高效液相色谱柱柱效测定
高效液相色谱
二、 进样系统
将样品溶液准确送入色谱柱的装置 ——手动方式、自动方式
进样器要求
密封性好、死体积小、重复性好、进样时 引起色谱系统的压力和流量波动要很小。
常用手动进样器——六通阀进样器，
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测
高分子多孔微球：YSG
一、固定相
3. 常用固定相
化学键合固定相
以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子
以共价键连接在硅醇基上
(硅酯化) Si OH R OH Si O R
SOCl 2
(酰氯化) Si OH SOCl2 Si Cl RLi 或RMgCl Si R (硅烷化) Si OH R3 SiCl Si O SiR3 HCl
高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸
4、液相色谱的结构
• 一 流路系统： 流动相、管路、泵、混 合器、脱气机等组成
• 在225nm下测其峰面积：
体积/mL 2.00 含量/mg 0.010 峰面积 280594
3.00 0.015 415433
4.00 0.020 555024
5.00 0.025 687406
6.00 0.030 831821
峰面积
1000000 800000 600000 400000 200000
3、为什么要选择液相色谱方 法？
• 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快， 只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。
• 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小， 因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。
• 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器—— 10-11g
50 100 150 200 250 300 350 波长/nm
三、实验阶段
• 2.仪器参数设置
• 流动相: 甲醇：乙酸铵溶液（0.02mol/L） (5:95)
• 流速:1mL/min • 进样量：10uL • 检测器波长：225nm
三、实验阶段
• 3.标准曲线绘制
• 分别移取苯甲酸标液2mL、3mL、4mL、5mL 、6mL于 50mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
6、如何定性，如何定量
• 1、定性分析：在确定的色谱分离条件下，苯甲酸有一定的保留时间， 在相同的实验条件下，分别测定苯甲酸纯物质和饮料样品中各组分的保 留值，将两者进行对比，就可确定饮料中何种组分为苯甲酸，对其进行 定性。
九高效液相色谱仪的性能检查和色谱参数的测定
线性范围
检查自动进样器在不同进 样量下的线性响应范围， 以确保其适用于不同浓度 的样品分析。
检测器性能检查
噪声与漂移
评估检测器的基线噪声和漂移，以确保其稳定性和灵 敏度。
线性范围与响应因子
检查检测器在不同浓度下的线性响应范围和响应因子， 以确保其准确性和可靠性。
检测限与定量限
确定检测器的检测限和定量限，以评估其对于低浓度 样品的检测能力。
九高效液相色谱仪的性能检查和色 谱参数的测定
目录
• 性能检查 • 色谱参数测定 • 方法开发与验证 • 仪器维护与故障排除 • 数据处理与结果分析 • 法规要求与实验室管理实践
01 性能检查
泵系统性能检查
01
02
03
流量准确性
通过测量实际流量与设定 流量的偏差来评估泵系统 的准确性。
流量精密度
03 方法开发与验证
方法开发流程梳理
明确分析目标
确定需要分析的样品类型、目标化合物以 及分析要求。
确定洗脱程序
通过优化洗脱程序，包括梯度洗脱和等度 洗脱，使目标化合物在合适的时间内出峰，
并获得良好的峰形和分离度。
选择色谱柱和流动相
根据目标化合物的性质选择合适的色谱柱 和流动相，确保目标化合物能够得到有效 的分离和检测。
峰识别、定量计算及结果解读方法分享
峰识别
根据色谱峰的保留时间、峰形等特征，识别出样品中的各 组分，并与标准品进行比对验证。
定量计算
通过比较样品峰与标准品峰的峰面积或峰高，使用内标法、 外标法等定量方法，计算出样品中各组分的含量。
结果解读
根据定量计算结果，结合样品信息和相关标准，对检测结果进行解读和评估， 判断样品是否符合要求。同时，对异常结果进行原因分析，并提出相应的改进 建议。
电化学实验
苯、萘、联苯的高效液相色谱分析及柱效能的测定一、目的要求1．学习高效液相色谱保留值定性、外标法定量分析方法。
