Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化

第24卷第2期2018年4月

（自然科学版）

JOURNAL OF SHANGHAI UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)

Vol.24No.2

Apr.2018

DOI:10.12066/j.issn.1007-2861.1773

Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化

邱实1,张文举1,许馥慧2,邓志瑞1

(1.上海大学生命科学学院,上海200444;2.同济大学生命科学与技术学院,上海200092)

摘要:转基因植株的再生频率较低一直是植物基因工程研究的瓶颈之一.以番茄的Micro-Tom突变体为材料,探索了外植体植物激素配比、预培养时间、共培养时间、筛选剂对愈伤组织发生和不定芽生长的影响.结果表明:子叶比下胚轴更适合作为愈伤组织和不定芽诱导的外植体;当玉米素(zeatin,ZT)质量浓度为0.5mg/L,吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)质量浓度为1.0mg/L时最有利于不定芽诱导;外植体预培养的适宜时间为3d,农杆菌和外植体共培养的适宜时间为2d;外植体对卡那霉素的耐受上限为40mg/L,替门汀的适宜质量浓度为150mg/L.实验所建立的转基因再生体系为Micro-Tom番茄的遗传工程应用奠定了基础.

关键词:Micro-Tom番茄;玉米素;替门汀;遗传转化;农杆菌

中图分类号:S641.2文献标志码:A文章编号:1007-2861(2018)02-0322-09 System optimization for tomato Micro-Tom transgenic

regeneration

QIU Shi1,ZHANG Wenju1,XU Fuhui2,DENG Zhirui1

(1.School of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai200444,China;

2.School of Life Sciences and Technology,Tongji University,Shanghai200092,China)

Abstract:Low redifferentiation frequency of transgenic plant is a major barrier in plant gene engineering.Tomato species Micro-Tom was used as the experimental material.

Effects of plant hormone combination,preculture time,and co-culture time of kanamycin and timentin on callusogenesis and adventitious bud growth were explored.The results show that cotyledon is more suitable than hypocotyledon as explants for callusogenesis and adventitous bud bination of0.5mg/L zeatin(ZT)with1.0mg/L indole acetic acid(IAA)brings about the highest adventitous bud induction.Suitable preculture time for explants is3d,and that for co-culture with Agrobacterium tumefaciens is2d.

The upper tolerance limit of explant to kanamycin for selection is40mg/L and suitable timentin concentration for Agrobacterium tumefaciens inhibition is150mg/L.The estab-lished system may provide a good base for genetic engineering for Micro-Tom tomato.

Key words:Micro-Tom tomato;zeatin(ZT);timentin;genetic transformation;Agrobac-terium tumefaciens

番茄(Solanum lycopersicum)作为重要的模式植物,其基因组大小为950Mbp,共编码35000个基因,遗传学背景较为清楚.Micro-Tom是一种番茄突变体,具有生命周期短、株型收稿日期:2016-04-25

通信作者:邓志瑞(1964—),男,副教授,博士,研究方向为植物生理与分子生物学.

E-mail:dengzhirui@

第2期邱实,等:Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化323

矮小,比普通番茄更适合用于遗传转化的特点[1-2].但与其他植物一样,Micro-Tom在遗传转化后往往出现愈伤组织和再生植株诱导频率下降的问题.这主要与所使用的遗传转化条件和植株再生体系有关.

有研究表明,外植体的选用对于愈伤组织诱导和植株再生有较大的差异.卡那霉素常被用来筛选转基因阳性候选植株,但过高浓度的卡那霉素也会对候选植株的生长造成影响.不同的外植体所适用的浓度有所不同[3],一般用量为100∼200mg/L[4].在遗传转化体系中,往往选用羧苄青霉素或头孢霉素作为抑菌抗生素,用于抑制多余农杆菌和杂菌的生长,但因用量较大,在一定程度上也会抑制外植体的生长[5].替门汀作为相对较新的抑菌抗生素,其抑菌应用在选择培养过程中还处于早期尝试阶段.

本实验选用番茄Micro-Tom的子叶和下胚轴作为外植体,以愈伤组织发生和不定芽的生长作为指标,对植物激素配比、预培养时间、共培养时间、抗生素浓度等参数进行了探索,初步建立了番茄Micro-Tom的遗传转化体系,为后续的遗传转化研究奠定了基础.

1实验材料与方法

1.1实验材料

外植体来源与选择.首先将Micro-Tom种子(PanAmerican Seed公司)依次用75%乙醇、20%次氯酸钠和无菌水进行灭菌处理,然后将种子置于种子萌发培养基(1/2MS+3%蔗糖+0.2%植物凝胶)中进行培养.1周后种子萌发并生长到子叶期.选取幼苗子叶和下胚轴,分别切成0.5cm2的叶盘和0.5cm的茎段,置于预培养基中,使切口接触培养基.

菌种、质粒与引物.用于转化的农杆菌株为ATHV(KWS种子公司),载体质粒为含抗卡那霉素的nptⅡ基因pGPTV-ESK1i(KWS种子公司).根据载体质粒的外源DNA片段(同一片段正向和反向插入在不同的位置)序列设计了用于鉴定转基因阳性植株的一对引物(由上海生工生物工程公司合成).正向引物pRNAintroF序列为5’-GGAAAATGTCGTGTTGTGGTC-3’;反向引物pRNAiterR序列为5’-CCTGCAGGTCACTGGATT-3’.两个引物间的片段长度为720bp,如果其聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物长度为720bp,就说明携带外源基因的质粒进入了植物组织.

培养基的制备.MS培养基、1/2MS培养基购自于Phyto Technology公司;蔗糖、植物凝胶、吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)、玉米素(zeatin,ZT)、卡那霉素、替门汀等均购自于上海生工生物工程公司.激素和抗生素采用过滤灭菌,在培养基灭菌后且未冷却时加入.预培养基、共培养基、选择培养基、生根培养基的基本组分均为MS+3%蔗糖+0.2%植物凝胶.

农杆菌的制备与侵染.将携带表达载体质粒的农杆菌单菌落置于YEB培养基中,28◦C 黑暗条件下震荡培养.OD600=1.0时收集菌体,悬浮于MS培养基中.侵染预培养后的外植体10min,并用无菌滤纸吸去外植体表面的多余菌液.将侵染后的外植体置于共培养基上,28◦C 避光培养.

转基因植株的鉴定.DNA提取使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程公司),PCR反应使用即用型PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程公司).

1.2实验方法

1.2.1ZT浓度对愈伤组织发生和不定芽生长的影响

选取IAA作为组织培养的生长素,ZT作为细胞分裂素.培养基中保持IAA质量浓度为1.0mg/L不变[6],同时加入不同浓度的ZT进行配比组合.将子叶和下胚轴外植体置于培养基中,在温度25◦C,光照强度6000lx,光周期16h条件下进行培养.对比不同ZT浓度下愈伤