土壤中分解尿素的细菌分离和计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)一、研究背景和意义土壤中的细菌群落对于土壤生态系统的基本功能起着至关重要的作用。
其中，土壤微生物的代表——细菌在土壤有机质的分解中是不可或缺的，其中包括尿素的分解。
尿素是一种有机氮化合物，很多植物都会把尿素当作氮素的主要来源。
但是，尿素很容易被细菌分解成为氨气，因此，如果过量的尿素进入土壤，细菌可能会分解尿素而产生氨气，而氨气毒性较强，可能对于周围的生态产生较大的负面影响。
因此，研究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，有助于深入了解尿素分解的生态机理，从而为保护土壤生态环境提供理论基础和技术支持。
二、实验目的1.利用培养基筛选土壤中分解尿素的细菌，并分离单种菌株。
2.利用计数法确定土壤中分解尿素的细菌群落的数量。
3.了解土壤中分解尿素的细菌群落的形态特征和特点。
三、实验步骤1.尿素培养基制备:将1000ml蒸馏水与20g尿素、0.5g葡萄糖、0.1g磷酸氢二钾、0.2g酵母提取物、0.1g镁硫酸钾、0.5g氯化钠、0.5g硫酸铵、15g琼脂、适量pH指示剂溶解在一起，灭菌后即可得到尿素培养基。
2.样品制备：取10g土壤样品加入稀溶液后混合均匀，再经过过滤器过滤掉大颗粒，得到土壤浸液样品。
3.单种菌株筛选：将土壤浸液样品接种到尿素培养基中，在28℃下培养2-3天。
筛选到单种菌株后，通过高倍显微镜观察菌落的形态和特点，然后进行相应的鉴定。
4.计数法：将稀溶液进行逐步稀释，然后取稀释液的适量体积接种在尿素培养基上，在28℃下培养2-3天，根据菌落数确定土壤中细菌的数量。
四、实验结果及分析通过尿素培养基的筛选，共分离出5种分解尿素的细菌，并进行了表征与鉴定。
通过计数法，成功地计算出了土壤中的分解尿素的细菌数量。
土壤中分解尿素的细菌群落种类多样，数量较多，这对于土壤中尿素分解的生态机理研究具有重要的意义。
同时，该实验的操作简单，成本低廉，适用于在实验室环境下大规模进行。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中 加入（ C ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
5、实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细 菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3 条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条 件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以 下叙述，不正确的是 D
3、从物理性质上来看，选择哪种培养基？
提供碳源、氮源、水、无机盐和生长因子 以尿素为唯一氮源 固体培养基
培养基配方
4、在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖 氮源：尿素
思考：
5、培养一段时间后如果得到多种类型的菌落， 说明什么？如何将不同的菌株纯化？
6、若纯化得到不同的目的菌株，如何比较它 们分解尿素能力的大小？(参考P26课题延伸）
1、为什么分离不同的微生物要采用不同的稀 释度？
不同的微生物在土壤中的密度不同
2、测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分 解尿素的细菌数量，选用的稀释范围相同吗？ 如果不相同，你打算选用多大的稀释范围？
由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选 择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为102～106
3、样品的稀释
1、培养不同微生物的培养温度有何不同？ 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 2、多长时间记录一次菌落数目合适？什么 时候记录的菌落数目可以作为实验结果？
每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果 3、怎样辨别不同的细菌？
注意事项
①恰当的稀释度是成功的关键，一般选择菌落 数在30~300的平板进行计数
②要设置重复实验，一定要涂布至少3个平板。 ③ 结果中个别重复组与其他组相差太远时， 需要重新实验。 ④统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液 的体积(ml)，M代表稀释倍数。
注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30— —300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三 个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出 菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是 因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察 到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌 落数而不是活菌数来表示。 ④涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要， 一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所 出现的平均菌落数在50个左右为最好。
5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中 加入（ C ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
思考与讨论
在微生物培养过程中，为什么每隔24h统计一 次菌落数目？菌种鉴定的依据是什么？ 答：不同种类的微生物，往往需不同的培养温 度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选 取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防 止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。不 同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光 泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的 特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。
