维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用

)>$发酵液在<+++@／>AB下离心#>AB后，上清液分别用乳酸脱氢酶法［#］、苯酚0硝普 盐法［’］和,，#0二硝基水杨酸法分析丙酮酸浓度、铵离子浓度和葡萄糖浓度。在摇瓶发酵 液离心得到的菌体中加入!>$!>D;／$的盐酸（上罐不用加），溶解沉淀中的 :=:5,，离心 弃去上清液后用蒸馏水洗涤两次，菌体在(+?下烘干至恒重后称重。发酵过程中乙醇浓 度用本研究室研制的乙醇浓度监测仪［%］在线监测。
定的。具体实验方案及结果见表N。
表! $#%（&’）正交试验结果"
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积累。根据这一思路，经不断筛选和物理、化学诱变，得到了一株光滑球拟酵母 -./0 12,+,，该菌株不能合成硫胺素、烟酸、生物素和吡哆醇，这四种维生素分别是 2E/、2E:、 2:和转氨酶的辅因子，在发酵培养基中控制这些维生素处于亚适量水平，就有可能使
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微生物学报
M) 卷
"#$%&’()(中负责丙酮酸降解的酶的活性很 低，从而实 现 丙 酮 酸 的 过 量 合 成。 此 外，由 于
（&E&!;7／F以下），而将吡哆醇、生物素和核黄素的量控制在最适水平，同时适当增加烟 酸浓度，有可能在保持较高产率的基础上，提高葡萄糖消耗速度，从而提高生产强度。
图! 正交试验直观分析!
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酸）的发展，因此，采用发酵法生产丙酮酸，以求降低其生产成本，对推动丙酮酸及其相关
工业的发展，意义重大。
发酵法生产丙酮酸的研究始于本世纪#"年代。由于丙酮酸在代谢途径中所处的特 殊地位，使得丙酮酸高产菌株的选育十分困难。在关于发酵法生产丙酮酸的众多论文和 专利中，FGHI,I和 J’K.BI/I［%，$］报道的 !"#$%"&’(’)%*+#*-*<L*"""#经86B流加发酵，丙 酮酸产量达87)4@／A（对葡萄糖产率")!3!@／@）和 J’M’,I［6］报道的缺乏L%5ND=酶活力的 ./0"%( 经$!B发酵，丙酮酸产量达 6"@／A（ 对 葡 萄 糖 产 率 ")8@／@），是 目 前 该 领 域 研 究 的 最高水平。国内在发酵法生产丙酮酸上尚属空白。根据切断丙酮酸降解途径，从而使其
中图分类号：DE3$%>7 文献标识码：1 文章编号："""%58$"3（$"""）"#5"#$456!
丙酮酸是糖代谢途径中最重要的中间产物，是多种氨基酸、维生素及其它一些有用物
质的重要前体，在化工、制药及农用化学品工业中有着广泛的用途。目前市场上的丙酮酸
产品多为化工合成，价格较高，限制了以丙酮酸为原料的产品（如左旋多巴、色氨酸和酪氨
从正交试验的直观分析图（图!）可以看出，在所选择的浓度范围内：（%）硫胺素是影 响 ?@ABCD#&#细胞生长、葡萄糖消耗及产酸的最重要因素；（!）增大吡哆醇、生物素和核 黄素的浓度，对细胞生长和葡萄糖消耗没有显著影响，但对产酸有一定的促进作用； （#）增 大烟酸浓度可促进耗糖，但不利于产酸。据此，若将硫胺素的量控制在一个比较低的水平
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源生长和产酸，这是实现工业化的有利 条件，也使得观察维生素的影响变得十 分容易。作 者 发 现，除 了 烟 酸、吡 哆 醇、 硫胺素和生物素之外，适宜浓度的核黄
素也会促进 "#$%&’()(产酸，究其原因，有可能是核黄素的添加加速了电子传递，从而加
快酵解。为了考察这五种维生素对丙酮酸发酵的影响，作者按照 K!L（MJ）正交试验因素水 平表（表!）安排正交试验（表N），其中各种维生素的浓度范围是通过前期的单因素试验确
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李 寅等：维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用
"江苏省“九五”工业重大科技攻关项目（1234"%#56） ""责任作者 作者简介：李寅（%37!5），男，上海人，无锡轻工大学生物工程学院博士，讲师，主要从事生化工程和环境生物技术 研究 收稿日期：%3335"#5"7，修回日期：%3335"75%$
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李 寅等：维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用
关系。
表! K!L（MJ）正交试验因素水平表
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D124/! K/>/40124/3;;1?03<5+AK!L（MJ）3<083,3A14/C7/<+6/A0 的遗传标记，但 "#$%&’()(的优点在于
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（无锡轻工大学 生物工程学院 环境生物技术研究室 无锡 $%!"68）
芮新生
（常州曙光化工厂 常州 $%6"%8）
摘 要：研究了烟酸、硫胺素、吡哆醇、生物素和核黄素对一株光滑球拟酵母（!"#$%"&’(’)%*+#*, -*）9:;5<=6"6以葡萄糖为碳 源、以 氯 化 铵 为 唯 一 氮 源 生 产 丙 酮 酸 的 影 响。 利 用 正 交 试 验 方
积累株 -./0123!［)］经再次诱变筛选获得，保留原有遗传标记（硫胺素、生物素、烟酸和吡 哆醇的营养缺陷型），其特点是能利用氯化铵或尿素为唯一氮源进行生长和产酸。
!"# 培养基 !"#"! 斜面和种子培养基：葡萄糖!+*，蛋白胨 3+*，4/!25)3*，6*.5)·%/!5+"#*，琼 脂!+*（斜面用），7/#8#，自来水定容至3$。 !"#"! 发酵培养基：葡萄糖3++*，9/):;%*，4/!25)#*，4:;#*，6*.5)·%/!5+"<*， :=:5,)+*（摇瓶时添加），7/#8+，自来水定容至3$。烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、生 物素和核黄素根据实验需要添加。
大量积累的研究思路，筛选获得一株光滑球拟酵母（!"#$%"&’(’)%*+#*-* ）9:;5<=6"6，该 菌株 是 烟 酸、硫 胺 素、吡 哆 醇 和 生 物 素 四 种 维 生 素 的 营 养 缺 陷 型，与 !/)%*+#*-* <L*"""#［%，$］相比，该菌株的独特之处在于能够很好地利用无机氮源（如氯化铵和尿素）。 本文首先考察了不同维生素浓度组合对 9:;5<=6"6过量合成丙酮酸的影响，发现硫胺素
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维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用"
李 寅 陈 坚"" 伦世仪
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时，.+:101用单因素试验确定了烟酸、吡哆醇、 硫 胺 素 和 生 物 素 的 最 适 浓 度，并 认 为 烟 酸 是
图! "#$%&’()(中丙酮酸的代谢途径
*+,-! ./01234+56710891:3;7:<=>+?1?+@ +A!"#$%&’%(% "#$%&’()(
&*I)))J生产 丙 酮 酸 最 重 要 的 维 生 素。 实 际 上，由 于 有 机 氮 源 中 或 多 或 少 含 有 一 些 维 生