代谢指纹分析及其在微生物研究中的应用
代谢指纹分析及其在微生物研究中的应用
摘要：代谢指纹分析是新兴的代谢组学的主要研究方法之一，本文综述了代谢指纹分析的研究方法及其在微生物领域的研究应用进展。
关键词：代谢组学；代谢指纹分析；微生物
代谢组学是20世纪90年代中期发展起来的一门对生物体或细胞等所有小相
对分子质量代谢产物进行定量和定性分析的新技术。这门新兴的学科凭借其整体论优势在最近几年得到了迅速的发展，广泛地应用到了功能基因组学、生物医学、微生物学等领域。
1.代谢组学简介
代谢组学（Metabonomics或Mmetabolomics）是通过考察生物体系受刺激或扰动后(某个特定的基因变异或环境变化)其代谢产物的变化或随时间的变化，是研究生物体系代谢途径的新技术[1]。Nicholson最初给出的定义是：定量测量生物体因病理生理刺激或基因改变引起的代谢应答变化[2]，系统性的代谢组学概念应将机体的代谢过程与微生物代谢以及外源环境因子的相互作用因素综合起来[3]。研究过程中，逐步提出了一些相关概念，如代谢物靶目标分析(Metabolite target analysis)、代谢轮廓(谱)分析(Metabolic profiling analysis)和代谢指纹分析(Metabolic fingerprinting analysis)等。
2.代谢指纹分析的产生及原理
20世纪80年代初，美国BIOLOG公司开发了一种新的微生物鉴定方法-代谢指纹法，并将其应用于微生物的自动化检测。其原理是根据细菌对碳源（或氮源）利用的差异来区别和鉴定细菌，不同的细菌会利用不同碳源（或氮源）进入新陈代谢过程（称为呼吸），而对其他一些碳源（或氮源）则无法利用，将每种细菌能利用和不能利用的一系列碳源（或氮源）进行排列组合，就构成了该种细菌特定的代谢指纹，由于细菌在利用碳源进行呼吸时，会发生一系列的氧化-还原反应，产生电子，TTC（四唑紫，2,3,5-TriphenylTetrazoliumChloride）在呼收电子后，会由无色的氧化型转变为紫色的还原型，通过肉眼观察或计算机控制的读数仪，将反应结果同数据库中的指纹进行比对，从而得到细菌的鉴定结果。
3.代谢指纹分析技术研究进展
代谢指纹分析系整体性地定性分析样品，比较图谱的差异快速鉴别和分类，而不分析或测量具体组分[4]。
3.1核磁共振技术
核磁共振(NuclearMagnetic Resonance, 简称NMR)分析技术是利用物理原理, 通过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分子结构与性质。它不破坏被
测样品的内部结构, 是一种无损检测方法[5]。20世纪60年代, 核磁共振技术开始应用于代谢研究。最初, 这类研究主要集中在医学领域。直到20世纪70年代, 核磁共振技术才开始应用于微生物代谢研究。利用高分辨率NMR技术对细胞内许多微量代谢组分进行检测, 可得到相应的生物体代谢物信息, 研究这些组分NMR的图谱, 综合分析这些信息所反映的生物学意义, 可以了解生物体代谢的
规律[6]。
代谢组学中NMR方法的特点如下：(1)不破坏样品的结构和性质，无辐射损伤，(2)可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件，在接近生理条件下进行实验。(3)可研究化学交换、扩散及内部运动等动力学过程，给出极其丰富的有关动态特性的信息；(4)可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样，(5)无偏向性，对所有化合物的灵敏度是一样的。
1H-NMR的化学位移范围只有10ppm，因此在3～5 ppm和6～8 ppm处有大量的氨基酸存在，图谱上可能出现上百个化合物的峰。这些峰相互重叠、干扰，造成图谱解析困难，生物标物(biomarker)常受到与测定不相关物质的干扰，使NMR 难以发挥作用。高分辨核磁共振(high-resolution NMR)则成为强有力的武器。高分辨核磁共振仪具有较好的灵敏度，信号分散，图谱容易解析，可检测的核素有1H，13C，15N，19F，23N a，31P和39K等。新发展的高分辨魔角旋转(HR-MAS)、活体磁共振波谱(MRS)和磁共振成像(MRI)等技术能无创、整体、快速地获得机体某一指定活体部位的NMR谱，直接鉴别和解析其中的化学成分。1H-NMR和LC ／NMR成为代谢组学研究领域的最主要分析技术之一。
3.2 质谱技术
由于代谢组学关心的是Mt 3.3色谱技术 色谱技术是几十年来分析化学中最富活力的领域之一[9]。作为一种物理化学分离分析的方法，色谱技术是从混合物中分离组分的重要方法之一，能够分离物化陛能差别很小的化合物。色谱技术最初仅仅是作为一种分离手段，直到2O 世纪5O年代，随着生物技术的迅猛发展，人们才开始把这种分离手段与检测系 统连接起来，成为在环境、生化药物、精细化工产品分析等生命科学和制备化学领域中广泛应用的物质分离分析的一种重要手段。 全二维气相色谱(GC×GC)是将分离机制不同且又相互独立的2根色谱柱以 串联方式连接在一起。2根色谱柱之间装有1个起捕集再传送作用的调制器，将第1柱分离的组分由调制器聚集后以脉冲方式进入第2柱进一步分离，所有组分从第2根色谱柱进入检测器。GC×GC与GC相比具有高分辨率、高灵敏度、高峰容量等优点。袁凯龙等[10]建立了一种基于有机酸的SPME(自动固相微萃取)／GC×GC—FID指纹图谱分析方法，通过固相微提取，再行GC×GC—FID分析，比较了GC XGC和GC的分离能力，证明GC×GC可用于微生物的代谢指纹图。 3.4分析技术联用 通过包括色谱(GC、LC)或毛细管电泳(CE)在内的多维分离技术，以及不同测定技术的联用可做到分析平台的优势互补。此外，采用二维核磁共振(2D-NMR)可减弱复杂生物样品中大分子信号的干扰，提高小分子物质的检测能力。随着NMR技术的发展，以前用于固体的魔角旋转(MAS)技术也移植到了液体领域，用来研究以前难以用液体NMR研究的样品，如器官组织样品。利用MAS-NMR 技术可以得到完整的组织样品高分辨谱图，扩展了代谢组学研究的样品范围，同时可以更全面深入地研究一个系统。 