微机模拟蛋白质纯化实验报告
计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践报告(10号蛋白)
计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践报告姓名：学号：班级：成绩：一、计算机模拟实验初始条件：样品号：10样品稳定的条件：10号样品在pH3.5～11.5稳定；温度< 69°C稳定。
二、计算机模拟“蛋白质纯化”实验内容：（1）粗分离（盐析）硫酸铵饱和度沉淀蛋白(mg)沉淀酶活力(U)上清蛋白(mg)上清酶活力(U)沉淀比活力(U/mg)上清比活力(U/mg)酶回收率纯化倍数8%498 9800100% 1.0 9% 497.9 975799.8% 1.0 10% 497.5 958698.9% 1.0 18% 89.9 9029 100.4396.2% 5.1 19% 105.6 9543 90.3798.9% 4.6 20% 117.3 9713 82.8099.8% 4.221%126.1 9757 77.38100% 3.9计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践时间：20 年月日如表格中所示，根据相关理论及实验经验，选择了从8％硫酸铵饱和浓度起进行梯度盐析测定，经过数据对比，最终选择9％作为除杂（取上清液）的“低浓度”，因为该浓度下上清中酶的比活力和纯化倍数较相近浓度而言具有优势。
在选定低浓度并进行取上清液步骤后，我们就开始对选择高浓度。
同样地经过数据对比，最终选择了20％作为把绝大部分目标蛋白沉降的“高浓度”，其原则也是要保证在比活力和纯化倍数大的情况下，选择比活力最大的硫酸铵浓度。
注：比活力(U/mg)＝酶活力(U)：蛋白质量(mg)。
选择了9％和20％这两个浓度后，我们开始正式的盐析过程，即先在9％浓度下取上清液，然后20％浓度下取沉淀。
具体操作及所取上清/沉淀数据（如图1）。
图1 盐析结果计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践时间：20 年月日（2）细分离（各种纯化技术条件及结果）阴离子交换层析：Start conc设为0 M，End conc设为0.6M，Equilibration ph（平均PH）设为6，用100％的样品去进行跑样层析（如图2）。
微机模拟蛋白质纯化实验报告
微机模拟蛋⽩质纯化实验报告微机模拟蛋⽩质纯化实验⼀、实验⽬的：1. 了解模拟⽣化⼲实验的⽅法和意义，掌握⽤protein软件提纯蛋⽩质的⽅法。
2. 进⼀步熟悉层析、热变性、盐析等常⽤⽣化分离⽅法的原理和应⽤。
⼆、实验原理：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋⽩。
任务要求利⽤软件提供的⼏种实验技术，提纯每⼀个⽬的蛋⽩，最终达到单向电泳⼀条带，双向电泳⼀个点，⽽且使⽤的⼈时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过⼀个特定值。
在每个任务开始时，软件给出⽬的蛋⽩的⼀些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利⽤这些信息，可以使实验少⾛弯路。
“Protein”提供的分离纯化⽅法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶⾊谱)；④离⼦交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。
在“Protein”所提供的各种分离纯化⽅法中，热变性法和盐析法是⽐较好的粗提⽅法，在提纯的早期使⽤效果较好。
层析是各种⽅法中最强有⼒的⽅法，制备电泳虽然纯化倍数⾼，但是回收率低。
在各种层析⽅法中，⼜以离⼦交换层析最为有效和易于使⽤，并且耗费的⼈时和经费也较少。
排层层析和聚焦层析耗费较⼤，但在某些特定情况下，这两种⽅法是不可替代的。
“Protein”提供了四种电泳⽅法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。
这些电泳⽅法不但可以⽤以检测样品的纯度，⽽且也给出了样品的⼀些信息，如分⼦量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以⽤于制备。
本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。
1 酸性条件下稳定的蛋⽩（Windows 3号酶）3号酶在62℃以下稳定，稳定pH范围3.8～5.8（酸性条件）。
分离纯化步骤:1 热变性：⽔浴温度61℃，⽔浴时间60min2 离⼦交换：然后进⾏PAGE和SDS-PAGE检测结果分析：在检测时出现两条带的时候可能是由于蛋⽩质的含有两个亚基。
蛋白质纯化实验技术报告
蛋白质纯化实验技术报告
植保学院实验中心安装了AKTA avant蛋白纯化系统，在经过一年多的使用过程中，部分研究者还存在一些疑问，因此，我院邀请了GE公司的技术专家，针对蛋白纯化原理及在农业研究领域的应用进行讲座和上机培训。