2．了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，以及初步掌握其操作技能3．学习柱效能的测定方法二、实验原理高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中，采用保留值定性，或与其它定性能力强的仪器分析法（如质谱法、红外吸收光谱法等）联用。
在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式，同样适用于高效液相色谱：速率理论及范弟姆特方程式对于研究影响高效液相色谱柱效的各种因素，同样具有指导意义：由于组分在液体中的扩散系数很小，纵向扩散项（B/u）对色谱扩展的影响可以忽略不计，而传质阻力项（Cu）则成为影响柱效的主要因素，提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度，以加快传质速率，可提高液相色谱的柱效能。
目前常使用的固定相直径为5~10mμ。
液相色谱除了上述影响柱效的一些因素外，还应考虑到一些柱外展宽的因素。
三、实验用品1．仪器高效液相色谱（任一型号）紫外光度检测器恒流泵或恒压泵溶剂过滤系统高压六通进样阀微量进样器（100μL）超声波发生器2．药品苯、萘、联苯、甲醇（均为A.R）纯水（去离子水，再经一次蒸馏）标准贮备液分别配制浓度为1000μg · mL－1的苯、萘、联苯的甲醇溶液。
标准工作液将上述标准贮备液用甲醇稀释10倍，配成苯、萘、联苯的浓度分别为100μg · mL－1的甲醇溶液。
混合样品苯、萘、联苯四、操作步骤1．测定条件的选择（1）色谱柱长250 mm，内径 4.6 mm，装填C-18 烷基键合相，颗粒度10μm的固定相（2）流动相甲醇:水（83:17），流量1.0 mL· min－1（3）紫外光度检测器测定波长254 nm（4）进样量20μL2．仪器操作（1）将配置好的流动相于超声波发生器上，脱气15 min。
高效液相色谱实验
高效液相色谱实验The document was prepared on January 2, 2021高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习基础分析化学实验第二版137－140页.目的(1)了解高效液相色谱仪的工作原理；(2)学习评价液相色谱反相柱的方法.原理高效液相色谱是色谱法的一个重要分支.它采用高压输液泵和小颗粒的填料,与经典的液相色谱相比,具有很高的柱效和分离能力.色谱柱是色谱仪的心脏,也是需要经常更换和选用的部件,因此,评价色谱柱是十分重要的.而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常.评价色谱柱的性能参数主要有：（1） 柱效理论塔板数n式中t r 为测试物的保留时间,W 1/2为色谱峰的半峰宽.（2） 容量因子k’式中t 0为死时间,通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间.(3)相对保留值选择因子α式中k 1’和k 2’分别为相邻两峰的容量因子,而且规定峰1的保留时间小于峰2的.(4)分离度R s式中t r1、t r2分别为相邻两峰的保留时间,W b1、W b2分别为两峰的底宽.对于高斯峰来讲,W b =2.为达到好的分离,我们希望n 、α和R s 值尽可能大.一般的分离如α=,R s =,需n 达到2000.柱压一般为104 kPa 或更小一些.本实验采用多核芳烃作测试物,尿嘧啶为死时间标记物,评价反相色谱柱.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i 进样器,440检测器和记录仪组成色谱柱：5 cm × mm ., YWG-C 18H 37 ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20样品I ： 含尿嘧啶 mg ·mL －1、萘 mg ·mL －1、联苯 mg ·mL －1、菲 mg ·mL －1的甲醇混合溶液；样品I I ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液.溶液浓度约为·mL －1；实验内容（1） 准备流动相.将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL 溶液,混合均匀并经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中.（2） 检查电路连接和液路连接正确以后,接通高压泵、检测器和记录仪的电源.设定操作条件为：流速 mL ·min －1,压力上限2′104 kPa 约3000 psi,检22/1r )/(54.5W t n =00r /)('t t t k -=12'/'αk k ＝)/()(2b2b1r1r2s W W t t R +-=测波长254 nm 该仪器检测波长已固定,灵敏度 AUFS,记录仪走纸速度 cm ·min －1,记录灵敏度为5 mV.开启记录仪走纸开关记录基线.并调节基线到合适位置一般为距右10%处.