4.代谢指纹分析在微生物研究中的应用 代谢指纹分析检测方法操作简单并易获得微生物的生物化学信息，加上快速的自动分析鉴定系统，使其在微生物领域中有很好的应用前景。Ishii 等[11]对计算机模拟的微生物的细胞模型进行了大规模的代谢组学研究，描述了微生物有组织的、无组织的、静止的、动态的等等数学模型，建立生化仿真平台对未知样本进行预测分析并开展代谢仿真等研究工作。 BIOLOG公司的基于代谢指纹法原理的细菌鉴定系统，在全球拥有二十多项专利，该系统在在96孔板条上实现95个反应，大大提高了鉴定的准确率，代谢指纹技术的运用，使该系统与传统的酸碱或细菌的生长反应相比。细菌鉴定的范围更为广泛。目前，BIOLOG的微生物鉴定系统不仅能够鉴定常见的肠杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、嗜血杆菌、厌氧菌、酵母样真菌、丝状真菌等近2000种微生物，几乎覆盖了所有重要的人体、动植物微生物和大部分环境微生物。 准确的代谢路径分析，需对酶进行活性化学反应计量法、生物信息法等全面测定[12]。Fiaux等用13C 标记的和未标记的葡萄糖混合物观察大肠杆菌的微需氧代谢时发现，丙酮酸盐的C1～C2 链断裂、特征性丁酮二酸盐（通过磷酸烯醇丙酮酸盐羧化作用生成）和甲酸盐形成，证实了需氧菌的代谢活动与厌氧和需氧菌明显不同。Boersma等通过19F- NMR 发现了微生物中氟苯异苯酚和羟基苯的代 谢路径，并推测该路径可能与代谢型的表达相联系。Wendisch等用代谢流分析技术结合核素标记方法，分析谷氨酸棒状杆菌的中心代谢路径，建立其代谢网络模型和预测模型。Mogens等对乳酸菌的核苷酸代谢及其调控机制进行了研究，旨在提供乳酸菌代谢的生理学和遗传学概貌。 5.代谢指纹分析的发展方向 目前，代谢指纹分析正处于快速发展阶段，日益成为研究的热点。随着研究的深入，代谢指纹分析必将在微生物领域中发挥更大的作用，帮助人们更深地了解微生物生态系中各种复杂的相互作用，微生物细胞对环境和基因变化的响应，为人们提供一个了解微生物表型的独特途径。高通量、高分辨率的分析技术与生物信息学相整合，对微生物代谢层面进行研究，提供了解微生物体的独特视角。 此外，代谢组学分析系统的硬件、软件技术将进一步提高，朝着整合化、自动化和高通量方向发展，使之以更快的速度对代谢指纹分析更大的部分实现自动分析和可视化。利用代谢组学分析技术对用放射性核素标记的底物进行代谢产物流分析，将成为研究有关代谢产物生物合成或分解途径中的关键步骤及其基因调控机制的有效方法。 参考文献 [1]Nicholson J K, Connelly J, Lindon J C, et a1. 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A. 光合作用 B. 发酵 C. 呼吸 答:( ) 50782.50782.________是合成核酸的主体物。 A. 5----D 核糖 B. 5----D 木酮糖 C. 5----D 甘油醛 答:( ) 50783.50783.ATP 含有： A. 一个高能磷酸键 B. 二个高能磷酸键 C. 三个高能磷酸键 答:( ) 50784.50784.自然界中的大多数微生物是靠_________ 产能。 A. 发酵 B. 呼吸 C. 光合磷酸化 答:( ) 50785.50785.酶是一种__________ 的蛋白质 A. 多功能 B. 有催化活性 C. 结构复杂 答:( ) 50786.50786.在原核微生物细胞中单糖主要靠__________ 途径降解生成丙酮酸。 A. EMP B. HMP C. ED 答:( ) 50787.50787.参与脂肪酸生物合成的高能化合物是__________。 A.乙酰CoA B. GTP C. UTP 答:( ) 50788.50788.Pseudomonas是靠__________ 产能。 A. 光合磷酸化 B. 发酵 C. 呼吸 答:( ) 50789.50789.在下列微生物中__________ 能进行产氧的光合作用。 A. 链霉菌 B. 蓝细菌 C. 紫硫细菌 答: ( ) 50790.50790.合成环式氨基酸所需的赤藓糖来自__________。 代谢工程 科技名词定义 中文名称：代谢工程 英文名称：metabolic engineering 定义：通过基因工程的方法改变细胞的代谢途径。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；新陈代谢（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 代谢工程书籍图 代谢工程（Metabolic engineering）是生物工程的一个新的分支。代谢工程把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来，以上述“分析——综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。 目录 发展前沿 展开 编辑本段发展 为了满足人类对生物的特定需求而对微生物进行代谢途径操作，已有将近半个世纪的历史了。在氨基酸、抗生素、溶剂和维生素的发酵法生产中，都可以找到一些典型实例。操作的主要方法是，用化学诱变剂处理微生物，并用创造性的筛选技术来检出已获得优良性状的突变菌株。尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好的效果，但对突变株的遗传和代谢性状的鉴定是很不够的，更何况诱变是随机的，科学不足技巧补！ DNA重组的分子生物学技术的开发把代谢操作引进了一个新的层面。遗传工程使我们有可能对代谢途径的指定酶反应进行精确的修饰，因此，有可能构建精心设计的遗传背景。DNA重组技术刚进入可行阶段不久，就出现了不少可用来说明这种技术在定向的途径修饰方面的潜在应用的术语。如分子育种（1981年），体外进化（1988年），微生物工程或代谢途径工程（1988~1991年），细胞工程（1991年）和代谢工程（1991年）。