基因克隆的四大要素(Four Elements for Gene Cloning)

将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。

要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。

22楼一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。

基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。

因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。

工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。

基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。

因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。

首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。

从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。

首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。

核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。

原核生物的限制和修饰系统犹如高等动物的免疫系统，依靠一对识别相同序列的核酸限制性内切酶和甲基化酶活性来对抗外来DNA 的入侵：当自身的基因组在复制完成下轮DNA 复制尚未开始前就被甲基化酶修饰(使某特定序列甲基化), 避免了被对应的限制性内切酶的识别和水解，而入侵的噬菌体由于未来得及修饰而被破坏，从而保护细菌不受噬菌体的感染。

各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。

这些酶的功能就是通过特异性序列的识别后进行DNA 的切割，来限制外源性DNA 侵入自身的细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。

根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：I、II、III类：第I 类限制性内切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和内切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000 个核苷酸对处切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

第II 类限制性内切酶只具有核酸内切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP 提供能量。

第III 类限制性内切酶也同时具有修饰活性和内切酶活性，具有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。

它在识别顺序旁边24-26 个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。

其中II 类酶在基因重组中最有应用价值。

因此以下内容均以II 类限制性内切酶为主。

1．限制性内切酶的命名和书写限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。

现在通用的命名原则是：第一个字母是细菌属名的第一个字母，第二、三个字母是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字书写；如果同一生物种内又分为不同的血清型和菌株，其菌株名称的第一个字母，用正体字书写，并放在限制酶名称的第三个字母后面。

比如限制酶HincⅡ和HindⅢ 则是分别来自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的c 和d 血清型菌株。

如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表，如表2.1 所示。

2．限制性内切酶的特点：①识别特定的核苷酸序列：长度一般为4~6bp 并具有回文结构的顺序（palindromes，一段自我互补的DNA 顺序，即上下链从5’→3’方向所读的顺序完全一样）。

例如：②具有特定的酶切位点：即在识别序列的特定位点对双链DNA 进行切割，由此产生特定的酶切末端。

通常双链DNA 被酶切后可出现三种形式的末端：5’突出的粘末端；3’突出的粘末端；平末端。

③由两种酶分子组成的二元系统：一种是限制性内切酶，另一种是甲基化酶，二者识别位点相同，但后者不是切割，而是对识别序列中的一个碱基进行甲基化修饰，该甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用，使之不受对应的限制性内切酶的切割。

对于原核生物来说，甲基化酶对其自身DNA 序列进行甲基化，使其免受限制性酶的作用，因此甲基化酶是细菌体内的一种保护机制。

换言之，正是由于限制性内切酶与甲基化酶，组成了原核生物的一个完整的免疫系统。

例如，限制酶BamH I 和BglⅡ都能识别各自的6 核苷酸序列，且切点都在同一位置，依次为GGATCC 和AGATCT，因此产生的DNA 片段都产生一个相同的单键5’端突出 (突出序列是GATC)。

当这些酶作用DNA 分子后，它们都能相互连接，但是新形成的DNA 分子将同时失去这两种酶的识别序列。

如：通常，不同的限制酶具有不同的识别序列，但有些不同来源的酶能识别相同的序列，这些酶被称为同裂酶（isoschizomer），不过其中有些酶具有相同的切点，而有些酶的切点却并不相同，如Acc Ⅲ与BspEⅠ、BseAⅠ、B siMⅠ、Bsp 131、Kpn21、MroⅠ识别序列都是TCCGGA,t 它们的切点都在T 和C 之间，即T/CCGGA；但BbeⅠ与KasⅠ、NarⅠ、SfoⅠ识别序列都是GGCGCC，但它们的切点分别为GGCGC/C、G/GCGCC、GG/CGCC、GGC/GCC。

现在已从各种微生物中发现三千余种限制酶，它们识别序列的长度最短的是4 个核苷酸，最长的为8 个核苷酸。

基因克隆过程中使用频率最高的是识别6 个核苷酸的限制酶。

这是因为由4个核苷酸组成的识别序列在DNA分子中出现的频率很高，如果按完全随机分布的原则，每44＝256个核苷酸可出现一个相同的4 核苷酸识别序列。

如果是由6 个核苷酸序列组成的限制酶识别位点，那么就应该有46＝4096 bp才可能出现一次。

识别8 个核苷酸的限制酶识别位点就应该有48＝65,536 bp才重复一次。

因此，在一个DNA分子中，识别4 个核苷酸的限制酶位点太多，识别8 核苷酸的限制酶位点又太少。

换句话说，识别4 核苷酸的限制酶将DNA切得太短，识别8 个核苷酸的限制酶将DNA切得太长，而识别6 个核苷酸的限制酶则比较适中，切下的DNA片段平均长4.1 kb左右。

