等电聚焦原理

㈡引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移， 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移， 带有最低等电点的分子（荷最多的负电） 带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最 快地向阳极迁移。 快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置 时才停止。 时才停止。 其次一些低pI的载体两性电解质分子（ pI的载体两性电解质分子 其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷 其次多的负电）也将向阳极移动， 其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净 电荷被减少到零才停止。 电荷被减少到零才停止。
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis， Electrophoresis，IEFE
一、IEFE 一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的 一种利用具有pH梯度 梯度的
支持介质分离等电点不同 支持介质分离等电点不同的蛋白 等电点不同的蛋白 质的电泳技术。 质的电泳技术。
3.其它检测方法 3.其它检测方法
电泳转移 双相电泳 滴定曲线分析
蛋白质样品及分离容量
1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 电聚焦有高的分辨力， 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。 分的相对比例。 2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀， 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。 预先除去。 蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。 占据了分离的有效部位。
HbA 正常成人血中主要的Hb成分。 Hb成分 正常成人血中主要的Hb成分。 正常成人Hb中的一个次要成分， Hb中的一个次要成分 HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分，当 胎儿出生时，其浓度不到1% 1%， 胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多， 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.6%左右 左右， 2.2% 至2.6%左右，最高范围一般 不超过3.5% 3.5%。 不超过3.5%。
㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加pI 所有的载体两性电解质分子以增加pI 级数的办法将分别在阳、 级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它 们自己的位置而给出一个pI梯度。 pI梯度 们自己的位置而给出一个pI梯度。
电解槽中，通电后， 电解槽中，通电后，正负两极都会发生电 极反应： 极反应： 正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e正极端反应： 负极端反应： O+4 负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH在负极引起pH值的升高 在正极pH 值的升高， 在负极引起pH值的升高，在正极pH 下降， 下降，另外在电极槽的正极端放的是酸 性溶液， 性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了 在电极附近pH的急剧变化。（图 的急剧变化。（ 在电极附近pH的急剧变化。（图a）
参考书目
《蛋白质电泳实验技术》 蛋白质电泳实验技术》 科学出版社 郭尧君 《蛋白质技术手册》 蛋白质技术手册》 科学出版社 汪家政 范敏 主编 《电泳》 电泳》 科学出版社 何忠效 张树政 主编
实验 血红蛋白的等点聚焦电泳
[原理] 原理]
Hb具有四条多肽链和球蛋白 Hb具有四条多肽链和球蛋白 （ α 、 β 、 γ、 δ） HbA HbA2 HbF HbA3 α 2β 2 α 2δ 2 α 2γ 2 >95% 2-3% <2% pI 6.87 7.38 6.98 <6.87
3.pH梯度的形成 3.pH梯度的形成
载体两性电解质是一系列不同 分子的两性电解质的混合物, 分子的两性电解质的混合物,在通电 后 ， 它们各自迁移到适当位置形成 一个连续的pH梯度。 pH梯度 一个连续的pH梯度。
pH梯度形成的过程 pH梯度形成的过程
㈠没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电， 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是 溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等， 溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电 荷为零。 荷为零。
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响： 等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响： 1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质， 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量； 高分离容量； 容量与区带高度的平方成正比， 2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量， 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率 降低，聚焦时间长，用窄的pH pH梯度范围 降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。 可以使区带变宽，提高分辨率。 分离的容量与柱的横载面成正比， 3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。 可达一克。
用多种两性电解质 用多种 两性电解质 混合物建立稳定 两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度 良好的pH梯度
1.理想的载体两性电解质（ 1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes） ampholytes）应具备的特征：
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； 分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； 化学性质稳定； ②化学性质稳定； 各成分的pI 彼此接近 并在其pI 值附近有良好的 彼此接近， ③ 各成分的 pI彼此接近 ， 并在其 pI值附近有良好的 缓冲能力； 缓冲能力； pI处具有足够的电导 导电性均匀； 处具有足够的电导， ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； 两性电解质载体的数目要足够多； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； 可溶性好； ⑥可溶性好； 280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度 的紫外光没有或仅有很低的吸光度， ⑦ 对 280 nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度 ， 不 干扰样品的测定。 干扰样品的测定。
三、IEFE的基本原理 三、IEFE的基本原理
蛋白质分子在不同pH下的解离状态 蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P COOH P
NH3+ P COO-
NH2 COO-
pH＜ pH＜pI
pH＝ pH＝pI
pH＞ pH＞ pI
在电泳介质中放入载体两性电 解质，当通入直流电时， 解质，当通入直流电时，两性电解 质形成一个由正极到负极逐渐增加 pH梯度 正极附近是低pH 梯度， pH区 的pH梯度，正极附近是低pH区，负 极附近是高pH pH区 极附近是高pH区。
四、等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 分析分离制备蛋白质、 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 csf中寡克隆区带的检测 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 测定pI可鉴定蛋白质 可鉴定蛋白质、 3.双相电泳中，IEFE作为第一相 双相电泳中，IEFE作为第一相
2.载体两性电解质的合成 2.载体两性电解质的合成
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺 丙烯酸 多乙烯多胺
Ampholine（LKB） （ ）
本质：一系列 脂肪族多氨基多羧酸 同系物 脂肪族多氨基多羧酸同系物 本质 ： 一系列脂肪族多氨基多羧酸 和异构体， 和异构体 ， 具有很多既不相同又十分接 近相互连接的pI值 近相互连接的pI值。 pH范围 pH3 pH范围：pH3~10 范围：
进行IEFE必须具备3 进行IEFE必须具备3个条件：
① 有一个在电泳条件下基本稳定 、 重复 有一个在电泳条件下基本稳定、 性良好的pH梯度 性良好的pH梯度 有一个抗对流的电泳材料， ② 有一个抗对流的电泳材料 ， 使已经分 离的样品不再重新混合 ③ 电泳后有适当的方法来鉴定分离的区 带
（一）pH梯度的建立 （一）pH梯度的建立
蛋白质分子的电聚焦过程
+ pH=pI a
a. b. c.