（3） 待基线平稳后建议观察检测器的读数显示,将进样阀手柄拨到“Load ”的位置,使用专用的液相色谱微量注射器取5μL 样品注入色谱仪进样口,然后将手柄拨到“Inject ”位置,同时按一下检测器的标记按钮,同时计时,记录色谱图.（4） 重复3的实验两次.（5） 用同样方法进纯样品的甲醇溶液,确定出峰顺序.（6） 根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽,然后计算色谱柱参数n 、k’,以及相邻两峰的α、R s（7） 将流速降为0,待压力降为0后关机.思考题1. 高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点2. 如何保护色谱柱延长使用寿命高效液相色谱实验II固相萃取水样中的多核芳烃并以内标法测定其含量目的（1） 学习固相萃取法处理样品；（2） 用内标法定量.原理固相萃取法是色谱法的一个重要的应用.在此方法中,使一定体积的样品溶液通过装有固体吸附剂的小柱,样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附；然后,用强洗脱溶剂将被吸附的组分洗脱出来,定容成小体积被测样品溶液.使用固相萃取法,可以使样品中的组分得到浓缩,同时可初步除去对感兴趣组分有干扰的成分,从而提高了分析的灵敏度.固相萃取不仅可用于色谱分析中的样品预处理,而且可用于红外光谱、质谱、核磁共振、紫外和原子吸收等各种分析方法的样品预处理.C18固相萃取小柱具有疏水作用,对非极性的组分有吸附作用,因此可以从水中将多核芳烃萃取出来,完成浓缩样品的作用.固相萃取小柱还有其他类型,如极性、离子交换等.内标法的原理是,设在V mL 样品中含有W i g 待测组分i,加入W S g 内标物S,混匀后进样,得组分i 及内标物S 的峰面积分别为A i 及A S .由于峰面积正比于通过检测器的物质量,所以有：W i =f i A iW S =f S A S式中f i 、f S 分别为组分i 和内标S 的校正因子.两式相除,得所以,组分i 的体积浓度为：S Si S i i W A A f f W ⋅⋅=V W A A f V W A A f f VW SS i i S S i S i i '⋅⋅=⋅⋅=fi’可用已知被测物i和内标物浓度的样品进样分析得到.内标法是一种相对测量方法,因此,进样量不必准确,操作条件稍有变化对结果没有什么影响.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i进样器和440检测器组成色谱柱：5 cm× mm ., YWG-C18H37ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20 流速： mL·min－1检测波长：254 nmC18固相萃取小柱：2支25 mL移液管：1支50 mL医用注射器：1支10 mL医用注射器：2支2 mL容量瓶：2个样品I：内标标准样,含萘 mg·mL－1、联苯 mg·mL－1、菲 mg·mL－1的甲醇溶液.样品II：内标物溶液.含联苯 mg·mL－1的甲醇溶液.样品III：含萘、菲的被测水样.实验内容（1）固相萃取小柱预处理：用10 mL注射器将2 mL甲醇压过小柱,再将2 mL 纯水压过小柱.（2）用移液管取25 mL水样,用50 mL注射器压过小柱,这时水样中的萘和菲被吸附在小柱上.在小柱下端承接一2 mL的容量瓶,将约 mL甲醇用10 mL 注射器压过小柱到容量瓶中,加入一定量内标联苯溶液,定容摇匀,得到浓缩的样品.（3）按“实验I”中的步骤,进样分析内标标准样和浓缩样品各三次.（4）取平均结果,计算峰面积A s和A i；根据内标标准样的浓度计算f i’,再计算出浓缩样品中的萘和菲的浓度,进而计算出原水样中的浓度mg·mL－1.思考题1.内标法与外标法各有哪些特点本实验为什么采用内标法为好2.为什么要对色谱分析中的样品进行预处理简单列出三个以上的原因.。
高效液相色谱柱效能的测定
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
特点： 灵敏度高； 10-9g·mL-1 线性范围宽； 对流动相的流速和温度 变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱效能的测定
一、实验目的： 1.学习高效液相色谱柱效能的测定方法。 2.了解高效液相色谱仪的基本结构及工作原理。 3.初步掌握高效液相色谱仪的操作及使用。
应的流动相并过滤脱气。 二、开 机 1.依次打开2130高压泵、检测器和计算机电源开关，
设定合适的检测波长。 2.双击桌面上的T2000P色谱工作站图标，进入工作站
系统。
三、编辑HPLC分析方法 1.双击“方法”图标，编辑HPLC分析方法。 2. 保存所编辑的HPLC分析方法。 四、样品分析与采集数据 1.在文件栏中选择分析方法文件。 2.手动进样: 在方法栏中依提示输入文件名称、样品
