壁工序需要的时间短，可大大提高生产效率，降低成本。
蛋白质的提取多用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硝酸钾、氯化钠、磷酸钾等。
其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来。
1.4 研究的意义、目的和内容1.4.1 研究的意义藻蛋白是当前研究的热点，如何提高螺旋藻蛋白的提取率是拓宽螺旋藻应用的一个关键。
本文以反复冻融法破碎螺旋藻细胞，辅以超声提取技术，实现更快速更高效的藻蓝蛋白提取率，为螺旋藻蛋白质的充分利用提供研究基础。
1.4.2 研究的目的本文以反复冻融法破碎螺旋藻细胞，辅以超声提取技术，考察不同提取条件对藻蓝蛋白提取率的影响，确定最佳的提取条件，建立藻蓝蛋白盐析提取工艺路线。
1.4.3 研究的内容（1）原料中总蛋白质含量的测定。
（2）不同盐、不同浓度、冻融次数、提取次数对藻蓝蛋白提取率的影响。
2 材料和方法2.1 材料与方法2.1.1 原料原料名称生产厂家产品批号螺旋藻精片云南白药-千草堂Q/YBZ 0002S-2011 2.1.2 主要仪器仪器名称生产厂家KDC160HR型高速冷冻离心机上海博讯实业有限公司医疗设备厂HF-2.5B脉冲超声循环提取机北京弘祥隆生物技术开发有限公司ATN-300型全自动凯氏定氮仪上海洪纪仪器设备有限公司电子天平德国赛多利斯股份有限公司752分光光度计合肥正鑫仪器设备有限公司福意联电冰箱北京福意电器有限责任公司HH型恒温水浴锅巩义市科瑞有限公司2.1.3 主要试剂主要试剂生产厂家硫酸铵国药集团化学试剂有限公司磷酸钾盐国药集团化学试剂有限公司浓硫酸国药集团化学试剂有限公司硫酸铜国药集团化学试剂有限公司氯化钠国药集团化学试剂有限公司硝酸钾国药集团化学试剂有限公司2.2实验方法2.2.1原料中总蛋白质含量的测定实验采用的为凯氏定氮法。
主要分为两个部分组成：(1) 消化：称取0.2g 样品粉末，精确至0.001g ，移入干燥的25mL 定氮瓶中，加入0.2g 硫酸铜、6g 硫酸钾，再加入20mL 浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上，在温度约100℃小心预热2h ，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，升高温度至350℃，并保持瓶内溶液微沸状态，待溶液由黑色变为棕黄色，再变为蓝绿色并澄清后，再继续加热1h 。