4.下列说法不正确的是（ B ） A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因 素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大， 种类最多。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀课件
5.测定细胞总氮量或总碳量
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1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中 的菌落数？
答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁 栏的公式进行计算。
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富集一些。
检测：酚酞的灵敏度不
如酚红，因此建
议最好使用酚红，
否则效果不明显。
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培养基 类型
日期 第一天 第二天
平板细菌数（土壤稀释度）
选择性培养基
（涂布接种）
（未涂布接种）
牛肉膏蛋白胨 培养基
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本课题知识小结:
33
12
两稀释度 菌数之比
1.6 2.2
-
菌落总数 个/g或个/ml
16400 38000 27100 513000
270 30500
报告方式 个/g或个/ml 16000或1.6×104 38000或3.3×104 27000或2.7×104 510000或5.1×105 270或2.7×102 31000或3.1×104
102
103
104
105
106
107
101
10g土壤
9ml
无菌水
9ml 无菌水
104
105
106
107
104
105
106
107
104
105
106
107
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案尿素是一种含氮有机化合物，广泛用作化肥和动物饲料。
土壤中的细菌可以通过分解尿素来获取氮元素，从而促进土壤微生物群落的生长和发展。
为了研究土壤中分解尿素的微生物群落，可以进行以下实验：
1.采集土壤样品，将其通过蒸馏水过滤器过滤，以去除大颗粒物和悬浮物。
2.将过滤后的土壤样品接种到含有尿素的培养基中，利用不同的培养条件(如温度、pH值、氧气含量等)筛选出适宜于生长的细菌。
3.将筛选出的细菌进行单一克隆培养，然后通过染色、显微镜观察和生化测试等方法对其进行鉴定和分类。
4.最后，可以利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验步骤：
1.收集土壤样品，通过蒸馏水过滤器过滤。
2.制备含尿素的培养基，分别设置不同的培养条件，如温度、pH 值、氧气含量等。
3.将过滤后的土壤样品接种到培养基中，进行培养。
4.观察培养基中是否有细菌生长，记录细菌的数量和形态特征。
5.对生长的细菌进行单一克隆培养，然后进行鉴定和分类。
6.利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验注意事项：
1.在实验过程中要注意卫生，避免污染。
2.制备培养基时要严格按照配方和操作步骤进行。
3.培养时要控制好温度、pH值、氧气含量等条件，以便筛选出适宜于生长的细菌。
4.鉴定和分类时要准确和细致，避免误判。
5.计数时要进行多次重复，以提高结果的精度和可靠性。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3.重复组的结果是否一致
如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结 果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操 作过程中去分析、寻找可能的原因。
六、课 题 延 伸
能分解尿素的细菌的鉴定
鉴定的原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基
的pH升高。 鉴定方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指 示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基 的颜色变化。
三、设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有 其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种 方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培 养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长， 说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的 菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选 择培养基已筛选出一些菌落。Leabharlann 2.样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在 30～300的平板，则说明稀释操作比较成 功，并能够进行菌落的计数。
碳源是葡萄糖，氮源是尿素。
2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选 作用？如果有，又是如何进行筛选的？
有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合 成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。
二、 统计菌落数目
原理
运用稀释涂布平板法来统计样品中的活 菌数。
统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释 度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源 于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释 度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果 准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板 上，培养后再选择菌落数在30 ～300的平板进行 计数。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(4)计数：当菌落数目稳定时，取同一 稀释度 下的3个平 板进行计数，求出 平均值 ，并根据所对应的 稀释度计算出 样品中细菌的数目