内容分为两期举办，本期主要讲解亲和层析和凝胶过滤两大原理。
时间：2017年9月12日（周二），上午9：00—11:00
地点：理科楼C303
主讲人：刘畅博士（GE中国，蛋白纯化资深应用技术专家）
内容：讲解蛋白纯化基本原理及在农业上的应用，包括亲和层析、凝胶过滤两大纯化原理。
部分热点纯化问题答疑，如：原核表达蛋白纯化、蛋白二聚体鉴定的解决策略、抗体纯化流程等。
举办单位：植物保护学院
科学研究院实验室与平台处
联系人：马洪雨老师
电话：
欢迎有兴趣的老师和同学们前来交流！。
蛋白纯化实验报告药理药效研究动物模型
1ml 1h 20ml(低盐)
Tev酶量 Hislink量
20 7
1ml 1h 50ml(中间2 次 500mMNacl) 20 7
1ml 1h 20ml(250 mMNacl) 20 7
2013.03.27-03.28 ctck结构域蛋白纯化
因一开始使用的胶因分离胶太短，经王 老师检查后觉得胶的质量太差，故重新跑 胶，跑胶的顺序为：L，低盐E2，高盐E2 ， 250mM E2 ，过柱（3.26） E2 ，M。但跑 胶结果无条带显示，可能蛋白降解比较严 重。
2013.03.25-3.26 ctck蛋白纯化+ctck小量诱导
融 合 蛋 白
loading
Ctck E2
Ctck E1
Ctck
Ctck
Ctck
B 上清 A 上清 B 菌体 A 菌体
2013.03.25-3.26 ctck蛋白纯化+ctck小量诱导
菌体 Halo量 结合时间 洗涤量 Tev酶量 Hislink量
2013.03.27-03.28 Mature结构域蛋白纯化+ctck大量
M loading S
M
M
M E1
M E2
Ctck Ctck 菌体 上清
Ctck 沉淀
M
S-Tev FT
：融合蛋白；
：目的蛋白；
：Halo蛋白；
：杂蛋白
2013.03.27-03.28 Mature结构域蛋白纯化+ctck大量 菌体 超声条件 Halo量 结合时间 洗涤量 Tev酶量 Hislink量
2013.03.28-03.29 ctck结构域蛋白纯化
杂蛋白 融 合 蛋 白
Tev酶
纯化蛋白,实验总结
实验汇总实验内容1近两周主要做了肿瘤多肽疫苗Vbp3的诱导表达和纯化以及鉴定实验。
2学习培养细胞一些技能，给细胞换液并传代，自己培养了一瓶E3细胞，并学习处理细胞，传代，计数。
学习使用倒置显微镜观察细胞，以及细胞实验室的一些注意事项。
3 取得杂交瘤细胞，然后我给小鼠注射，每只0.5ml制备抗体用。
实验结果1先培养了菌株进行原核表达多肽，经过表达后SDS-PAGE电泳鉴定可以得出目的蛋白得到了表达。
通过与Maker对比可以看出有目的蛋白表达。
2然后进行超声破碎菌体，使表达的蛋白裂解，然后进行洗脱纯化。
洗脱液的浓度梯度分别为5mM 咪唑，20 mM 咪唑，80mM 咪唑，250 mM 咪唑，500mM 咪唑。
通过SDS-PAGE电泳鉴定出，在250 mM 咪唑处有目的蛋白被洗脱出。
如下图所示：Maker 样品PBS洗脱5Mm 20 mM 80 mM 250 mM 500mM 250Mm图中开始加的为maker，然后为裂解后未洗脱的样品，然后pbs,接着是不同浓度的咪唑洗脱下来的蛋白。
在不同浓度洗脱液的紫外峰值分别为：3以bFGF 为抗原包板做ELISA实验，以鼠单抗和人源化抗体为一抗，以羊抗鼠酶标抗体为二抗，进行检测鼠单抗的效价。
结果如下表所示：Measurement count: 1 Filter:4501 2 3 420000 0.121 0.121 2.563 2.733 0.121 2.648 0 0.120208 40000 0.105 0.116 2.52 2.533 0.1105 2.5265 0.007778 0.009192 80000 0.11 0.131 2.15 1.93 0.1205 2.04 0.014849 0.155563 160000 0.084 0.084 1.361 1.654 0.084 1.5075 0 0.207182 320000 0.109 0.131 0.824 1.082 0.12 0.953 0.015556 0.182434 640000 0.112 0.113 0.578 0.632 0.1125 0.605 0.000707 0.038184 1280000 0.115 0.126 0.429 0.423 0.1205 0.426 0.007778 0.004243 2560000 0.111 0.12 0.112 0.082 0.1155 0.097 0.006364 0.021213ELISA 结果结果分析图标准误差图图中1，2中一抗为人源化抗体，3，4中一抗为鼠单抗。
关于纯化的实验报告
一、实验目的1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质纯化的操作技术。
3. 了解蛋白质纯度的鉴定方法。
二、实验原理蛋白质纯化是指从复杂的蛋白质混合物中分离出目标蛋白质的过程。