己烷（分析纯）、甲醇（色谱纯）、水为二次蒸馏 水
四、实验条件：
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
2、主要部件
（1）、进样装置
使用高压定量进样阀(六通阀)进样装进样体积 由定量管控制，进样准确，重现性好，适于定量 分析。
高效液相色谱实验技术问题解答
高效液相色谱实验技术问题解答高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测。
1、高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的? 解：气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件，从它的高效、高速和高灵敏渡得到启发，采用5一10四微粒出定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流速;设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱曲缺点，从而达到高效、快速、灵敏。
2、与气相色谱法相比高效液相色谱有哪些优点和不足? 解：气相色谱的分析对象是在校温下具有一定的挥发性、对热稳定购物质。
因此它只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。
而高效液相色谱由于以液体作为流动相，只要被分析的物质在选用的流动相中有一定的按解度，便可以分析，所以适用性广，不受样品挥发性和热稳定性的限制，特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物，例如，生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。
在目前已知的有机化台物中，只有20%样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离，80%的有机化合物要用高效液相色谱分析。
气相色谱中流动相是惰性的，它对组分没有作用力，仅起运载作用、而高效液相色谱的流动相不仅起运载作用，而且流动相对组分有一定亲合力，可以通过改变流动相种类和组成提高分离的选择性，另外可作流动相的化合物多，选择余地广。
与气相色谱相比，高效液相色谱的另一个优点是样品的回收比较容易，只要开口容器放在柱子末端，就可以很容易地将所分离的各组分收集。
回收是定量的，可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。
高效液相色谱不足的是，日前检测器的灵敏度不及气相色谱。
必须特别注意“柱外效应”对柱效率及色谱分离的影响。
3、试比较气相色谱与液相色谱的H-u曲线，分析产生不同的原因。
解：从图可看出，气相色谱和液相色谱得到的H-u曲线，形状迥然不同，流动相的流速对柱效的影响也不一样，在气相色谱的H-u曲线上，塔板高度H随u变化呈双曲线.曲线有一最低点，这时柱效最高，板高最小，流速最佳。
高效液相色谱结果分析
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收 试验法”和“加样回收试验法”。
(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定， 测定值为 M
回收率
M - 空白
R=
X 100%
A
(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
回收率 R = M - P X 100% A
数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如 高、中、低三个不同浓度样品各测三次.
4.精密度(precision)
（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!
3.准确度(accuracy)
准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近 的程度，用百分回收率表示。
相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度,应 控制在100%左右(95%～105%)。
Unacceptable t=2
Awful t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线波 动.
基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变化.
分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同 的实验者对同一样品的分别测试而获得的。(获得的这 种再与正常检定下的精密度进行比较,从而确定该法的 耐用性,或称粗放度).