尽管不同的作者提出不完全相同的定义，这些定义均传达了与代谢工程的总目标和手段相似的含义。 我们曾经把代谢工程定义为，代谢工程就是用DNA重组技术修饰特定的生化反应或引进新的生化反应，直接改善产物的形成和细胞的性能的学科。这样定义代谢工程强调了代谢工程工作目标的确切性。也就是说，先要找到要进行修饰或要引进的目标生化反应，一旦找准了目标，就用已建立的分子生物学技术去扩增、去抑制或删除、去传递相应的基因或酶，或者解除对相应的基因或酶调节，而广义的DNA重组只是常规地应用于不同步骤中，以便于达到这些目标。 编辑本段优势与研究方向 优势 尽管在所有的菌种改良方案中都有某种定向的含义，但与随机诱变育种相比较，在代谢工程中工作计划的定向性更加集中更加有针对性。这定向性在酶的目标的选择，实验的设计，数据的分析上起着支配的作用。不能把细胞改良中的所谓“定向” 解释为合理的途径设计和修饰，因为“定向选择”与随机诱变之间没有直接关系。相反地我们可借助于“逆行的代谢工程”（reverse metabolic engineering）, 从随机诱变而获得的突变株及其性状的实验结果，来提取途径及其控制的判断信息（critical information）。 研究方向 1.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。 定义: 经过某些特定生化反应的修饰来定向改进细胞的特性功能, 运用重组DNA技术来创造新的化合物。 研究内容: 生物合成相关代谢调控和代谢网络理论; 代谢流的定量分析; 代谢网络的重新设计; 中心代谢作用机理及相关代谢分析; 基因操作。 研究手段: 代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。因此, 在研究方法和技术方面主要有下列三大常见手段: (1)检测技术: 常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究, 如物料平衡、同位素标记示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。 (2)分析技术: 采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法并结计算机技术, 阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理, 如稳态法、扰动法、组合法和代谢网络优化等。 (3) 基因操作技术: 在代谢工程中, 代谢网络的操作实质上能够归结为基因水平上的操作: 涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术, 如基因和基因簇的克隆、表示、调控, DNA 的杂交检测与序列分析, 外源DNA 的转化, 基因的体内同源重组与敲除, 整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。 2. 2.代谢改造思路和代谢设计原理。 代谢改造思路: 根据微生物的不同代谢特性, 常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。 (1)改变代谢途径的方法: 加速限速反应, 增加限速酶的表示量, 来提高产 物产率。改变分支代谢途径流向, 提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力, 使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势, 从而提高目的代谢产物的产量。 (2)扩展代谢途径的方法: 在宿主菌中克隆和表示特定外源基因, 从而延伸代谢途径, 以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 (3)转移或构建新的代谢途径: 经过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 代谢设计原理: 现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流: 增加限速酶编码基因的拷贝数; 强化关键基因的表示系统; 提高目标途径激活因子的合成速率; 灭活目标途径抑制因子的编码基因; 阻断与目标途径相竟争的代谢途径; 改变分支代谢途径流向; 构建代谢旁路; 改变能量代谢途径; 在现存途径中改变物流的性质: 利用酶对前体库分子结构的宽容性; 经过修饰酶分子以拓展底物识别范围; 在现存途径基础上扩展代谢途径: 在宿主菌中克隆、表示特定外源基因能够延伸代谢途径, 从而生产新的代谢产物、提高产率。 3. 微生物的基因操作技术有哪些? ( 举两例说明) 微生物的基因操作技术有: 核酸的凝胶电泳、核酸的分子杂交技术、DNA序列分析、基因的定点诱变、细菌的转化、利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究、PCR技术等。 基因定点突变(site-directed mutagenesis): 经过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列, 用于研究氨基酸残基对蛋白质的结构、催 目录 1绪论 (1) 1.1指纹识别技术的研究背景及意义 (1) 1.2指纹识别技术的国内外研究现状 (3) 1.3本文主要的研究内容和章节安排 (4) 1.3.1研究内容 (4) 1.3.2章节安排 (5) 2指纹图像预处理 (7) 2.1图像规格化 (7) 2.2方向图 (8) 2.2.1点方向图 (9) 2.2.2块方向图 (9) 2.3图像分割 (12) 2.3.1基于灰度分割算法 (12) 2.3.2基于方向图的分割算法 (13) 2.4Gabor滤波 (14) 2.5二值化 (18) 2.6图像细化 (21) 2.61快速并行细化算法 (21) 2.62改进的OPTA细化算法 (22) 2.63合成细化算法 (24) 3特征点提取及匹配 (26) 3.1特征点提取 (26) 3.1.1端点和分叉点的提取 (26) 3.1.2伪特征点的去除 (27) 3.1.3实验结果及其分析 (29) 3.2特征点匹配 (32) 3.2.1图像校准 (32) 3.2.2细节点的匹配 (35) 3.3本章小结 (38) 4指纹识别技术在PC端和Android端的实现 (39) 4.1指纹识别技术在PC端的实现 (39) 4.1.1指纹图像处理模块 (40) 4.1.2指纹匹配模块 (43) 4.2指纹识别技术在Android端的实现 (45) 4.2.1搭建开发环境 (46) 4.2.2Android指纹识别系统的架构设计和实现 (46) 4.2.3指纹匹配测试 (53) 4.3本章小结 (56) 5总结与展望 (57) 5.1总结 (57) 5.2展望 (58) 参考文献 (59) 致谢 (63) V 我国在微生物代谢领域的研究现状及展望 发表时间：2012-06-18T14:33:59.827Z 来源：《赤子》2012年第8期供稿作者：李夏 [导读] 微生物代谢是指微生物吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，包括有机物的降解和微生物的增殖。 李夏（四川化工职业技术学院，四川泸州 646005） 摘要：微生物代谢是指微生物吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，包括有机物的降解和微生物的增殖。在分解代谢中，有机物在微生物作用下，发生氧化、放热和酶降解过程，使结构复杂的大分子降解；合成代谢中，微生物利用营养物及分解代谢中释放的能量，发生还原吸热及酶的合成过程，使微生物生长增殖。文章主要介绍我国在微生物代谢领域的研究现状及对未来的展望，为我们呈现了一个广阔的微生物代谢世界。 关键词：微生物代谢；分解代谢；合成代谢；研究现 前言 微生物在生长过程中机体内的复杂代谢过程是互相协调和高度有序的，并对外界环境的改变能够迅速做出反应。其原则是经济合理地利用和合成所需要的各种物质和能量，使细胞处于平衡生长状态。在实际生产中，往往需要高浓度的积累某一种代谢产物，而这个浓度又常常超过细胞正常生长和代谢所需的范围。因此要达到超量积累这种产物，提高生产效率，必须打破微生物原有的代谢调控系统，在适当的条件下，让微生物建立新的代谢方式，高浓度的积累人们所期望的产物[1]。 1 我国微生物代谢的研究现状 1.1 利用微生物代谢生产酶 工业上，曾由植物、动物和微生物生产酶。微生物的酶可以用发酵技术大量生产，是其最大的优点。而且与植物或动物相比，改进微生物的生产能力也方便得多。微生物的酶主要应用于食品及其有关工业中。酶的生产是受到微生物本身严格控制。为改进酶的生产能力可以改变这些控制，如在培养基中加入诱导物和采用菌株的诱变和筛选技术，以消除反馈阻遏作用。 1.2 利用微生物代谢产生的代谢产物生产目的物 在微生物对数生长期中，所产生的产物，主要是供给细胞生长的物质，入氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等。这些产物称为初级代谢产物。利用发酵生产的许多初级代谢产物，具有重大的经济意义，我国现已可以根据微生物代谢调控的理论，通过改变发酵工艺条件如pH、温度、通气量、培养基组成和微生物遗传特性等，达到改变菌体代谢平衡，过量生产所需要产物的目的。 1.3 利用微生物代谢理论发展产生了代谢工程 代谢工程是指利用基因工程技术，定向的对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特征，并于微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。 1.4 改变微生物代谢途径生产目的物 改变代谢途径是指改变分支代谢的流向，阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目的产物的目的。改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应，改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法[1]。 1.5 利用微生物代谢进行发酵 数千年来由于科学技术进步缓慢，各种微生物工业也未能充分发展。直到20世纪中期才建立了一系列新的微生物工业。近几年来，由于微生物代谢工程的应用，发酵工业开始进入新的发展时期。发酵产品增长快、质量明显提高，在国民经济中起重要作用。 1.6 微生物代谢在环境方面的应用 微生物降解是环境中去除污染物的主要途径。深人了解污染物在微生物内的代谢途径，将有助于人们优化生物降解的条件，从而实现快速的生物修复。这些代谢中间体大都通过萃取、分析方法进行逐个研究，并借助专家经验拟合出代谢途径，其动力学过程亦很少触及。代谢组学方法的采用有可能改变这一现状[2]。 1.7 利用微生物代谢进行赖氨酸的生产 在许多微生物中，可用天冬氨酸作原料，通过分支代谢途径合成出赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。赖氨酸在人类和动物营养上是一种十分重要的必须氨基酸，因此，在食品、医药和畜牧业上需求量很大。但在代谢过程中，一方面由于赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制作用，另一方面，由于天冬氨酸除用于合成赖氨酸外，还要作为合成甲硫氨酸和苏氨酸的原料，因此，在正常细胞内，就难以累积较高浓度的赖氨酸。 为了解除正常的代谢调节以获得赖氨酸的高产菌株，工业上选育了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型菌株作为赖氨酸的发酵菌种。由于它不能合成高丝氨酸脱氢酶，故不能合成高丝氨酸，也不能产生苏氨酸和甲硫氨酸，在补给适量高丝氨酸的条件下，可在含较高糖浓度和铵盐的培养基上，产生大量的赖氨酸[3]。 