+
pI1 pI2 pI3 pIn
—
b
c
蛋白质分子在负极端 蛋白质分子在正极端 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
在这个从正极到负极pH 在这个从正极到负极 pH 逐渐增加的 pH逐渐增加的 直流电场中， 当蛋白质进入这个环境， 直流电场中 ， 当蛋白质进入这个环境 ， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 向着一定方向移动， 荷 ， 向着一定方向移动 ， 迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来， 同的等电点位置上停留下来 ， 即被聚焦 得以分离。 于一个狭的区带中 ，得以分离。
各种蛋白质各自都有一个等电点, 各种蛋白质各自都有一个等电点,在 一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性, pH环境中 一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性, 在电场中不会迁移。 在电场中不会迁移。 等电聚焦就是在电泳介质中放入 等电聚焦就是在电泳介质中放入载 体两性电解质，当通以直流电时，两性 当通以直流电时， 电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增 电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增 加的pH梯度，在此体系中， pH梯度 加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白 质即移动到或聚焦于其相当的等电点位 置上， 置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带 中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚 焦电泳。 焦电泳。
pH
+
-
d
pH梯度的选择 pH梯度的选择 在测定未知蛋白时， 在测定未知蛋白时，可先采用 pH3-10的载体 的载体， pH3-10的载体，经初步测定后改用 较窄的以提高分辨率。 较窄的以提高分辨率。
（二）支持介质的选择
作用：防止扩散 作用： 抗对流 1.液体介质：蔗糖、Ficoll 液体介质：蔗糖、 2.凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、PAG 凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 要求用无盐溶液， 白质可能发生沉淀。 白质可能发生沉淀。 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 样品中的成分必须停留在其pI， pI不溶或发生变性的蛋白质 不溶或发生变性的蛋白质。 在pI不溶或发生变性的蛋白质。
分辨率较不连续PAGE更高， 分辨率较不连续PAGE更高，特 PAGE更高 别适合于分离分子量相同而电荷不 同的生物大分子。 同的生物大分子。
pH
+
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同 分子的两性电解质的混合物所组成的， 分子的两性电解质的混合物所组成的 ， 设其中某一成分为A 它的pI=pH’ 设其中某一成分为 A， 它的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’ 它带负电荷， 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。 极移动。(图b)
（三）聚焦后的检测方法
1.各种染色法 1.各种染色法
考马斯亮蓝染色 银染色 同工酶染色 专一蛋白染色 荧光标记以及免疫方法
2.扫描与定量 2.扫描与定量
激光光源强度大、 单色性好， 激光光源强度大 、 单色性好 ， 所以 IEFE谱带的扫描最合适 谱带的扫描最合适。 对IEFE谱带的扫描最合适。 注意： 注意：操作程序和条件必须严格相同
pH
pH=pH’ A+ +
-
c
同样载体两性电解质中各种两性电解 质也会各自迁移到它们的等电点处， 质也会各自迁移到它们的等电点处 ， 由于 它们的数量足够多， 它们的数量足够多 ， 各自的等电点相差很 从而形成一个pH梯度 梯度。 小，从而形成一个pH梯度。（图d）
假设在一个系统中含有极多的 有适当的等电点和它的等电点处有 一定的缓冲能力的两性电解质， 一定的缓冲能力的两性电解质，因 此形成的pH pH梯度将是连续平滑的 此形成的pH梯度将是连续平滑的。
pH
ApH=pH’
Βιβλιοθήκη Baidu
+
-
b
当环境pH<pH’ 当环境 pH<pH’ 时 ， 它带正电荷 ， 朝 它带正电荷， 负极移动， 直至移动到它的等电点处， 负极移动 ， 直至移动到它的等电点处 ， 在 那里聚集。由于两性电解质A在它的pI处具 那里聚集。由于两性电解质A在它的pI处具 有一定的缓冲能力， 有一定的缓冲能力 ， 因此在它附近形成一 pH稳定区域 稳定区域。 个pH稳定区域。（图c）
二、IEFE的 二、IEFE的特点
（一）优点
1 . 分辨率高 （ 精密度可达 0 . 01 pH单位 ） ， 分辨率高（ 精密度可达0 01pH 单位 pH 单位） 灵敏度高（最低检出量达0 ng） 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。 2.电泳区带相当狭窄。 电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。 重复性好。