高效液相色谱法
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特点： 特点： 氰基键合相选择性与硅胶类似 键合相选择性与硅胶类似， ① 氰基键合相选择性与硅胶类似， 但极性更小。相同流动相， 但极性更小。相同流动相，组分保留 时间小于硅胶。 时间小于硅胶。 氨基键合相 主要用于糖类分析， ② 氨基键合相 主要用于糖类分析， 糖类分析专用柱 分析专用柱。 是糖类分析敏度： 紫外、荧光、电化学、 紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏 度检测器使用。 度检测器使用。 最小检测量： 最小检测量： 10-9 ~10-11 g 4. 高度自动化： 高度自动化： 采用色谱专家系统为核心的色谱智 能化和仿真优化技术， 能化和仿真优化技术，使 HPLC不仅能 不仅能 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 而且还可以自动控制色谱条件。 而且还可以自动控制色谱条件。
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2. 流动相极性与容量因子的关系 流动相极性大，洗脱能力增加， 流动相极性大，洗脱能力增加， k 减小，tR 减小；反之， k 与 tR 均 减小， 减小；反之， 增加。 增加。 极性小的组分先出柱
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四、正、反相色谱法 正相HPLC（normal phase HPLC） （ 正相 ） 固定相： 固定相：极性 常用：改性硅胶 硅胶、 常用：改性硅胶、氰基柱 流动相: 非极性（或弱极性） 流动相 非极性（或弱极性） 常用： 正己烷 常用： 流动相极性小于固定相极性
11
第二节 分离机制 一、液-固吸附色谱法 固吸附色谱法
(Liquid-Solid Chromatography)
（一）吸附机理 根据吸附剂对样品中各组分的吸 根据吸附剂对样品中各组分的吸 附能力差异而分离 而分离。 附能力差异而分离。 吸附过程是被分离组分的分子 与流动相分子争夺吸附剂表面活性 中心(active center)的结果。 的结果。 中心 的结果
高效液相色谱柱柱效测定
高效液相色谱柱柱效测定高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察一、实验目的1(了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理2(学习高效液相色谱仪的使用3(学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法4(考察流动相配比对分离情况的影响二、基本原理高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即:22,,tt,,RR,,n,5.54,16 ,,,,YY,,,1/2,式中:t为组分的保留时间 RY为色谱峰的半峰宽度 1/2Y为色谱峰的峰底宽度影响高效液相色谱分离的因素很多，其中，流动相的种类及配比是最重要的参数。
三、仪器和试剂1(仪器:Agilent 1200 高效液相色谱仪(紫外检测器)(50μL微量进样器 23(试剂:苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯;纯水为重蒸的去离子水。
配制成含苯、萘、联苯各30μL/ml 的甲醇溶液。
四、实验条件1(色谱柱长15cm，内径 4.6mm，装填5,m的C-18烷基键合固定相2(流动相组成1:甲醇:水(95:5);组成2:甲醇:水(85:15);流量均为0.8ml/min 3(紫外光度检测器波长254nm4(进样量5μL五、实验步骤1(设定流动相为“组成1”的比例，按照标准操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，且色谱基线达到平直时，开始进样。
2(吸取5μL苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，在此条件下用色谱工作站记录色谱数据。
3(改变流动相比例至“组成2”，待平衡后重复步骤2操作。
4(用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。
六、数据记录及处理(记录实验条件。
1(1)色谱柱与固定相(2)流动相及其流量、柱前压(3)检测器波长(4)进样量2(分别记录三个组分色谱峰的保留时间t和相应色谱峰的半峰宽Y。
R1/23(分别计算苯、萘、联苯在两种流动相组成条件下的理论塔板数n，并比较流动相组成改变前后色谱分离的差异。
HPLC柱效测定
HPLC柱效测定
以第一主数据为例
n=)2=2=201.881
柱长25cm
H===0.001238
思考题
1、高效液相液相色谱采用3~10微米的固定相有何优点?同时它又给实验带来什么问题?如何克服？
答：这个是从色谱理论H-u曲线推导出来的结果.在100kg压力左右,5微米的柱效最高.但随加工制造技术的提高,更高压力的泵如400kg,也能够大量的普及.而在400kg左右,1-3微米的固定相柱效更高,所以在HPLC的基础上又有UPLC仪器了.