1.8 微生物代谢与分子生物学方法的结合 随着遗传学、分子生物学等方法的不断发展，人们越来越多地将这些方法运用到微生物的研究工作中。一些野生菌的合成能力或分泌能力有限，目前可通过人工诱变或构建高效的基因工程菌株等方法对其进行改造以扩大应用范围此外，现在许多细菌合成拮抗物质的基因已被克隆测序，为使植物获得微生物所具有的特殊功能，一种可能的方法是通过基因工程将目的基因导入植物体内，使植物直接表达活性物质[4]。 2 展望 2.1 微生物代谢在医药行业的展望 微生物在代谢过程中可分泌蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等几十种胞外酶进入培养基，这些酶有的可以将药物成分分解转化，形成新的化合物，有的可水解植物细胞壁的纤维素、半纤维素、果胶质等，使细胞破裂，利于有效成分溶出。特别是采用一些酶作用于药用植物材料，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质降解，使细胞破裂，细胞间隙增加，减小细胞壁、细胞间物质传递屏障、对有效成分从胞内向胞外扩散的阻力减少，可促进有效成分的吸收提高。 2.2 微生物代谢在生理生化、微生物遗传育种方面的展望 随着分子生物学理论与技术的飞速发展，尤其是基因组和后基因组时代的到来，传统上的生理学与遗传学的交叉融合越来越多，许多 一．名词解释 1.巴氏消毒法： 2.致死温度： 3.同步生长： 4.生长限制因子 5.次生代谢物 6.温和噬菌体： 7.致死时间： 8.灭菌: 9.消毒与灭菌： 10．disinfection 消毒continuous culture 连续培养 11．纯培养： 二．填空 1．混菌法平板计数，在10-2稀释度的平板中平均有32个细菌菌落，每毫升原始牛奶中有个__________细菌. 2．__________是在10分钟内将悬液中的所有微生物都杀死的最低温度。 3．__________ 酶能消除超氧化物自由基的毒害。 4．厌氧菌可生长在__________的培养基中 5根据细菌的生长曲线可将细菌的生长分为__________，__________, _________和__________ 四个时期，作为研究材料应取__________时期细菌最合适。 6．氢离子浓度（pH）可影响到细胞质膜电荷和养料吸收，大多数细菌的最适生长pH值为__________ 。 7书写莫诺（Monod）经验公式：__________，其含义是表示______________ . 8巴氏消毒采取的条件为：___________。 9高压蒸汽灭菌采取的条件为：_____________________。 10设一种细菌在接种时的细胞浓度为100个/ml，经400min的培养，细胞浓度增至10亿个/ml，则该菌在该段时间内的G为__________ ；R为__________ ；n为__________ 。（注：1/lg2=3.322，整个培养过程都处于对数期） 11好氧的微生物需要较____________（高、低）的氧化还原电位。厌氧的微生物需要较_____________（高、低）的氧化还原电位。 12烘箱热空气灭菌法的操作条件是控制温度在__________ ，维持时间为__________ 。 高中生物竞赛 辅导讲义 第五章微生物的营养和培养基 营养（或营养作用，nutrition）是指生物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能。所以，营养为一切生命活动提供了必需的物质基础，它是一切生命活动的起点。有了营养，才可以进一步进行代谢、生长和繁殖，并可能为人们提供种种有益的代谢产物。 营养物（或营养，nutrient）则指具有营养功能的物质，在微生物学中，常常还包括光能这种非物质形式的能源在内。微生物的营养物可为它们正常生命活动提供结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 熟悉微生物的营养知识，是研究和利用微生物的必要基础，有了营养理论，就能更自觉和有目的地选用或设计符合微生物生理要求或有利于生产实践应用的培养基。 第一节微生物的六种营养要素 微生物的培养基配方犹如人们的菜谱，新的种类是层出不穷的。仅据1930年M．Levine等人在《培养基汇编》（ACompilationofCultureMedia）一书中收集的资料，就已达2500种。直至今天，其数目至少也有数万种。作为一个微生物学工作者，一定要在这浩如烟海的培养基配方中去寻找其中的要素亦即内在的本质，才能掌握微生物的营养规律。这正像人们努力探索宇宙的要素、物质的要素和色彩的要素等那样重要。 现在知道，不论从元素水平还是从营养要素的水平来看，微生物的营养与摄食型的动物（包括人类）和光合自养型的植物非常相似，它们之间存在着“营养上的统一性”（表5-1）。具体地说，微生物有六种营养要素，即碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。 一、碳源 凡能提供微生物营养所需的碳元素（碳架）的营养源，称为碳源（carbonsource）。如把微生物作为一个整体来看，其可利用的碳源范围即碳源谱是极广的，这可从表5-2中看到。 从碳源谱的大类来看，有有机碳源与无机碳源两大类，凡必须利用有机碳源的微生物，就是为数众多的异养微生物，凡能利用无机碳源的微生物，则是自养微生物（见本章第二节）。表5-2中已把碳源在元素水平上归为七种类型，其中第五类的“C”是假设的，至少目前还未发现单纯的碳元素也可作为微生物的碳源。从另外六类来看，说明微生物能利用的碳源类型大大超过了动物界或植物界所能利用的碳化合物。因而有人认为，任何高明的有机化学家，只要他将其新合成的产品投放到自然界，在那里早就有相应的能破坏、利用它的微生物在等待着了。据报道，至今人类已发现的有机物已超过700万种，由此可见，微生物的碳源谱该是多么广！ 微生物的碳源谱虽然很广，但对异养微生物来说，其最适碳源则是“C ?H?D”型。其中，糖类是最广泛利用的碳源，其次是醇类、有机酸类和脂类等。