色氨酸的发酵代谢控制

L-色氨酸的发酵代谢控制

09生工（2）班20090806249 肖军

摘要：色氨酸化学名称为a一氨基一p-吲哚丙酸，有L和D型同分异构体，此外还有消旋体DL-色氨酸。L-色氨酸是人和动物的必需氨基酸，参与机体蛋白质合成和代谢网络调节，广泛存在于自然界。D-色氨酸则主要存在于微生物和绿色植物中，动物体内含量较少。色氨酸在人体内几乎不发生作用，也无毒性。L-色氨酸是继蛋氨酸、赖氨酸之后的第三代饲料添加剂，其使用效果是赖氨酸的3～4倍，具有十分广泛的应用前景，近年来在医药、化妆、食品、保健品等行业也得到广泛的应用。本文综述了利用微生物生产L-色氨酸的各种方法和L-色氨酸的生物合成途径及其代谢调控机制，并介绍了利用重组DNA技术选育L-色氨酸高产菌的研究现状。

关键字：色氨酸；发酵；代谢控制；生物合成；育种

目前年产量超过万吨的氨基酸还只有谷氨酸、赖氨酸和采用合成法的DL-甲硫氨酸，不言而喻，色氨酸又是一个很有吸引力的工业化商品。发展色氨酸的关键在于提高产率、降低成本。色氨酸是必需氨基酸。它与赖氨酸同是生物体内不足的氨基酸, 在营养上是十分重要的。色氨酸在饲料中良好的添加效果已引起了人们极大的重视, 饲养试验表明在玉米粉中添加0.4%赖氨酸, 可使蛋白质增重效率（PER）由0.85提高到1.08, 而再添加0.07%色氨酸后，PER可进一步提高到2.55。也就是说比单独使用赖氨酸时要高一倍以上。

1.色氨酸的生产方法

色氨酸的生产最早主要依靠化学合成法和蛋质水解法，但是随着对微生物法生产色氨酸研究的不断深入，这种方法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。近年来还出现了将直接发酵法与化学合成法相结合、直接发酵法与转化法相结合生产色氨酸的研究。另外，重组DNA技术在微生物育种和酶工业上的应用极大地推动了直接发酵法和酶法生产色氨酸的工业化进程。

1.1微生物转化法

亦称前体发酵法。这种方法使用葡萄糖作为碳源同时添加合成色氨酸所需的前体物如邻氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的色氨酸合成酶系来合成色氨酸。这种方法同直接发酵法一样，需要解除生物合成途径中大部分酶所受到的反馈调节，以使色氨酸能够高浓度蓄积。另外，所添加的前体物大都是抑制微生物生长的，因此添加量不可过高，一般采取分批少量添加的方法。同时可以筛选前体物的添加量。例如采用枯草杆菌的抗菌的5-FT抗性突变株SD-9在15L含6%葡萄糖的培养基中培养，在培养过程中每次添加少量6%的邻氨基苯甲酸溶

液共2L，经120h后可生产色氨酸9.6g/L。微生物转化法的不足在于当转化液中前体物浓度较高时，转化率有所下降。另外，前体物的价格比较昂贵，不利于降低成本。

1.2酶法

酶法是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸。这些酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。根据提供这些酶的微生物种类数，可以分为双酶菌法和单酶菌法两种类型。该法既可以直接加入细胞壁溶解酶使细胞破壁后再使用，也可以将所需的酶固定化后再使用，一般由酶源菌体的培养、菌体的分离洗涤、固定化和反应几个阶段组成。例如利用大肠杆菌的色氨酸合成酶和恶臭假单孢菌的丝氨酸消旋酶，以吲哚和DL-丝氨酸为底物，在200L反应罐中反应24h，色氨酸产量可达到28.5g/l。利用黄杆菌/AF3912的酶系，以DL-5-吲哚甲基乙丙酰脲为底物，同时在反应液中加入适量的苯肼或野芝麻花碱以抑制色氨酸氧化酶的活性而阻止色氨酸的降解，L-色氨酸的产量可达8.8g/l。酶法能够利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易的优点，是一种成本较低的生产色氨酸的工业化生产方法。