2、紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物,为什么?
答：不是理由有2 ，第一是并不是所有的有机物都有强的特征紫外吸收，只有特定的集团会有这样的情况。
第二是有频率相近的吸收峰的物质很多，不能完全区分开来。
3、若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改善实验条件色谱柱？
答：色谱柱使用时间长了，柱效会降低，会影响到分离度的，改善方法是更换新的色谱柱。
如果已经是新的色谱柱了，分离度还不好，那可以采用更长一些的色谱柱，也会增加分离度；流动相的调节，通过调节流动相中各组分的比例，使流动相的极性发生变化，分离效率会不一样，这要针对要检测的成分具体情况进行分析确定；改变柱温，相同条件下升高柱温，会增大色谱柱的分离能力而提高分离度。
高效液相色谱法快速测定环境空气中13种醛酮类化合物
化学分析计量CHEMICAL ANAL Y SIS AND METERAGE第30卷，第5期2021年5月V ol. 30，No. 5May 202165doi ：10.3969／j.issn.1008–6145.2021.05.015高效液相色谱法快速测定环境空气中13种醛酮类化合物李少飞1，姜丽丽2，孙延康1（1.山东省烟台生态环境监测中心，山东烟台 264000； 2.山东润平环境科技有限公司，山东烟台 264000）摘要 建立高效液相色谱法快速测定环境空气中13种醛酮类化合物的方法。
选用Poroshell 120 SB–C 18色谱柱（250 mm ×4.6 mm ，4 μm ）为分离柱，以水–乙腈溶液为流动相，梯度洗脱，流量为1.5 mL ／min ，柱温为50 ℃，进样体积为10 μL ，采用紫外检测器检测，检测波长为360 nm 。
13种醛酮类化合物的质量浓度在0.05～2.0 μg ／mL 范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均不小于0.999 8，方法检出限为0.16～0.47 μg ／m 3。
空白样品加标回收率为97.2%～101.1%，测定结果的相对标准偏差为0.5%～4.3%（n =6）。
该方法分析速度快，准确度和灵敏度高，精密度好，适用于环境空气中醛酮类化合物的快速测定。
关键词 醛酮类化合物；高效液相色谱法；快速测定；环境空气中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：1008–6145(2021)05–0065–05Rapid determination of 13 aldehydes and ketones in ambient air by high performance liquid chromatographyLi Shaofei 1, Jiang Lili 2, Sun Y ankang 1（1. Y antai Ecological Environment Monitoring Center of Shandong Province, Y antai 264000, China ；2. Shandong Runping Environmental Technology Company, Y antai 264000, China ）Abstract A method for the rapid determination of 13 aldehydes and ketones in ambient air by high performance liquid chromatography was established. Poroshell 120 SB–C 18 column(250 mm ×4.6 mm ，4 μm) was used as the separation column, water and acetonitrile solution were used as mobile phase with gradient elution, flow rate was 1.5 mL ／min, column temperature was 50 ℃, injection volume was 10 μL, and detection wavelength was 360 nm. The mass concentration of 13 aldehydes and ketones had a good linear relationships with the chromatographic peak area in the range of 0.05–2.0 μg ／mL, the correlation coefficients were all not less than 0.999 8, and the detection limits were 0.16–0.47 μg ／m 3. The recoveries rate of standard addition in blank sampling were 97.2%–101.1%, and the relative standard deviations of determination results were 0.5%–4.3%(n =6). The method is sensitive, precise, rapid, accurate and ef fi cient, which is suitable for the rapid determination of aldehydes and ketones in ambient air.Keywords aldehydes and ketones; high performance liquid chromatography; rapid determination; ambient air醛酮类化合物是环境空气中常见的含氧有机污染物，主要来源于化石燃料、生物质燃烧、化工、建筑、木材加工及防腐、汽车尾气等。
高效液相色谱法介绍(一)
使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用 一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的 作用，常用的溶剂组合 洗脱剂：一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为： 石油迷<己烷<苯<乙醚<THF（次氢呋喃）<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 极性较大的用甲醇：氯仿系统 极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
七、常见故障的排除
故 泵启动不良
障
