各类层析色谱分析技术完全讲解
色谱分析技术 ppt课件
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填充柱色谱法 GC 毛细管柱色谱法
色谱法
高效液相色谱法 柱色谱 经典液相色谱法
LC 薄层色谱法
平面色谱法 纸色谱
吸附柱色谱 分配柱色谱 离子交换色谱 凝胶色谱
CE 毛细管电泳色谱法
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三、色谱过程
2、点样
（1）样品溶液的制备： 怎样选择溶剂？ 水可以用吗？
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2、点样
（2）点样量： 与薄层板的关系 太多太少的影响
点样基线：距底边2.0cm 样点直径：2-4mm 点间距离：1.5-2.0cm
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2、点样
（3）点样方法： 划线、样品记号点、点样
注：动作要轻， 毛细管或点样器不能混用， 斑点大小适当，可多次点样。
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（二）杂质检查（杂质限量检查）
2、自身稀释对比法（杂质结构不明或无杂质对照品）
样品溶液稀释制成一定浓度的溶液 样品制成一定浓度溶液
按相同的点样量点样
展开后观察斑点颜色深浅和大小
如地西泮中有关物质的检查： 取本品的细粉适量（约相当于地西泮200mg），加丙酮5ml,振
摇，使地西泮溶解，滤过，取滤液作为供试品溶液；精密量取适量， 加丙酮稀释成每1ml中含地西泮0.20mg的溶液，作为对照溶液。点 样展开后，供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较， 不得更深。
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四、结果计算和判断 （一）定性鉴别
判断依据：Rf值、Rs值 1、查找资料：影响Rf值的因素
吸附剂种类、活度、颗粒大小；展开剂纯度和极性； 薄层厚度；点样量；展开方式、温湿度；展开槽中的预饱 和状态等。 2、对照品比较法：常用。
层析色谱
色谱层析色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，现代生物企业生产过程中的核心技术之一。
文字在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。
色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
【色谱理论】保留时间的理论保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间，不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间，因此保留时间是色谱分析法比较重要的参数之一。
保留时间由物质在色谱中的分配系数决定：tR = t0(1 + KVs / Vm)式中tR表示某物质的保留时间，t0是色谱系统的死时间，即流动相进入色谱柱到流出色谱柱的时间，这个时间由色谱柱的孔隙、流动相的流速等因素决定。
K为分配系数，VsVm表示固定相和流动相的体积。
这个公式又叫做色谱过程方程，是色谱学最基本的公式之一。
在薄层色谱中没有样品进入和流出固定相的过程，因此人们用比移值标示物质的色谱行为。
比移值是一个与保留时间相对应的概念，它是样品点在色谱过程中移动的距离与流动相前沿移动距离的比值。
与保留时间一样，比移值也由物质在色谱中的分配系数决定：R_f=\frac{V_m+KV_s}其中Rf是比移值，K表示色谱分配系数，VsVm表示固定相和流动相的体积。
基于热力学的塔板理论塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。
一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。
根据塔板理论，待分离组分流出色谱柱时的浓度沿时间呈现二项式分布，当色谱柱的塔板数很高的时候，二项式分布趋于正态分布。
则流出曲线上组分浓度与时间的关系可以表示为：C_t=\frac{\sigma\sqrt{2\pi}} e^{-\frac{(t-t_R)^2}{2\sigma^2}} 这一方程称作流出曲线方程，式中Ct为t时刻的组分浓度；C0为组分总浓度，即峰面积；σ为半峰宽，即正态分布的标准差；tR为组分的保留时间。
层析法 色谱法
层析法色谱法层析法和色谱法都是现代化学分离技术的代表，它们广泛应用于生命科学、制药、化工等领域。
层析法是通过将混合物分离成不同的化合物分馏，分别被吸附在固体材料的不同区域，最终通过逐一反向洗脱的方法分离成单一组分。
层析法有多种类型，例如纸层析、薄层层析、气相层析、离子层析和凝胶层析等。
纸层析是一种简单的动态层析技术，特别适用于生物材料的色素和其它天然产物的分离。