除此之外，片段过长或过短，从技术角度讲，操作起来也不太方便。

实际上，任何一种生物基因组的DNA 分子中的核苷酸分布并不是完全随机的。

也就是不同物种的基因组DNA 中，所含的限制性内切酶位点的种类和数量各不相同。

也正由于此，可以通过绘制限制性内切酶图谱来描述某一个物种的基因组特征，即物理图谱。

应用限制性内切酶注意事项：酶单位（U）的定义：在50μl 反应液中, 37℃保温1h, 使1μg 的特定DNA 完全分解所需的酶量为1 个活性单位。

由于酶的活性与其所处的反应条件有很大的关系，因此在使用限制性内切酶需注意：①反应条件：每种酶所需的最适条件各不相同，包括：温度、不同的离子浓度、pH、还原剂等，因此为了保证酶处于最佳反应条件，每种酶必须备有配套的缓冲系统（buffer）。

②DNA 的纯度是影响反应效率的主要因素，杂质包括：蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、以及高浓度的盐离子。

降低污染的办法：适当增加酶的用量、扩大反应体积（通过稀释降低污染物的浓度），或延长反应时间。

③注意甘油的浓度(酶储液)，所提供的缓冲液均为10 倍浓缩液，目的是保证稀释的酶保存液中甘油的浓度不会超过5 %。

但较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响，因此酶切反应体系不宜在体积过小（如小于20μl）范围中进行。

④注意反应液的充分混合，但不可振荡。

反应液充分混合是为了保证反应完全，推荐用取液器反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心即可。

上述只是一些基本原则，实际操作中需要综合考虑。

一些大的试剂公司均会提供各种限制性内切酶的详细资料。

特别强调的是，并不是酶量越多越好，反应时间越长越好，因为限制性内切酶都有Star 活性，即发生非特异性的反应（所谓Star activity，是在一些特定的条件下，酶对底物DNA 的特异性可能降低，以致在识别序列以外的位点进行切割。

在甘油含量高、酶量大，有机溶剂以及盐浓度低时容易发生）；同时酶在保温过程中，活性也会发生变化。

为了能够正确的利用限制性内切酶，应该注意阅读产品说明书以及相关的介绍。

例如：各种限制性内切酶在保温过程中的活性变化表；双酶切反应时的通用缓冲液使用表；不同缓冲液中各种限制性内切酶的活性变化表等等。

另外需要注意的是，不同公司产品的酶和缓冲液不要混用。

（见附录四－1，常用限制性内切酶表）在多数情况下，同一种限制性内切酶所产生的DNA 双链末端结构总是相同的，因而用同一种限制性内切酶酶切同一个或两个不同来源的DNA 分子所产生的末端都可以相互配对，在DNA连接酶的作用下，3’和5’末端重新形成磷酸二酯键，而成为一个重组的DNA 分子。

由于这些限制性内切酶的识别序列都是对称的，因而两个DNA 片段可以从两个不同的方向连接起来。

这种外源DNA 片段的插入没有一定的方向，这对插入片段的方向并不显得重要时适用，如在构建基因文库时。

然而在研究基因表达时，考虑外源DNA 的插入方向则是十分重要的，需要采取不同的方式进行控制，以达到定向连接的目的。

虽然不同种的限制性内切酶产生的DNA 双链末端结构在大多数情况下是不相同的，但有些不同种限制性内切酶产生的末端却是相同的，即具有相同类型的突出末端(都是5’端或3’端突出)，突出的核苷酸数目相等且序列也相同，因而可以互相连接起来。

这种由不同种的限制酶产生的能相互连接的末端常称之为相容性末端，这些酶则称之为同尾酶（isocaudamer）。

比如，在SV40 ( Simian vacuolating virus，猿猴空泡病毒)的DNA 分子中 (基因组长为5,243 bp)仅有一个Hpa II 位点 (识别序列为C↓CGG)，而Tha I 位点 (识别序列为CG↓CG) 则根本没有。

但是，在大小相似的原核生物DNA 分子中，如最常见的大肠杆菌质粒载体pBR322 (总长4,363 bp)则有26 个Hpa II 位点和23 个Tha I 位点。

在一个含有75% AT 和25% GC 的DNA 分子中，长达262,144 bp 中只有一个Sma I 位点 (识别序CCC↓GGG)。