常用的蛋白质纯化方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
本实验采用盐析法对蛋白质进行初步纯化，并通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色对纯化效果进行鉴定。
三、实验材料1. 蛋白质样品：酶溶液、标准蛋白质样品2. 试剂：硫酸铵、SDS-PAGE电泳缓冲液、考马斯亮蓝G250、Tris-HCl、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、琼脂糖、双蒸水等3. 仪器：电泳仪、紫外观察分析仪、离心机、移液器、烧杯、玻璃棒、滴管、剪刀等四、实验步骤1. 盐析法纯化蛋白质（1）将酶溶液与硫酸铵溶液按照一定比例混合，室温静置一段时间。
（2）离心分离，收集沉淀。
（3）将沉淀用双蒸水洗涤，去除杂质。
（4）将洗涤后的蛋白质沉淀溶解于适量的双蒸水中，得到初步纯化的蛋白质溶液。
2. SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果（1）配制10%的琼脂糖凝胶，加入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液。
（2）将标准蛋白质样品和纯化后的蛋白质样品进行电泳分离。
（3）关闭电源，取出琼脂糖凝胶，用考马斯亮蓝G250染色。
（4）观察电泳图谱，比较纯化前后蛋白质的条带变化，判断纯化效果。
五、实验结果与分析1. 通过盐析法纯化蛋白质后，SDS-PAGE电泳图谱显示，蛋白质条带较纯化前明显减少，表明蛋白质纯化效果较好。
2. 纯化后的蛋白质条带与标准蛋白质样品的条带基本一致，进一步说明纯化效果良好。
六、实验结论本实验通过盐析法对蛋白质进行初步纯化，并采用SDS-PAGE电泳对纯化效果进行鉴定。
结果表明，蛋白质纯化效果较好，达到了实验目的。
七、实验讨论1. 盐析法是一种简单、经济、有效的蛋白质纯化方法，适用于初步纯化。
2. 实验过程中，蛋白质沉淀的收集和洗涤是关键步骤，直接影响纯化效果。
模拟“蛋白质提取”实验设计
模拟“蛋白质提取”实验设计《高中生物(选修一)》中的“蛋白质提取技术”一节,利用Sephadex G-75进行蛋白质提取的操作。
该实验是当今蛋白质技术的真实反映,能够激发学生学习兴趣,但实验投入昂贵,且占用课时较多,在目前条件下,尚难以在中学普遍推广。
在此,笔者利用纯水制取工业中常用的阴-阳离子交换树脂代替Sephadex G-75进行模拟实验,不但能够说明蛋白质技术的基本原理,还大大降低了实验成本、缩短了实验课时,适合广大中学生物实验教学使用。
一、材料和方法1.树脂的清洗将市售732阳离子交换树脂、717阴离子交换树脂各称取3g,分别放置于50ml 小烧杯中。
加入30ml蒸馏水,用玻璃棒缓慢搅拌20s,倒去上层清液(留在烧杯中的水分不超过10ml)。
反复上述操作,直至上清液呈无色透明为止。
之后加入30ml 浓度为95%的乙醇,缓慢搅拌30s,室温浸泡过夜。
2.树脂的活化倒去乙醇,蒸馏水冲洗至无乙醇气味。
倒去多余水分后(留在烧杯中的水分不超过10ml),向阳离子树脂中加入30ml浓度为12%的盐酸,向阴离子树脂中加入30ml浓度为10%的NaOH溶液。
玻璃棒搅拌30s使溶液与树脂充分接触,静置4h。
3.装柱倒去盐酸、NaOH溶液,用蒸馏水冲洗3～5遍。
将阴、阳离子树脂各装填到1个10ml注射器中,分别记作阴离子交换柱和阳离子交换柱。
4.加入样品及检测用滴管吸取0.05mol/L的CuSO4溶液(记作溶液A),以1滴/s的速度滴入阳离子交换柱中。
用试管收集流出液体5ml,记作溶液B。
用滴管吸取3ml溶液B,以1滴/s的速度滴入阴离子柱中,用试管收集流出液体,记作溶液C。
分别将A,B,C溶液加入0.1mol/L的NaOH溶液和0.05mol/L的Ba(NO3)2中,观察现象。
二、结果与分析溶液A在NaOH和Ba(NO3)2溶液中都有沉淀,溶液B在NaOH溶液中无沉淀而在Ba(NO3)2溶液中有沉淀,C溶液在NaOH和Ba(NO3)2溶液中都没有沉淀(见表1)。
蛋白分离纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质分离纯化的基本原理和操作方法。
2. 学习不同分离纯化技术的应用。
3. 提高实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有复杂的结构和功能。
蛋白质分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
本实验采用多种分离纯化技术，包括：材料预处理、细胞破碎、离心分离、沉淀分离、膜过滤分离和色谱分离等，实现对蛋白质的分离纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、质粒DNA、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR产物、琼脂糖、电泳缓冲液、考马斯亮蓝R-250等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、玻璃棒、培养箱、无菌操作台等。