2．菌种鉴定 (1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨， 使培养基的碱性 增强。 (2)方法：在以 尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示 剂培养细菌，若指示剂变 红 ，可确定该种细菌能够分解尿
圆褐固氮菌生活于土壤中，能以氮气作为氮源。请探 讨、交流实验室分离圆褐固氮菌的方法。
提示：配制无氮培养基作为选择培养基。
[跟随名师·解疑难] 1．选择培养基的类型及作用 (1)在培养基中加入某种化学物质。如加入青霉素可以 分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可得到金黄色葡 萄球菌。这里的加入指的是在培养基的培养成分的基础上 加入。 (2)改变培养基中的营养成分。如培养基中缺乏氮源时， 可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基 上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也 具有分离效果。 (3)改变微生物的培养条件。如将培养基放在高温环境 中培养只能得到耐高温的微生物。
[自读教材·夯基础]
1．实验设计流程
1土壤①土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿
取样
②取样部位：距地表约3～8
cm的土壤层
①稀释原因：样品的稀释程度直接影响
平板上生长的菌落数目
2样品稀释②稀释标准：选用一定稀释范围的样品
液进行培养，保证获得菌落数在 30～300 之间便于计数
①培养：不同种类的微生物，往往需要 3培养与观察不②同观的察培：养每温隔度24和h统培计养一时次间菌落数
1.测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平 板法和显微镜直接计数法。
2．稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目， 但统计结果往往比活菌数目低。
实验03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、实验原理：（1）土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成尿酶。
（2）配置以尿素为唯一氮源的培养基，能够在这个培养基上生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
二、操作步骤：(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。
(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。
细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
②观察a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。
2、灭菌培养基：高压蒸汽灭菌法3、培养皿灭菌：干热灭菌法三、操作提示(1)无菌操作①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在酒精灯火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需注意的问题(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
(3)为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然因素对实验结果的影响。
(4)分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
(5)为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
耐高温的酶
寻找
寻找 耐高温生物体 耐高温环境（热泉等）
小结：从自然界筛选目的菌株的原则：
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
耐盐微生物
盐碱地等高盐的环境
冰川
耐寒微生物
分解石油的细菌
油田
2、 实验室中微生物的筛选 筛选原则：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营 养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
（二）制备培养基
制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 思考：为什么要制备牛肉膏蛋白胨培养基？ （对照作用）
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应 明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基 可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
（三）稀释涂布平板
（1）测土壤中细菌数： 一般用104、105、106稀释液
（2）测放线菌： 一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数： 一般用102、103、104稀释液 以保证获得菌落数在30-300之间。
思考：（P24页左侧）
原因：不同微生物在土壤中含量不同
（三）稀释涂布平板
每个稀释度均用3个选择培养基和1个牛肉膏蛋白胨培养基 为保证计算结果准确 ①选择菌落数在30～300的平板上计数。 ②每个稀释度取3个或以上平板做重复组，其平均值。
三、设置对照 （三）设置对照：
（1）设置对照的目的： 是排除实验组中非测试因素对实 验结果的影响，提高实验结果的可信度。 （2）对照实验： 指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。
请你通过设置对照实验，（P23页），帮助A同学排除上述两个可 能影响实验结果的因素。 可能原因 设置对照 实验结论 其他同学用与A同学 如结果与A同学一致，则证明 土样不同 相同土样进行实验 A无误；反之，则证明A同学 失误 若有菌落出现，则培养基被污染 培 养 基 污 染 或 将A同学的培养基不接种， 培 养 中 混 入 了 进行培养，作为空白对 若无菌落出现，则没污染 照 若菌落数和A同学一致，说明培养基 其他的含氮物 中混入了其他含氮物质，若菌落数 其他同学用A同学的培养 质) 与其他同学一致说明培养基中没有
