医学免疫学检验-细胞因子测定及应用PPT课件
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第一课件网网站
2020年10月2日
1
第一节 细胞因子检测概述
一、细胞因子的类型与作用特点 二、细胞因子检测的特点与方法
2020年10月2日
2
细胞因子
由非神经—内分泌细胞产 生的一大类与免疫应答活动 密切相关的低分子蛋白与多 肽。
2020年10月2日
3
细胞因子的类型与作用特点
1、细胞因子的分类 2、细胞因子的作用特点
难以标准化和自动化 ➢细胞代谢活性测定方法
3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比 色法 ➢细胞代谢产物测定法
代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表 面标记或可溶性分子测定法
2020年10月2日
28
(1) 放射性核素掺入法
通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方 法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对 核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（ 3H/125I ），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增 殖的程度。
干扰因素 IL-2、IL-4 IL-4
IL-4
GN-CSF、IL-5
IL-6、EPO
IL-2
IL-4
24
第一课件网网站
各类细胞因子检测的常用靶细胞
细胞因子 IL-6
IL-7 IL-8 GM-CSF
TNF/ IFN
2020年10月2日
实验系统
干扰因素
B9（M）增殖法
IL-4、IL-11
BM60（H）增殖法
30
生物学活性测定方法学评价
敏感性较高 特异性不高 操作繁琐 易受干扰
2020年10月2日
31
细胞因子的免疫学检测
分泌型细胞因子的检测 细胞内细胞因子的检测
2020年10月2日
32
ELISA
特异、简便 易于推广和标准化等优点 可同时检测大量标本且试验废弃物便于处 理 细胞因子测定的首选方法
敏感性偏低
2020年10月2日
20
细胞
趋化因子
滤膜：计数受趋化细胞
趋化试验原理示意
2020年10月2日
21
检测中的操作注意要点
靶细胞的选择与培养
检测标本的制备
显示检测结果
2020年10月2日
22
靶细胞的选择与培养
1、对所测的细胞因子有特异的敏感性
2、易培养、保存、生物学特性稳定
3、有良好的生长状态
4、种属适配
结果客观易于自动化； 适用于大标本量的测定
2020年10月2日
方法的特异性受依赖细 胞株影响；放射性污染
29
(2) MTT 比色法
特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关
与同位素掺入法相比
测定步骤类似
2020年10月2日
掺入物：MTT而非3H-TdR； 反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同
2020年10月2日
17
第二节 细胞因子检测的方法与原理
一、细胞因子的细胞生物学检测
二、细胞因子的免疫学检测
三、细胞因子的分子生物学检测
2020年10月2日
18
细胞因子的细胞生物学检测
1、检测方法与原理 2、检测中的操作注意要点
2020年10月2日
19
检测方法与原理
细胞增殖或增殖抑制试验 细胞病变抑制试验 细胞毒试验 细胞趋化试验
2020年10月2日
7
细胞因子检测的特点与方法
1、检测的特点 2、检测的方法
2020年10月2日
15
细胞因子检测的特点
免疫原性较弱 样品含量低 样品具有时效性 生物效应特异性差
2020年10月2日
16
细胞因子检测的方法
免疫学检测方法——抗原性检测
细胞生物学检测方法——生物活性检测
分子生物学检测方法——基因表达检测
不能判断细胞因子的生物学活性。
2020年10月2日
33
ELISPOT
2020年10月2日
34
酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)
在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加 基 入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无 本 刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因
原 子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续 理 的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验
2020年10月2日
23
各类细胞因子检测的常用靶细胞
细胞因子 IL-1
IL-2 IL-3
实验系统 D10（M）增殖法 EL-4（M）增殖法 A352（H）增殖抑制法 CTLL（M）增殖法 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法
IL-4 IL2-0520年10月2日
CTLL（M）增殖法 BCL-1（M）增殖法
2020年10月2日
5
各
类
细
胞
因
子
间
关
CSFs
系
Chemokines
ILs IFNs TNFs TGFs
2020年10月2日
6
1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性 2、多源与同源性 3、高效性 4、多效性（pleiotropy） 5、丰余性（redundancy） 6、协同性 7、拮抗性 8、网络性
2020年10月2日
26
显示检测结果
1、细胞增殖状态的显示： 放射性核素掺入法、 胞内酶活性显示法 活细胞染色法 细胞荧光测定法
2、细胞毒或细胞病变状态的显示
活细胞染色法
胞内酶活性显示法
DNA断片测定法
2020年10月2日
27
细胞增殖检测方法分类
➢直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、
2020年10月2日
4
以生物学作用进行划分的分类
白细胞介素（Interleukin）—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素（Interferon）—— IFN-、IFN-、IFN- 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）—— TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor）—— M-CSF、G-CSF 转化生长因子（Transforming growth factor）—— TGF- 趋化因子（Chemokine）—— IL-8、GROs、MCP-1 生长因子（Growth factor）—— EGF、FGF、IGF、PDGF
的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。
Clone-IXN/2b（M）增殖法
中性粒细胞（M、H）趋化法
TF-1（H）增殖法
IL-3、IL-5
IL-6、IL-5
L929 （M、H）细胞毒法
wish（H）病变保护法
IFN- 、 IFN-
L92wenku.baidu.com（M）病变保护法
IFN- 、 IFN2-5
检测标本的准备
1、分离特定的产生细胞 2、对产生细胞进行诱导、激活 3、选择适当的收集时间
2020年10月2日
1
第一节 细胞因子检测概述
一、细胞因子的类型与作用特点 二、细胞因子检测的特点与方法
2020年10月2日
2
细胞因子
由非神经—内分泌细胞产 生的一大类与免疫应答活动 密切相关的低分子蛋白与多 肽。