四、实验步骤1. 蛋白质提取（1）将大肠杆菌细胞培养至对数生长期。
（2）收集细胞，用玻璃棒搅拌，加入预冷的提取缓冲液，低温条件下进行细胞破碎。
（3）离心分离，取上清液即为蛋白质粗提液。
2. 蛋白质沉淀（1）向蛋白质粗提液中加入一定量的硫酸铵，搅拌溶解。
（2）离心分离，收集沉淀，即为蛋白质沉淀。
3. 蛋白质溶解（1）将蛋白质沉淀溶解于适量的缓冲液中。
（2）调整pH值，使蛋白质处于适宜的溶解状态。
4. 蛋白质分离纯化（1）离子交换色谱：将蛋白质溶液上样至离子交换柱，用不同浓度的盐溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。
（2）凝胶过滤色谱：将蛋白质溶液上样至凝胶过滤柱，用缓冲液进行洗脱，收集目标蛋白峰。
5. 蛋白质鉴定（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白质分子量。
（2）考马斯亮蓝R-250染色：观察蛋白质条带，判断蛋白质纯度。
五、实验结果与分析1. 蛋白质提取：通过细胞破碎和离心分离，成功提取出大肠杆菌细胞中的蛋白质。
2. 蛋白质沉淀：硫酸铵沉淀法成功地将蛋白质从粗提液中分离出来。
3. 蛋白质溶解：调整pH值后，蛋白质成功溶解于缓冲液中。
4. 蛋白质分离纯化：离子交换色谱和凝胶过滤色谱成功地将目标蛋白从粗提液中分离出来。
提取纯化蛋白实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质提取纯化的基本原理和方法。
2. 学习蛋白质纯化过程中的操作技巧和注意事项。
3. 通过实验验证蛋白质提取纯化的效果。
二、实验原理蛋白质提取纯化是指从生物材料中提取目标蛋白，并通过一系列的分离纯化步骤，去除其他蛋白质、核酸、脂质等杂质，获得高纯度的目标蛋白。
实验中常用的提取纯化方法有：细胞破碎、抽提、沉淀、分级、除盐、浓缩等。
三、实验材料1. 生物材料：细胞、组织、血清等。
2. 试剂：盐酸、稀SDS、有机溶剂、稀碱、硫酸铵、透析袋、超滤膜、Ni柱等。
3. 仪器：匀浆机、离心机、电泳仪、凝胶层析仪等。
四、实验步骤1. 前处理：根据生物材料的不同，选择合适的细胞破碎方法，如动物细胞用匀浆机、组织捣碎机或超声波；植物细胞用石英砂研磨或纤维素酶处理；微生物用超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等。
2. 抽提：根据蛋白质的性质选择合适的抽提方法。
可溶蛋白用盐酸、脂蛋白用稀SDS或有机溶剂、不溶蛋白用稀碱进行抽提。
抽提原则为少量多次。
3. 粗提：去除糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。
常用方法有沉淀法（核酸沉淀法、蛋白沉淀法、选择变性）、分级法（盐析或有机溶剂）。
4. 除盐和浓缩：去除蛋白质中的中性盐，常用方法有透析法、分子筛；浓缩方法有反透析、冻干、超滤等。
5. 精细分离：采用凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等方法对蛋白质进行精细分离。
6. 鉴定：采用SDS-PAGE、Western Blot等方法鉴定蛋白质的纯度和活性。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过上述步骤，成功提取纯化了目标蛋白，并进行了鉴定。
2. 结果分析：根据SDS-PAGE和Western Blot结果，目标蛋白的纯度达到90%以上，活性得到验证。
六、实验讨论1. 实验过程中，选择合适的细胞破碎方法、抽提方法和分离纯化方法对蛋白质的提取纯化至关重要。
2. 实验过程中应注意操作技巧，如防止蛋白质降解、避免氧化等。
蛋白质纯化实验技术报告
蛋白质纯化实验技术报告蛋白质是生物体内最基本的组成成分之一，它在维持生命的各个方面都起着重要的作用，因此，研究蛋白质的纯化技术具有重要的科学意义和应用价值。
本文将从蛋白质的纯化目的、方法选择、实验步骤和结果分析等方面进行详细介绍。
一、纯化目的二、方法选择蛋白质的纯化方法多种多样，常用的包括盐析、凝胶过滤、离子交换、亲和层析、逆流层析等。
在选择方法时，需要根据蛋白质的特性、溶液条件和设备条件等因素进行综合考虑。
三、实验步骤1.细胞破碎和初步纯化：将含有目标蛋白质的细胞悬液经离心分离细胞碎片，得到上清液，进行初步纯化。
2.过滤和沉淀：使用滤膜或沉淀物去除杂质，得到蛋白质溶液。
3.层析纯化：根据蛋白质的性质选择适当的层析柱，如离子交换柱、亲和柱等，进行层析纯化。
4.打破和再层析：对于较复杂的蛋白质混合物，可以使用还原剂或表面活性剂等打破蛋白质复合物，然后再次进行层析纯化，以提高纯化效果。
5.纯化评价：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或质谱等方法对纯化后的蛋白质样品进行评价，确认其纯度和活性。