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
基础知பைடு நூலகம்：
（一）筛选菌株
KH2PO4
1.4g
NaH2PO4
2.1g
MgSO4`7H2O 葡萄糖
0.2g 10.0g
尿素 琼脂
选择培养基
1.0g 15.0g
培养基配方
思 考：该培养基对微生物具有选择作用吗？如果 具有，是如何进行选择的？
只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种
• 2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生 物，其中也包括分解尿素的微生物。由于 瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后 会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生 物除了需要准备选择培养基外，还应参照 厌氧菌的培养方法进行实验设计。
分析P22实例:
你认为哪个同学的结果更接近真实值？你认 为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如 何改进？
第一位同学没有重复实验(至少涂布3个平板)，结 果不具有说服力。
第二位同学有重复实验，但结果不一致（误差较 大），说明在操作过程中可能出现错误，需要重 新实验。
【例1】为了计数微生物的数量，一位同学在4
1、酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增
强，PH升高→酚红指示剂，变红 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红-美蓝结合→菌落呈黑
色。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
课后练习
——利用血球计数板在显微镜下直接计数。
（2）活菌计数法——统计菌落数目
方法： 稀释涂布平板法。 原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长 的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
高中土壤中分解尿素的细菌的分离与计数及答案教案
高中土壤中分解尿素的细菌的分离与计数及答案教案YUKI was compiled on the morning of December 16, 2020课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数要点展示1．研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。
2．能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数。
要点突破一、理论基础1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养；的微生物.加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
2．统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有和。
（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
此外，测定微生物数量的常用方法还有直接计数。
3．设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。
二、实验设计关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：1．取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。
应先 3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。
2．制备：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
3．微生物的与观察将10g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液，转移至盛有的生理盐水的无菌大试管中，将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取进行平板涂布操作。
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（一）筛选菌株
3、选择培养基
根据微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不
同，配制的允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他
种类微生物生长的培养基。
本课题使用的选择培养基
物理特性：固体培养基 功能特性：选择培养基
例：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应 稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是
(D )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和261，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平 均值163
【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每 毫升样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。
（二）统计菌落数目
2.间接计数法→活菌计数法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一 个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（2）常用Байду номын сангаас法：稀释涂布平板法。
葡萄糖
10.0g
不缺能乏分氮解源尿的素培，养缺基乏—氮—源分而离不固能氮生微长生物
尿素 琼脂
1.0g 15.0g
发在育无繁氧殖条，件而下受的到普抑通制培，养所基以—用—此分培离厌氧型将和上兼述性物质厌溶氧解型后微，用生蒸物馏水
养基就能够选择出分解尿素的微生物。
定容到1000mL。