在糖类中，单糖胜于双糖和多糖，已糖胜于戊糖，葡萄糖、果糖胜于甘露糖、半乳糖；在多糖中，淀粉明显地优于纤维素或几丁质等纯多糖，纯多糖则优于琼脂等杂多糖和其他聚合物（如木质素）。 微生物的代谢及其调控 1微生物的代谢 微生物代谢包括微生物物质代谢和能量代谢。 1.1微生物物质代谢 微生物物质代谢是指发生在微生物活细胞中的各种分解代谢与合成代谢的总和。 1.1.1分解代谢 分解代谢是指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量。—般可将分解代谢分为TP。三个阶段：第一阶段是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质；第二阶段是将第一阶段产物进一步降解成更为简单的乙酰辅酶A、丙酮酸以及能进入三羧酸循环的某些中间产物，在这个阶段会产生一些ATP、NADH及FADH2；第三阶段是通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解生成CO2，并产生ATP、NADH 及FADH2。第二和第三阶段产生的ATP、NADH及FADH2通过电子传递链被氧化，可产生大量的ATP。 1.1.1.1大分子有机物的分解 （1）淀粉的分解 淀粉是许多种微生物用作碳源的原料。它是葡萄糖的多聚物，有直链淀粉和支链淀粉之分。一般天然淀粉中，直链淀粉约占20％，支链淀粉约占80％。直链淀粉为α一l、4糖苷键组成的直链分子；支链淀粉只是在支点处由α—1、6糖苷键连接而成。 微生物对淀粉的分解是由微生物分泌的淀粉酶催化进行的。淀粉酶是一类水解淀粉糖苷键酶的总称。它的种类很多，作用方式及产物也不尽相同，主要有液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶（包括β—淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶）。 以液化型淀粉酶为例，这种酶可以任意分解淀粉的。α-l、4糖苷键，而不能分解α-1、6糖苷键。淀粉经该酶作用以后，黏度很快下降，液化后变为糊精，最终产物为糊精、麦芽糖和少量葡萄糖。由于这种酶能使淀粉表现为液化，淀 Advances in Microbial Metabolic Engineering to Increase L-Threonine Production DONG Xunyan 1，2， WANG Xiaoyuan *1，2 （1.State Key Laboratory of Food Science and Technology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，China ；2.School of Biotechnology ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，China ） Abstract ：As an essential amino acid for mammals ，L-threonine has a wide application in the food ，feeds ，pharmaceutical and cosmetics industries.To date ，L-threonine is almost exclusively produced through microbial fermentation.Metabolic engineering provides an effective means to strain development and thus to enhancing the L-threonine production.In this article ，the pathway and regulation of L-threonine in the major industrial strains ，Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli are summarized ，and advances on metabolic engineering to increase L-threonine production are reviewed. Keywords ：L-threonine ，Corynebacterium glutamicum ，Escherichia coli ，metabolic engineering ，fermentation 摘要：L-苏氨酸作为一种必需氨基酸被广泛用于食品、饲料、医药及化妆品行业。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵法生产。代谢工程技术的应用为菌种选育开辟了有效途径，使在现有高产基础上进一步提高氨基酸的产量成为可能。作者对两大氨基酸生产菌——— 大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中的L-苏氨酸生物合成相关途径、代谢调控机理以及运用代谢工程技术提高L-苏氨酸产量所取得的成果进行了系统综述。 关键词：L-苏氨酸；谷氨酸棒杆菌；大肠杆菌；代谢工程；发酵中图分类号：Q 933 文献标志码：A 文章编号：1673—1689（2016）12—1233—08 微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展 董迅衍1，2，王小元*1，2 （1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122） 收稿日期：2016-07-08 基金项目：国家973计划项目（2012CB725202）；国家自然科学基金项目（NSFC31370131）；江南大学博士科研基金项目（JUDCF11025）。作者简介：董迅衍（1986—），女，江苏无锡人，发酵工程博士研究生，主要从事氨基酸生产菌株代谢工程方面的研究。 