四、结果分析根据实验结果，可以评估所选纯化方法的有效性和适用性，判断所得纯化样品的纯度和活性。
同时，还需对纯化条件进行优化，以进一步提高纯化效果。
五、结论本实验采用了其中一种纯化方法成功地获得了目标蛋白质的高纯度和高活性样品，并对其进行了初步的理化性质分析。
结果表明，所选的纯化方法具有较高的有效性和适用性，可以应用于进一步的研究和应用。
综上所述，蛋白质纯化实验是一项复杂而重要的工作，需要根据蛋白质的特性和实验条件等因素进行综合考虑，以选择合适的纯化方法。
通过详细的实验步骤和结果分析，可以得出纯化效果的评价和结论，并为进一步的研究提供有价值的参考。
蛋白质的分析实训报告
一、实训背景蛋白质是生命活动的基本物质之一，广泛存在于生物体内，具有多种生物学功能。
蛋白质分析是生物化学、分子生物学和生物工程等领域的重要研究内容。
为了提高我们对蛋白质性质、结构和功能的认识，我们进行了蛋白质分析实训，通过实验操作，学习蛋白质的提取、纯化、鉴定和分析方法。
二、实训目的1. 掌握蛋白质提取和纯化的基本原理和操作技术。
2. 学习蛋白质的鉴定和分析方法。
3. 培养实验操作能力和科学思维。
三、实训内容1. 蛋白质提取（1）材料：鸡蛋清、磷酸盐缓冲液、硫酸铵、离心机等。
（2）方法：将鸡蛋清加入磷酸盐缓冲液，加入硫酸铵，搅拌均匀，静置离心，收集沉淀。
（3）结果：得到白色沉淀，即为提取的蛋白质。
2. 蛋白质纯化（1）材料：上述提取的蛋白质、离子交换层析柱、缓冲液等。
（2）方法：将提取的蛋白质加入离子交换层析柱，用不同浓度的缓冲液进行洗脱，收集各洗脱峰。
（3）结果：得到纯化的蛋白质。
3. 蛋白质鉴定（1）方法：采用SDS-PAGE电泳技术对纯化的蛋白质进行鉴定。
（2）结果：观察到目的蛋白在特定位置出现条带，证明蛋白质鉴定成功。
4. 蛋白质分析（1）方法：采用Western blot技术对纯化的蛋白质进行定量分析。
（2）结果：通过比较目的蛋白与标准蛋白的条带强度，计算出目的蛋白的含量。
四、实训结果与分析1. 蛋白质提取通过实验，我们成功从鸡蛋清中提取出蛋白质。
实验过程中，我们学会了如何根据蛋白质的性质选择合适的提取方法，以及如何处理提取过程中的各种问题。
2. 蛋白质纯化在蛋白质纯化实验中，我们掌握了离子交换层析技术，成功地将目的蛋白从混合物中分离出来。
实验过程中，我们学会了如何选择合适的缓冲液和洗脱条件，以及如何判断蛋白质的纯度。
3. 蛋白质鉴定通过SDS-PAGE电泳技术，我们成功鉴定出目的蛋白。
实验过程中，我们学会了如何制备电泳样品、操作电泳仪以及观察电泳结果。
4. 蛋白质分析通过Western blot技术，我们对纯化的蛋白质进行了定量分析。
蛋白质分离纯化实验报告模板
高级生物与分子生物学实验报告姓名：学号：指导老师：实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达【实验原理】：1.DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4 DNA 连接酶连接表达融合蛋白的重组质粒。
2.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热刺激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。
由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因（本实验质粒带有卡那霉素抗性基因），根据转化菌的耐药特性进行删选。
3.裂解法小量制备质粒DNA的原理：SDS和NaOH使蛋白质和染色体DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA 存在于上清液中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的蛋白质。
4.重组质粒鉴定的原理：对所有的重组质粒用限制性内切酶酶切，酶切产物行凝胶电泳以鉴定质粒DNA。
5.组质粒的诱导表达的原理：Ptac启动子受lac阻遏物所调控，该启动子需要加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)进行诱导。
IPTP的终浓度为1mmol/L。
6.融合蛋白的表达检测的原理：经诱导表达的重组体裂解后，经SDS-PAGE鉴定。
染色后明显出现目的蛋白带，而未经诱导的菌无此蛋白带。
【实验步骤】：1.配制LB和LK培养基2.连接：质粒片断＋目的基因（1.5ml离心管），16℃水浴过夜，65℃水浴10min，灭火连接酶。
ddH2O 12ulX-DNA(目的基因） 3ulpET-28a（质粒片断） 2ul10×buffer 2ulT4 ligase 1ul3.复苏DH5a和BL21，并接种DH5a 1支，接种BL21 1支（10ul菌液+2ml LB）于试管，第二天7：30分别转接DH5a和BL21（1ml+20mlLB）于烧瓶。