例：下列能筛选出分解尿素的细菌的培养基是( A )
但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没 有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同 学排除上述两个可能影响因素吗？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教案
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、教学目标：1.能按照科学探究的要求，应用稀释涂布平板法和微生物数量测定的方法，设计从土壤中分离分解尿素的细菌并进行计数的方案。
2.依据设计的方案，运用无菌操作技术和微生物分离、培养的方法初步分离出目标菌。
3.尝试解决生产、生活中与微生物选择培养、计数等有关的实际问题。
二、教学重难点：教学重点：实验设计方案的设计与修正，正确进行实验操作教学难点：设计实验方案。
三、教学过程：提出问题（实验目的）：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
基础知识（实验原理）：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
选择培养基配方： 组分 含量KH 2PO 41.4g Na 2HPO 42.1gMgSO 4·7H 2O0.2g葡萄糖10.0g 尿素1.0g 琼脂 15.0gH 2O定容至1000mL 实验设计：请同学们阅读教材19页资料，思考有关问题，小组合作进行实验设计，写出详细的实验方案，交流修正。
实验步骤：按照方案，选择合适的实验材料，进行实验。
(一）、土壤取样细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3～8cm 的土壤层。
因此，取样时一般要铲去表层土。
将样品装入纸袋。
注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。
操作完成后，一定要洗手。
(二）、制备培养基用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用以尿素为唯一氮源的培养基做实验组，用来判断选择培养基是否具有选择作用。
(三）、样品的稀释与涂布平板（稀释涂布平板法）简要回顾操作梯度稀释：在酒精灯火焰旁称取10g土壤，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，振荡使土壤与水充分混合，将细菌分散，制成101倍土壤稀释液。
用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍的土壤稀释液。
人教版高中生物选修一专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学案含解析
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、研究思路1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
2．统计菌落数目(1)活菌计数法：常用稀释涂布平板法。
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C ÷V )×M 。
C ：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V ：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。
M ：代表稀释倍数。
③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。
.1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
3．测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。
稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目低。
4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
5．鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，依据是否变红进行判断。
(2)显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。
3．设置对照(1)对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。
(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
二、实验设计1．土壤取样从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数在我们生活的地球上，土壤是一个极其复杂而又充满生机的生态系统。
在这个生态系统中，存在着各种各样的微生物，它们在物质循环和能量流动中发挥着至关重要的作用。
其中，分解尿素的细菌就是一类非常特殊且具有重要功能的微生物。
尿素是一种常见的含氮化合物，广泛应用于农业生产中作为氮肥。
然而，植物并不能直接吸收和利用尿素，需要经过分解尿素的细菌将其转化为氨等植物能够吸收的形式。
因此，研究土壤中分解尿素的细菌对于提高氮肥的利用率、减少环境污染以及深入了解土壤生态系统的功能都具有重要意义。
要分离和计数土壤中分解尿素的细菌，首先需要采集合适的土壤样本。
我们通常会选择那些长期施用尿素肥料的农田、花园或者草地的土壤。
在采样时，需要使用无菌的工具，如无菌铲或者无菌勺，从不同的地点和深度采集土壤，以确保样本的代表性和多样性。
将采集到的土壤放入无菌的塑料袋中，并尽快带回实验室进行处理。
回到实验室后，第一步是制备培养基。
用于分离分解尿素的细菌的培养基通常是选择培养基，其中含有尿素作为唯一的氮源。
除此之外，还需要添加碳源（如葡萄糖）、无机盐、生长因子等营养物质，以及琼脂作为凝固剂。
在制备培养基的过程中，要严格遵守无菌操作，防止杂菌的污染。
接下来，将土壤样本进行稀释。
这是一个关键的步骤，目的是将土壤中的微生物分散开来，以便能够在培养基上形成单个的菌落。
我们可以使用无菌水对土壤样本进行一系列的梯度稀释，比如 10 倍、100 倍、1000 倍等。
稀释的程度要根据土壤中微生物的数量和实验的要求来确定。
然后，将稀释后的土壤溶液涂布在制备好的培养基上。
使用无菌的涂布棒，将溶液均匀地涂布在培养基的表面。
涂布完成后，将培养基倒置放入恒温培养箱中进行培养。
培养的温度和时间要根据所分离的细菌的特性来确定，一般来说，温度在 30℃至 37℃之间，培养时间为2 至 3 天。
在培养的过程中，分解尿素的细菌会在培养基上生长并形成菌落。