2020年10月2日
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细胞因子的类型与作用特点
1、细胞因子的分类 2、细胞因子的作用特点
难以标准化和自动化 ➢细胞代谢活性测定方法
3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比 色法 ➢细胞代谢产物测定法
代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表 面标记或可溶性分子测定法
2020年10月2日
28
(1) 放射性核素掺入法
通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方 法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对 核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（ 3H/125I ），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增 殖的程度。
干扰因素 IL-2、IL-4 IL-4
IL-4
GN-CSF、IL-5
IL-6、EPO
IL-2
IL-4
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各类细胞因子检测的常用靶细胞
细胞因子 IL-6
IL-7 IL-8 GM-CSF
TNF/ IFN
2020年10月2日
实验系统
干扰因素
B9（M）增殖法
IL-4、IL-11
BM60（H）增殖法
30
生物学活性测定方法学评价
敏感性较高 特异性不高 操作繁琐 易受干扰
2020年10月2日
31
细胞因子的免疫学检测
分泌型细胞因子的检测 细胞内细胞因子的检测
2020年10月2日
32
ELISA
特异、简便 易于推广和标准化等优点 可同时检测大量标本且试验废弃物便于处 理 细胞因子测定的首选方法
敏感性偏低
2020年10月2日
20
细胞
趋化因子
滤膜：计数受趋化细胞
趋化试验原理示意
2020年10月2日
21
检测中的操作注意要点
靶细胞的选择与培养
检测标本的制备
显示检测结果
2020年10月2日
22
靶细胞的选择与培养
1、对所测的细胞因子有特异的敏感性
2、易培养、保存、生物学特性稳定
3、有良好的生长状态
4、种属适配
结果客观易于自动化； 适用于大标本量的测定
2020年10月2日
方法的特异性受依赖细 胞株影响；放射性污染
29
(2) MTT 比色法
特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关
与同位素掺入法相比
测定步骤类似
2020年10月2日
掺入物：MTT而非3H-TdR； 反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同
2020年10月2日
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第二节 细胞因子检测的方法与原理
一、细胞因子的细胞生物学检测
二、细胞因子的免疫学检测
三、细胞因子的分子生物学检测
2020年10月2日
18
细胞因子的细胞生物学检测
1、检测方法与原理 2、检测中的操作注意要点
2020年10月2日
19
检测方法与原理
细胞增殖或增殖抑制试验 细胞病变抑制试验 细胞毒试验 细胞趋化试验
2020年10月2日
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细胞因子检测的特点与方法
1、检测的特点 2、检测的方法
2020年10月2日
15
细胞因子检测的特点
免疫原性较弱 样品含量低 样品具有时效性 生物效应特异性差
2020年10月2日
16
细胞因子检测的方法
免疫学检测方法——抗原性检测
细胞生物学检测方法——生物活性检测
分子生物学检测方法——基因表达检测
不能判断细胞因子的生物学活性。
2020年10月2日
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ELISPOT
2020年10月2日
34
酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)
在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加 基 入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无 本 刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因
原 子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续 理 的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验
2020年10月2日
23
各类细胞因子检测的常用靶细胞
细胞因子 IL-1
IL-2 IL-3
实验系统 D10（M）增殖法 EL-4（M）增殖法 A352（H）增殖抑制法 CTLL（M）增殖法 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法
IL-4 IL2-0520年10月2日
CTLL（M）增殖法 BCL-1（M）增殖法
2020年10月2日
5
各
类
细
胞
因
子
间
关
CSFs
系
Chemokines
ILs IFNs TNFs TGFs
2020年10月2日
6
1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性 2、多源与同源性 3、高效性 4、多效性（pleiotropy） 5、丰余性（redundancy） 6、协同性 7、拮抗性 8、网络性
2020年10月2日
26
显示检测结果
1、细胞增殖状态的显示： 放射性核素掺入法、 胞内酶活性显示法 活细胞染色法 细胞荧光测定法
2、细胞毒或细胞病变状态的显示
活细胞染色法
胞内酶活性显示法
DNA断片测定法
2020年10月2日
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细胞增殖检测方法分类
➢直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、
2020年10月2日
4
以生物学作用进行划分的分类
白细胞介素（Interleukin）—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素（Interferon）—— IFN-、IFN-、IFN- 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）—— TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor）—— M-CSF、G-CSF 转化生长因子（Transforming growth factor）—— TGF- 趋化因子（Chemokine）—— IL-8、GROs、MCP-1 生长因子（Growth factor）—— EGF、FGF、IGF、PDGF
的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。
Clone-IXN/2b（M）增殖法
中性粒细胞（M、H）趋化法
TF-1（H）增殖法
IL-3、IL-5
IL-6、IL-5
L929 （M、H）细胞毒法
wish（H）病变保护法
IFN- 、 IFN-
L92wenku.baidu.com（M）病变保护法
IFN- 、 IFN2-5
检测标本的准备
1、分离特定的产生细胞 2、对产生细胞进行诱导、激活 3、选择适当的收集时间