（分别准备制备感受态，两个连接反应用来转化）4.DH5a和BL21感受态细胞的制备：在烧瓶孵育2.5h后，取1.5ml菌液至1.5ml离心管，4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/lCaCl2 ，混匀，离心4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/lCaCl2 ，混匀，冰浴30min，离心（4℃，4000rmp，5min），弃上清。
蛋白纯化整体实验报告
蛋白纯化整体实验报告实验目的本实验的主要目的是学习和掌握蛋白纯化的基本原理和方法，通过实验操作了解蛋白质纯化的整体过程，从而得到纯净的蛋白质样品。
实验原理蛋白纯化是将复杂混合物中的目标蛋白提取出并得到纯净样品的过程。
蛋白质的纯化一般包括以下几个步骤：1. 细胞破碎：将含有目标蛋白的细胞破碎，使目标蛋白从细胞中释放出来。
2. 澄清：通过离心等方法去除破碎细胞中的固体残渣，得到澄清的蛋白质上清液。
3. 分离目标蛋白：根据目标蛋白的特性选择适当的分离方法，如对目标蛋白进行亲和层析、凝胶渗透层析等。
4. 浓缩：将目标蛋白从大量的上清液中浓缩，以得到更纯净的样品。
5. 纯化检验：对所得样品进行纯度和活性的检验，确保得到纯净的、具有活性的蛋白质样品。
实验步骤步骤一：细胞破碎1. 将待检测的细胞进行冻融处理，用PBS缓冲液洗涤细胞两次。
2. 加入细胞破碎缓冲液，使细胞完全破裂释放蛋白质。
3. 低速离心去除细胞碎片和核酸。
步骤二：澄清1. 取得上清液，初步除去细胞残渣。
2. 用高速离心对上清液进行超速离心，去除大部分颗粒和碎片。
3. 将上清液过滤，去除细微残渣。
步骤三：分离目标蛋白1. 根据目标蛋白的特性选择适当的分离方法，如亲和层析、凝胶渗透层析等。
2. 对蛋白质样品进行层析操作，同时根据各分离步骤的参数进行条件优化。
步骤四：浓缩1. 使用合适的蛋白质浓缩方法，将目标蛋白质从大量上清液中浓缩。
步骤五：纯化检验1. 对所得的蛋白质样品进行纯度检验，如SDS-PAGE电泳分析等。
2. 对纯化样品进行活性检验，如酶活性测定或其它适当方法。
实验结果和讨论在本次实验中，我们成功地利用细胞破碎、澄清、分离、浓缩等步骤对目标蛋白进行了纯化。
通过SDS-PAGE电泳分析，我们确定所得样品具有较高的纯度。
经过活性检验，我们也发现纯化后的蛋白具有一定的活性，符合预期结果。
然而，我们在实验过程中也遇到了一些问题。
首先，在细胞破碎过程中需要选择合适的破碎缓冲液和破碎时间，否则可能会导致目标蛋白的降解或损失。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
蛋⽩质的表达、纯化及检测-分⼦实验报告实验⽬的1.了解外源基因在⼤肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会⽤SDS-PAGE电泳法分离不同分⼦量的蛋⽩质3.学习通过亲和层析法纯化⽬的蛋⽩4.学会考马斯亮蓝染⾊法和蛋⽩质杂交法检测蛋⽩质实验原理1.外源基因在⼤肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac 操作⼦的启动⼦。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋⽩LacI与lac操作⼦结合，使外源基因不能表达；向培养基中加⼊诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋⽩变构失活，不能与lac操作⼦结合，外源基因就表达。
2.蛋⽩质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常⽤的定性分析蛋⽩质的电泳⽅式，特别是⽤于蛋⽩质纯度检测和测定蛋⽩质分⼦量。
其分离原理是根据蛋⽩质分⼦量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加⼊破坏了蛋⽩质的⼆级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋⽩质充分结合形成SDS-蛋⽩质复合物，稳定地存在于均⼀的溶液中，SDS与蛋⽩质结合后使SDS-蛋⽩质复合物上带有⼤量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从⽽使蛋⽩质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分⼦之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分⼦质量的⼤⼩，这样分离出的谱带也为蛋⽩质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋⽩质：考马斯亮蓝是⼀种蛋⽩质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋⽩肽链中碱性氨基酸残基或芳⾹族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多⽤于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋⽩质条带的染⾊；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝⾊，与蛋⽩质结合虽然⽐较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染⾊后为蓝⾊，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以⽤来对电泳条带染⾊。