Email ：xunyandong@ *通信作者：王小元（1965—），男，山西垣曲人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事工业微生物代谢工程方面的研究。 E-mail ：xwang@ 微生物代谢工程 1.代谢控制发酵 代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使得目的产物大量的生成、积累的发酵。 代谢控制发酵的核心：解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。 2.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段 定义：应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。 研究内容： (1)代谢流的定量和定向 (2)细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析 (3)研究胞内代谢物浓度的反应工程方法 (4)用13C标记实验进行胞内稳态流分析 研究手段 (1)采用遗传学手段的遗传操作 ①基因工程技术的应用。②常规诱变技术的应用。 (2)生物合成途径的代谢调控 ①生物合成中间产物的定量生物测定。②共合成法在生物合成中的应用。③酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏。④无机磷对生物合成的调节。 (3)研究生物合成机制的常用方法 ①刺激实验法。②同位素示踪法。③洗涤菌丝悬浮法。④无细胞抽提法。⑤遗传特性诱变法。 3. 工业发酵的五字策略（图示加文字说明） ①进，在育种和发酵控制方面都要促进细胞对碳源营养物质的吸收； ②通，在育种方面解除对某些酶的反馈调节，在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架物流外海包括其他支持生物合成的物流）能够畅通的注入载流途径，汇入代谢主流，流向目的产物，特别是当发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保载流路径通畅，代谢主流优势明显 ③节，采用育种或发酵控制手段，节制与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。这里所谓的“节制”是指封闭或削弱以目的产物合成途径的起始底物或以中间产物为起始底物的分支途径； ④堵，采用育种或发酵手段消除或削弱目的产物进一步代谢的途径，包括目的产物参与的分解代谢和合成代谢，为了消除或削弱目的产物的进一步分解代谢，就必须降解目的产物进一步代谢的酶活力或酶量，甚至使这些酶不再合成或不起作用； ⑤出，促进目的产物向胞外空间分泌。在育种和发酵控制发面可通过调节细胞对目的产物的通透性，增加输送目的产物的载体蛋白的量，为目的产物输送代谢能的方法，使目的产物尽快转移出细胞。 4. 酶的阻遏机制，以大肠杆菌色氨酸或组氨酸操纵子为例来说明（图示加文字说明） 终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制反馈阻遏： 数字图像处理报告 题目指纹识别算法研究学院信息学院 专业通信工程 班级通信ZY1101 姓名郑涛、江代民 摘要 随着计算机和网络的迅速发展，人们对身份认证的准确性、安全性与实用性提出了更高的要求。基于生物特征识别的智能身份认证技术也逐渐受到广泛的关注。在众多的生物识别技术中，指纹识别技术是发展最早、应用最广泛的一种。指纹识别技术充分利用了指纹的普遍性、唯一性和永久性的生物特征，已逐步取代了传统的基于标志和数字的识别方式，目前在网络、银行、金融、医疗和安检等行业均得到了广泛应用。本文对指纹识别系统的原理和基本过程进行了分析研究，重点研究了指纹图像预处理算法，并且进行了验证。 在指纹图像预处理部分，论文对预处理的各个步骤包括规格化、图像分割、中值滤波、二值化、细化等以及各个步骤的方法进行了深入的分析和研究，选择了一种图像预处理方案。 在指纹特征提取部分，采用基于Matlab实现的指纹细节特征提取方法，并给出了去伪算法。指纹特征提取是从细化后的指纹图中得到细节特征点（即端点和分叉点），此特征点含有大量的伪特征，既耗时又影响匹配精度。采用了边缘去伪和距离去伪，使得特征点去伪前后减小了近1/3，然后提取可靠特征点信息，以便实现指纹匹配。 在指纹匹配部分，本文采用基于细节点的指纹匹配算法，并进行研究。 关键词指纹识别、预处理、特征提取、匹配 Fingerprint Recognition Algorithm Abstract With the rapid Progress of computer science and network technique，An accurate，secure and practical techno1ogy of Personal identification becomes more and more important. Technology of Personal identification based on Biometrics has received extensive attention. Technology of Fingerprint recognition is the earliest one and is app1ied widely in the all techniques of biometrics recognition, then is taking full advantage of the universality, uniqueness and permanency of the fingerprint, and gradually has taken place of traditional identification method that is based on symbol and number. Nowadays the technology of fingerprint