故 障 原 因 （1）溶剂水平面太低 （2）溶剂中有气泡析出 （1）色谱柱超负荷 （2）非缓冲流动相使酸性 或碱性样品的色谱峰 发生拖尾 （1）柱子超负荷 （2）样品组分在柱子上积 聚，柱子沾污柱效变 坏 （3）柱填料与流动相未完 全达到平衡 （1）柱子被玷污，柱效下 降 （2）固定相流失 （3）梯度系统对色谱柱 （固定相）不合适. （4）柱温过高 （5）流动相强度太高
峰形不好，出现平头峰或拖 尾峰
分离度下降
保留时间减少
故
障
故 障 原 因 （1）温度不稳 （2）泵启动不良 （3）溶剂中有气泡 （1）长时间的基线漂移可 能由于室温波动引起 （2）池座垫圈漏液 （3）流通池污染 （4）UV灯不亮 （1）样品阀，进样垫或注 射器被污染 （2）溶解样品溶剂的洗脱 峰 （3）样品溶液中有气泡 （4）梯度洗脱溶剂不纯 （特别是水） （1）电源线内部折断 （2）灯启动器有毛病 （3）UV灯泡有毛病 （4）保险丝断开
a.光源（氘灯）发出的光经聚光透镜聚焦，由可旋转组合滤光片滤 除杂散光，再通过入口狭缝至下面反射镜，经反射到达光栅，光 栅将光衍射色散成不同波长的单色光，当某一波（190nm~600nm） 的单色光经平面镜反射，反射至分束器时，透过光分束器的光通 过样品的流通池，最终到达检测样品的光电二极管测量；被光分 束器反射的光到达检测基线波动的参比光电二级管；当获得测量 和参比光电二极管的信号差，即为样品的检测信息。 b.可变波长紫外吸收检测器的某一时刻只能采集某一特定波长的 吸收信号。 光栅的偏转可由预先编制的采集信号程序加以控制，以便于采 集某一特定波长的吸收信号，并可使色谱分离过程洗脱出的每 个组分峰都获得最灵敏的检测。
高效液相色谱
应用
由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、 适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工 业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用 极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化 合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固 醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。
液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统由 两相——固定相和流动相组成。液相色谱的 固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或 在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换 树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进 入色谱柱。根据各组分在固定相及流动 相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均 匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称 现代液相色谱。
敏感，且不适于梯度淋洗。
平面镜
样品
透镜
遮光板
光源
参比
光学零
光电转换 调零
放大器
记录仪
荧光检测器
许多有机物具荧光活性， 尤其是芳香族化合物具有很 强的活性。荧光检测器是一 种选择性很强的检测器，其
灵敏度比UV检测器高2～个数
量级。
电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电 阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。
流程及主要部件
流程
高效液相色谱(HPLC)柱效测定
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定093858 张亚辉一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％检测器：DAD检测器;检测波长：220nm；进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。
高效液相色谱法 中国药品检验标准操作规范 2010年版
高效液相色谱法高效液相色谱法（《中国药典》2010年版二部附录V D）系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期鉴定并符合有关规定。
1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm（1nm=10Å）以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂一般在3~10μm之间。
粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。
流动相的pH指应控制在2~8之间。
当pH指大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH指小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
高效液相色谱法
液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相
（四） 亲和色谱固定相
亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
高效液相色谱法(HPLC)简介
高效液相色谱法分离过程
主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次 差别： 是检测手段和输液设备。
经典液相色谱 固定相： 粒度：60~600μｍ（多孔） 柱长：10~200cm（d=10~50mm） n 约为 2~50/m
流动相：靠重力输送
经典液相色谱无在线检测器
缺点：
①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻 力大。 ②无检测设备，分析速度慢、效率低。 只能作为分离手段
（3）不能完全替代气相色谱
（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的
Hale Waihona Puke 生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，
不是尽善尽美的。
第二节 高效液相色谱法的基本理论
一、高效液相色谱参数 1.定性参数 tR 、 t 0 、 t’ R t’R= tR- t0 2.柱效参数 σ、 W1/2 、W W=4 σ 或 w=1.699W1/2 n=（ tR / σ）2 H=L/n