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按⼀定顺序连接在⼀起，融合阅读框架的表达产物是⼀个杂和蛋⽩。
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
蛋白纯化实习报告
一、实习背景随着生物技术的快速发展，蛋白纯化技术在生物制药、食品安全、疾病诊断等领域具有广泛的应用。
为了提高自身的实践能力，我们选择了蛋白纯化实习，深入了解蛋白纯化的原理、方法和设备，并实际操作进行蛋白纯化实验。
二、实习内容1. 蛋白纯化原理蛋白纯化是利用蛋白质在不同溶液中的溶解度、电荷、分子大小、亲和力等性质差异，通过层析、离心、电泳等手段将蛋白质从复杂混合物中分离出来的过程。
2. 蛋白纯化方法（1）层析法：根据蛋白质在固定相和流动相之间的分配系数不同，实现蛋白质的分离。
常用的层析方法有凝胶过滤、离子交换、亲和层析等。
（2）离心法：根据蛋白质的密度差异，通过离心力将蛋白质从混合物中分离出来。
（3）电泳法：根据蛋白质在电场中的迁移速度差异，实现蛋白质的分离。
3. 蛋白纯化设备（1）层析柱：用于进行层析实验，包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等。
（2）离心机：用于进行离心实验，分离蛋白质。
（3）电泳仪：用于进行电泳实验，分离蛋白质。
三、实习过程1. 准备实验材料：包括蛋白质样品、缓冲液、层析柱、离心机、电泳仪等。
2. 实验操作：（1）凝胶过滤：将蛋白质样品加入层析柱，用缓冲液进行洗脱，收集蛋白质洗脱峰。
（2）离子交换：将蛋白质样品加入层析柱，用不同pH值的缓冲液进行洗脱，收集蛋白质洗脱峰。
（3）亲和层析：将蛋白质样品加入亲和层析柱，用洗脱液进行洗脱，收集蛋白质洗脱峰。
（4）离心：将蛋白质样品加入离心管，进行离心分离。
（5）电泳：将蛋白质样品加入电泳槽，进行电泳分离。
3. 数据分析：通过紫外检测、比色法等方法，对纯化后的蛋白质进行定量分析。
四、实习总结通过本次蛋白纯化实习，我们掌握了蛋白纯化的原理、方法和设备，并实际操作进行了蛋白纯化实验。
在实习过程中，我们学会了如何选择合适的纯化方法、优化实验条件，以及如何进行数据分析和结果判断。
此次实习提高了我们的实验技能，为今后从事相关领域的研究奠定了基础。
五、实习体会1. 实践是检验真理的唯一标准。
微量蛋白纯化实验报告
实验目的：本实验旨在学习并掌握微量蛋白纯化的基本原理和方法，通过实验操作，实现对目标蛋白的有效提取和纯化，并对其纯度和活性进行初步评估。
实验原理：蛋白质的纯化是基于蛋白质在物理化学性质上的差异，如分子量、电荷、溶解度等，通过不同的分离技术将目标蛋白从复杂混合物中分离出来。
本实验采用离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法进行微量蛋白纯化。
实验材料：1. 蛋白质样品：细胞裂解液或组织匀浆等。
2. 离子交换层析柱：Sephadex G-25或类似产品。
3. 凝胶过滤层析柱：Sephadex G-75或类似产品。
4. 蛋白质标记物：如考马斯亮蓝G-250等。
5. 试剂：Tris-HCl缓冲液、NaCl、Gel Loading Buffer等。
实验步骤：一、离子交换层析1. 准备样品：将蛋白质样品用Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）稀释至适当浓度。
2. 洗柱：用Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）平衡离子交换柱，去除柱中杂质。
3. 加样：将稀释后的样品上柱，控制流速，使样品均匀分布在柱床上。
4. 洗脱：用不同浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液。
5. 分析：取部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳，观察目标蛋白的洗脱峰。
二、凝胶过滤层析1. 准备样品：将离子交换层析后的目标蛋白样品用Gel Loading Buffer稀释。
2. 洗柱：用Gel Loading Buffer平衡凝胶过滤柱，去除柱中杂质。
3. 加样：将稀释后的样品上柱，控制流速，使样品均匀分布在柱床上。
4. 洗脱：用Gel Loading Buffer进行洗脱，收集洗脱液。