土壤中分解尿素的细菌的分离与记数
尿素分解细菌的纯培养
尿素分解细菌的纯培养是分离尿素分解细菌的关键步骤， 通过选择性培养基，将土壤中的尿素分解细菌分离出来， 获得单一菌落。
培养基中添加尿素作为唯一氮源，以筛选出能够分解尿素 的细菌。同时，培养基中还应添加适量的其他营养成分， 以满足尿素分解细菌的生长需求。
尿素分解细菌的计数方法
尿素分解细菌的计数可以采用菌落计数法或细胞计数法。菌落计数法是通过培养 基上形成的菌落数量来计算尿素分解细菌的数量，而细胞计数法则采用显微镜直 接观察和计数细胞。
菌落计数法操作简便，但可能存在菌落重叠和无法区分死菌和活菌的问题。细胞 计数法虽然准确度高，但操作较为复杂，需要使用显微镜和专业的细胞计数器。
尿素分解细菌的计数实验步骤
将土壤样品稀释后涂布在含有尿素的 培养基上，然后进行培养。
对筛选出的尿素分解细菌进行纯培养， 并进行进一步的生理生化实验和分子 生物学鉴定，以确定其种类和特性。
采集时间
采样方法
选择适宜的时间采集土壤样品，通常 在春季或秋季进行，此时土壤中的微 生物活性较高。
采用多点采样法，在不同地点和深度 采集土壤样品，以获得更全面的土壤 信息。
采样地点
选择具有代表性的土壤区域进行采样， 如农田、森林、草地等，确保采集的 土壤样品具有广泛性和代表性。
分离尿素分解细菌的方法
生长特性
这些细菌在尿素培养基上 生长良好，表现出对尿素 的良好分解能力。
尿素分解细菌的记数结果
菌落计数
通过菌落计数法，对分离 出的尿素分解细菌进行数 量统计。
数量分布
在土壤的不同区域，尿素 分解细菌的数量分布存在 差异。
生长条件
部分尿素分解细菌对生长 条件较为敏感，如温度、 pH值等。
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显微镜直接计数
（统计菌株数目）
优点： 计数方便，操作简单 缺点： 死菌、活菌都计算在内，
统计结果比实际值偏大
1 、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（ C ） A 一个细菌、液体培养基 B 许多细菌、液体培养基 C 一个细菌、固体培养基 D 许多细菌、固体培养基
2、某同学在稀释倍数为106 的培养基上测得平板上的菌落数 的平均值为215，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用 稀释液的体积为0.1ml） B 8 9 A 2.15×10 B 2.15×10 C 215 D 21.5
方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。 方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。
2、增加实验说服力的措施：
排除偶然因素对实验结果的影响。 ①设置重复：
方法： 在培养过程中同一稀释度下应涂布 至少3个平板，才能增强说服力和准确性
排除实验组中非测试因素对实验结果 ②设置对照：
的影响，提高实验结果的可信度。 方法：如空白对照组 观察培养物中是否有杂菌污染 若对照的培养皿中无菌落生长，说明：
2、操作流程：
（1）土壤取样 土壤“微生物的天然培养基”，含有大量 取样原因： 的微生物，数量最大，种类最多。 土壤要求： 富含有机质，pH接近中性且潮湿。 取样部位： 距地表约3∼8cm土壤层
（2）样品稀释
稀释原因： 样品的稀释程度直接影响平板上生长 的菌落数目 稀释标准： 选用一定稀释范围的样品液进行培养， 保证获得菌落数在30-300之间，便于计数。 稀释倍数： 测细菌数： 一般用104、105、106稀释液
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接 种环通过 灭菌，在第二次及以后的划线时， 总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的 是 。 (3)示意图A和B中, 表示的是用稀释涂布平 板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部 分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现:振 荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因 是：振荡培养能提高培养液中 的含量，同时可 使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。
3、下列有关检测土壤中细菌总数实验操作的叙述中， 不正确的是（D ） A 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板 B 取104、105、106 倍土壤稀释液和无菌水各0.1ml涂布不同平板 C 将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24h-48h D 确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数。
用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中 的细菌数，在对应稀释倍数为 106 的培养基中，得 到以下几种统计结果，正确的是( ) A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B ．涂布了两个平板，统计的菌落数是 215 和 260，取平均值238 C ．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是 21 、 212和256，取平均值163 D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是 210、 240和250，取平均值233
一、筛选菌株 （纯且活的菌种）
1、自然界中目的菌株的刷选原理：
在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求， 到相应的环境中去找。
2、实验室中筛选微生物的原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、 温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
KH2PO4
NaHPO4 MgSO4 H2O 葡萄糖 尿素
测放线菌： 一般用103、104、105稀释液 测真菌数： 一般用102、103、104稀释液
思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？ 土壤中各类微生物的数量不同 如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围 可以放宽103-107.