四、高效液相色谱法的应用范围和局限性
1.应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易 分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性 物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。 涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品 及环境污染物。约占全部有机物的80%。 2.方法的局限性
（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境 （2）缺少通用检测器
美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200 年。出版发行了25版药典。 75年（19版）将HPLC载入药典 20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项； 24版-含量测定法：1386项 鉴别：519项 杂质检查：206项
如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为 反映各国药典先进性的重要指标之一。
高效液相色谱仪的测定原理
一． 实验目的：
1． 学习高效液相色谱法的测定原理；
2． 了解并掌握高效液相色谱仪（HP1100） 的基本构造。
二． 实验原理：
高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典 液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的，（经 典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、 长玻璃管柱内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质 在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入口压力 低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类 似，流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的 有机化合物，配合程序升温可分析高沸点的有机化 合物。）弥补了经典液相色谱法和气相色谱的缺点。
（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类
等）。
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、
C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、
异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以
调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化
合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统
计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应 用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样
品或易解离样品的分析。为控制样品在分
析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的 pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值 会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷 基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范定相极性 流动相极性 组分洗脱次序
5． 检测器：常用的有紫外检测器 （VWD），光电二极管矩阵检测器（DAD）折光指 数检测器（RID），电导检测器（ECD），荧光检测 器（FD）。
折光指数检测器（RID），电导检测器 （ECD）分别测定柱后流出液的总体折射率和电 导率，测定灵敏度低，易受流量和温度的影响，造 成较大的漂移和噪声，不适合痕量分析。
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四、实验条件
1. 2. 3. 4. 色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm ID× 15cm，5μm） 流动相：甲醇:水（80:20） ；流速：1.0 ml/min 紫外光度检测器：波长 254nm 进样量：10 μl
五、实验步骤
1. 2. 3. 4. 5. 6. 依次打开仪器和 PC，打开色谱工作站，编辑方法 待基线平衡后即可进样 分别吸取 10μl 甲苯和苯甲酸钠溶液进样 用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据 冲洗色谱柱，关机 根据理论塔板数公式，分别用甲苯和苯甲酸钠计算其理论塔板数
高效液相色谱柱柱效测定
一、实验目的
1． 了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理 2． 学习高效液相色谱仪的使用 3． 学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法
二、基本原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法。 当混合物随流动相流经色谱柱 时，就会与固定相及流动相发生作用。由于混合物中各组分在理化性质和结构上的差异，与 固定相及流动相间产生的作用力不同， 因此在同一推动力的作用下， 不同组分在固定相滞留 时间长短不同，随流动相先后从色谱柱流出，从而达到分离。配以适当的检测器可对不同组 分进行定性和定量分析。 色谱柱柱效评价可根据单位柱长的理论塔板数，即：
n 5.54(
或
tR 2 ) ：n-理论塔板数；tR 为组分的保留时间；W1/2-色谱峰半高宽度；W-色谱峰底宽
三、仪器和试剂
1. 2. 3. 仪器：Agilent 1100 高效液相色谱仪（紫外检测器） 微量进样器 试剂：甲苯（30 mg/L 甲醇溶液） ；苯甲酸钠（30mg/L 水溶液）
六、思考题
1．试比较本实验利用不同物质计算出的理论塔板数有何不同，为什么？ 2．紫外光度检测器是否适用于检测所有有机化合物，为什么？