5. 分析：取部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳，观察目标蛋白的洗脱峰。
三、蛋白纯度评估1. 蛋白质标记：取部分纯化后的样品，加入蛋白质标记物，进行比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
2. SDS-PAGE电泳：取部分纯化后的样品，进行SDS-PAGE电泳，观察目标蛋白的条带。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
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微机模拟蛋白质纯化实验
一、实验目的：
1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein软件提纯蛋白质的方法。
2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。
二、实验原理：
“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。
任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。
在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。
“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。
在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。
层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。
在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。
排层层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。
“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。
这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。
本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。
1 酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶）
3号酶在62℃以下稳定，稳定pH范围3.8～5.8（酸性条件）。
分离纯化步骤:
1 热变性：水浴温度61℃，水浴时间60min
2 离子交换：
然后进行PAGE和SDS-PAGE检测
结果分析：在检测时出现两条带的时候可能是由于蛋白质的含有两个亚基。
PI大概为5.6。
左右
2碱性条件下的稳定的蛋白（Windows 5号酶）
1热变性发
2离子交换
3电泳结果
4：page和sds-page检测
结果分析：PI大约为7.0。
检测结果发现两条提纯结果不是很理想白色条。
2 碱性条件下稳定的蛋白（Windows 30号酶）
30号酶在52℃以下稳定，稳定pH范围5.5～10.1（碱性条件）。
分离纯化步骤:
1 热变性：水浴温度51℃，水浴时间60min
2 硫铵沉淀：初始百分饱和度20％，终末百分饱和度65％(质量分数)，收集沉淀组分
3 离子交换层析：
填料DEAE－Sephadex A-50，柱长：10cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate （2.2－8.0），pH 6.4，流速：0.3ml/min，离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L，洗脱体积：300ml。
收集从77—100管的样品进行二维电泳分析：
因杂质蛋白与目标蛋白Mr相差较大，可用凝胶层析进行进一步分离
D）凝胶层析：
填料Sephadex G-75，柱长：100cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate （2.2－8.0）pH 6.4，浓度0.02mol/L，流速：0.3ml/min，
收集后进行如下检测：
检测纯化结果：
A）二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
已达到一个点的要求。
B）PAGE：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0
用PAGE检验，已达到一个点的要求，作为对比再用SDS－PAGE检验。
C)SDS-PAGE：分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），
SDS－PAGE检验结果显示，有一条带。
：
实验结果分析：
提纯效果比上两个好，只有一条白条。
此蛋白质的PI约为6.8。