identification is fully used in network, bank, finance, insurance and security. This paper research the basic principles and process of the fingerprint identification system，and focus on the pre-processing algorithms of fingerprint image and finally verify. In the fingerprint image processing section, thesis on preprocessing steps including specifications, image segmentation, median filtering, binarization, refinement, and so on, and each step of the way to in-depth analysis and research, is an image processing program. Part of the fingerprint feature extraction, fingerprint-based Matlab implementation details of feature extraction methods, and gives to the pseudo-algorithm. Fingerprint feature extraction is refined to get the details of fingerprint feature points (the endpoint and bifurcation points), this feature points contain a large number of false features, time-consuming and will affect the matching accuracy. Used and the distance to the edge of the false and counterfeit, makes the feature points to reduce the false front of nearly 1 / 3, and then extract a reliable feature point information, in order to achieve the fingerprint match. Part of the fingerprint match, the paper-based fingerprint minutiae matching algorithm, and conduct research. Keywords Fingerprint recognition、Pretreatment、Feature extraction、Matching 第六章微生物的代谢习题及参考答案 一、名词解释 1．发酵 2．呼吸作用 3．有氧呼吸 4．无氧呼吸 5．异型乳酸发酵 6．生物固氮 7．硝化细菌 8．光合细菌 9．生物氧化 10．初级代谢产物： 11．次级代谢产物： 12．巴斯德效应： 13．Stickland反应： 14．氧化磷酸化 二、填空题 1．微生物的4种糖酵解途径中，是存在于大多数生物体内的一条主流代谢途径；是存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中的一种替代途径，为微生物所特有；是产生4碳、5碳等中间产物，为生物合成提供多种前体物质的途 径。 2．同型乳酸发酵是指葡萄糖经 途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的 作用下被NADH 还原为乳酸。异型乳酸发酵经 、 和 途径分 解葡萄糖。代谢终产物除乳酸外，还有 。 3．微生物在糖酵解生成丙酮酸基础上进行的其他种类的发酵有丁二醇发酵、混合酸发 酵、 发酵和 发酵等。丁二醇发酵的主要产物是 ， 发 酵的主要产物是乳酸、乙酸、甲酸、乙醇。 4．产能代谢中，微生物通过 磷酸化和 磷酸化将某种物质氧化而释放 的能量储存在ATP 等高能分子中；光合微生物则通过 磷酸化将光能转变成为化学 能储存在ATP 中。 磷酸化既存在于发酵过程中，也存在于呼吸作用过程中。 5．呼吸作用与发酵作用的根本区别是呼吸作用中电子载体不是将电子直接传递给底物 降解的中间产物，而是交给 系统，逐步释放出能量后再交给 。 6．巴斯德效应是发生在很多微生物中的现象，当微生物从 转换到 下， 糖代谢速率 ，这是因为 比发酵作用更加有效地获得能量。 7．无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是外源电子受体，像 22322423、CO O 、S 、SO 、NO NO ----等无机化合物，或 等有机化合物。 8．化能自养微生物氧化 而获得能量和还原力。能量的产生是通过 磷酸化形式，电子受体通常是O 2。电子供体是 、 、 和 ， 还原力的获得是逆呼吸链的方向进行传递， 能量。 9．微生物将空气中的N 2还原为NH 3的过程称为 。该过程中根据微生物和其代谢工程在工业微生物育种中的应用
微生物课后答案
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第五章-微生物代谢试题
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指纹识别技术的研究与实现
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《微生物》习题附答案
微生物第五章34页word
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第六章-微生物代谢习题及答案