1.3 直接发酵法

该法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌种来生产色氨酸。对这种方法的研究进行的比较早，但在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求。主要原因是从葡萄糖到色氨酸的生物合成途径比较漫长，其代谢流也比较弱，而且色氨酸的合成需要多种前体物（如PRPP等），若想进一步提高色氨酸的积累量就必需设法增强合成这些前体物的代谢流。另一方面，色氨酸生物合成途径中的调控机制比较复杂，除了反馈调节这一粗调系统之外，还存在着细系统———弱化子系统。随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产色氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。例如从大肠杆菌EMS4-C25中分离得到抗反馈调节的色氨酸操纵子，并将其克隆到质粒pUC19 和pHSG576中分别得到重组质粒pTC701 和pTC576。将pTC576转化到大肠杆菌中，该菌经过17h的分批发酵积累色氨酸16g/l。Ikeda等将带有DAHP合成酶（DS）和色氨酸合成酶（TS）的质粒引入产色氨酸的谷氨酸棒杆菌KY10-894中，使色氨酸的产量提高了54%，达到了66g/l。

1.4 其他生产方法的研究

这些方法主要是将上述几种方法有机地结合起来进行色氨酸的生产。主要有直接发酵法与化学合成法、酶法相结合，其特点是利用发酵法廉价提供一种前体物，再结合其它方法的优势进行生产。例如，利用黄色短杆菌P390直接发酵积累L-谷氨酸-γ-半醛（GSA）达13.2g/l，然后将发酵液适当稀释后加入含苯肼的1mol/l H2SO4，中加热回流1h之后，48%的GSA可转化为L-色氨酸。利用落叶松蕈AHU9382以5%葡萄糖为碳源发酵3d可积累丙酮酸22~26.5g/l，然后加入吲哚、氯化铵和具有高色氨酸酶活性的产气肠杆菌培养12h之后可积

累L-色氨酸15g/l.

2.色氮酸生物合成的调节机制

色氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸同属芳香族氨基酸,苯丙氨酸和酪氨酸协同抑制芳香族氨基酸生物合成第一步3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸（DAHP）合成酶的活力, 色氨酸能增强这种抑制作用, 三种氨基酸共同存在时, 最大抑制作用约99%。此外色氨酸还反馈抑制和反馈阻遏邻氨基苯甲酸合成酶的活力, 苯丙氨酸或酪氨酸部份地抑制在苯丙氨酸和酪氨酸生物合成途径分枝点上起催化反应的分支酸变位酶。

3.选育色氮酸生产菌的方法

3.1切断支路代谢

选育和应用营养缺陷型突变株, 切断苯丙氨酸和酪氨酸分支途径是积累色氨酸的有效措施。色氨酸产生菌二般采用筛选苯丙氨酸和酪氨酸双重营养缺陷型菌株。

3.2解除反馈调节

选育抗类似物突变株, 代谢调节被遗传性地解除, 不受培养基成份的影响, 生产稳定。这是色氨酸育种的重要手段, 特另是利用营养缺陷型兼具类似物抗性的突变株。

色氨酸类似物有5-甲基色氨酸, 色氨酸氧肪酸盐,6-氟色氨酸, 4-甲基色氨酸等。苯丙氨酿类似物有对-氟苯丙氨酸, 对-氨基苯丙氨酸等。酪氨酸类似物有酪氨酸氧肪酸盐, 3-氨基酪氨酸等。这些类似物主要是起假反馈抑制荆的作用, 从而可选得抗反馈抑制的突变株。

3.3增加前体物的生物合成

色氨酸产生突变株L-色氨酸产量增加, 是与色氨酸特定通路内邻氨基苯甲酸合成酶反馈抑制敏感性的减少相一致。所以色氨酸形成的限速步骤在反馈抑制还存在时,似乎就取决于邻氨基苯甲酸合成酶的反应,因此色氨酸产量的提高, 可采用的方法是增加前体物分支（酸邻氨基苯甲酸合成酶底物）的水平。例如磺胺与从分支酸合成的对氨基苯甲酸竞争性地抑制二氢蝶酸合成酶,然而它们抑制叶酸的生物合成。从这些磺胺抗性突变株中, 它们增加了分支酸水平, 从而提高了突变株色氨酸的产率。

4.色氨酸产生菌育种范例

在实际色氨酸产生菌的选育工作中, 根据色氨酸生物合成调节机制, 采用筛选营养缺陷型和对代谢产物类似物拮抗的综合办祛, 经过多次诱变逐步挑选获得色氨酸高产菌株。例如谷氨酸捧伏杆菌的苯丙氨酸和酪氨酸双重缺陷型的Ky9456菌株只能产痕量色氨酸。通过多次诱变处理, 逐步获得对5-甲基色氨酸、色氨酸氧厉酸盐、6-氟色氨酸和4-甲基色氨酸具有抗性的一株变异株4MT-11可产色氨酸4.9克/升。此变异株生产色氨酸受苯丙氨酸和酪