1 、关于土壤取样的叙述，错误的是（ C ） A 土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤 B 先铲去表层土3-8cm左右，再取样 C 取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌 D 应在火焰旁称取土壤 2、下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验步骤排列 正确的是 C ①土壤取样 ②称取10g土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1ml进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107 稀释度 A①②③④ B①③②④ C①②④③ D①④②③
3、方法： 利用选择培养基分离
选择培养基： 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基。 利用选择培养基分离微生物的方法： (1)在培养基中加入某种化学物质。 例如，加入青霉素可以分离出 酵母菌和霉菌 ； 加入高浓度的食盐可以得到 金黄色葡萄球菌 。 这里的加入是在培养成分的基础上加入。
酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基 碱性增强→ 酚红变红
Байду номын сангаас
为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流 水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下 列问题： (1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在 涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了 一段时间，这样做的目的是 ； 然后，将水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接 入稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为 39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数 为 。
(2)改变培养基中的营养成分。
例如，缺乏氮源时可以分离 固氮微生物 ； 尿素作为唯一氮源时，可以分离出 能分解尿素的细菌 石油作为唯一碳源时，可以分离出 能消除石油污染的微生物
(3)改变微生物的培养条件。 例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到 耐高温的微生物
本课题使用的培养基的配方如下： KH2PO Na2HPO MgSO4 成分 葡萄糖 尿素 · 7H O 2 4 4
含量 1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 琼脂 水
1.0 g 15.0 g 1000 mL
请分析后回答： (1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和 葡萄糖 和________ 尿素 。 氮源的分别是________ 固体 (2)该培养基为____________ 培养基(按物理状态分)， 有凝固剂琼脂 。 理由是______________ (3)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如 果具有，又是如何进行选择的？ ______________________________________ 有选择作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能 够利用尿素的微生物才能够生长
______________________________________。
二、统计菌落数目
1、方法：常用稀释涂布平板法统计活菌的数目
稀释度足够高 当样品的 时，培养基表面生长 原理： 的一个菌落来源于样品稀释液中的 一个活菌 。 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品 中大约含有多少的活菌。
（三）微生物的培养与观察 1、接种：用适当的稀释液涂布平板 2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d; 放线菌:25∼28℃, 5∼7d; 霉菌: 25∼28℃, 3∼4d. 3、观察：a.每24h统计一次菌落数目 b.以“稳定菌落”为观察对象
（四）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存
缺点： 操作复杂，实验结果有一定的误差。
统计的菌落数往往比活菌的实际数目低
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上
观察到的只是一个菌落。 因此统计结果一般用菌落数表示。 计算 每克样品中的菌株数=（C/V)X M
公式： C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V:所用稀释液的体积； M:稀释倍数。
=（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数 。
培养基未被杂菌感染
若实验的培养基菌落数偏高或者菌落形态多样，说明： 培养基混入其他杂菌
如完全培养基对照组 观察选择培养物是否具有 选择作用 若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基 上的数目，说明： 选择培养基具有筛选作用
三、实验设计
1、实验流程：
配制土壤溶 液 系列稀释 涂布平板与 培养 菌落计数
利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中， 从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别 得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入 了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能 在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿 不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证 据。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在 要求： 30∼300 个菌落的平板 统计
例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤 样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中， 得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌 落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板， 统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个 平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题， 错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值
1.4g
2.1g 0.2g 10.0g 1.0g
该培养基的配方中，为微 生物的生长提供碳源和氮源的 分别是什么物质？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
琼脂
15.0g
将上述物质溶解后， 用蒸馏水定容到 1000mL。
此配方能否筛选出分解尿 素的细菌？为什么？
能。只有产生脲酶的细菌 能利用尿素作为氮源而生 存。
思考：PCR技术要求使用耐高温的DNA聚合酶， 这种酶要能忍受93 ℃左右的高温。如果请你来寻找 这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？( C)
A．土壤中
C．热泉中 如何寻找耐高温的酶？
B．海水中
D．冷库中 —寻找高温环境；
原理：热泉70-80℃的高温条件淘汰了绝大多数 的微生物，使得耐热的Taq细菌脱颖而出。选出 耐高温细菌后，从耐高温菌种中提取耐高温酶。