薄层层析是一种静态层析方法，采用由超薄硅基板制成的薄（0.1-0.5mm）多孔度的二氧化硅层面。
离子层析和凝胶层析则是两种常见的固相高效液相色谱。
层析法具有处理任务多样、样品迅速处理和分离效率高等优点。
它可以将大量样品快速地分离，并且不需要高温和高压。
同时，它还可以根据需要选择不同类型的层析方式，以得到更好的结果。
例如，凝胶层析可以分离具有不同形状、大小和电荷特性的发酵液蛋白质样品。
色谱法的分离原理是根据组分在固定相和流动相中的分配系数不同，使流动相中的混合物分离成单一组分。
色谱法的主要类型有气相色谱、液相色谱和离子色谱等。
气相色谱是目前应用最广的色谱方法之一，主要用于气态分子分离和分析。
它的分离依据是各种气体和固体、液体之间的化学亲和力、大小排列不同等作用。
液相色谱是利用需要分离的混合物在液相和固定相中存在不同亲和性来实现分离。
液相色谱广泛应用于生物化学、制药、地质、环境保护、食品工业等领域，能够分离各种化合物，包括有机化合物、天然产物，以及大分子类的物质，例如蛋白质和核酸。
离子色谱则是一种能够分离大量离子化合物的稳定色谱，它可以自动地定量分析各种离子化合物，例如常见的硫酸盐和硝酸盐等。
总的来说，层析法和色谱法是现代化学分离技术中最常见且重要的方法之一。
它们在各个领域中发挥着不可替代的作用，我们相信随着科技的发展，这两种方法将更加成熟和广泛应用。
第一节层析技术
应用：平板色谱法在染料、农药、医药、 有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸 、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析 中经常被使用。也可以用于无机离子的分
离。还经常作为高效液相色谱的一种预试
方法。
4.显色、检测
有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下
用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显
色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。
特点及应用
• 平板色谱简单、方便、及操作费用低，
•
•
可以在一块层析板上同时展开多个试样及
采用方形薄层板还可以方便的进行二维展
将多条滤纸同时展开。
开，即按一般方法展开后，改变方向和展开
• 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小
• 洗脱体积 • 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，
为洗脱体积
Ve Vm K dVs
• 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗
脱体积也有所差异
• 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 • 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与 •
最大限度地满足疏水的要求
• 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）
来增大蛋白质和多肽的疏水性
• 载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20 μm ）
• •
Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基 流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和 四氢呋喃
薄层色谱法
• 将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离
的方法 • 常用的固定相有： 硅胶和氧化铝 • 优点：
《液相层析色谱技术》课件
05
液相层析色谱技术 的挑战与展望
技术挑战与解决方案
分离效果不佳
当样品组分复杂时，液相层析色谱技术的分离效果可 能会受到影响。
分离速度慢
液相层析色谱技术的分离速度相对较慢，需要优化以 提高分离效率。
样品处理难度大
对于某些特殊样品，如生物大分子、蛋白质等，液相 层析色谱技术的样品处理难度较大。
技术挑战与解决方案
原理
通过流动相携带待分离物质通过 固定相，利用不同物质在固定相 上的吸附、溶解等性质差异实现 分离。
发展历程与现状
发展历程
液相层析色谱技术自20世纪初诞生以 来，经历了不断改进和发展，技术不 断完善和提高。
现状
目前液相层析色谱技术已经成为生物 医药、食品、环保等领域中重要的分 离分析工具，应用广泛。
多维分离技术
为了更好地分离复杂样品，液相层析色谱技术将与多种分 离技术结合，形成多维分离技术，进一步提高分离效果。
智能化与自动化
随着人工智能和自动化技术的发展，液相层析色谱技术将 实现智能化和自动化操作，提高分析效率和准确性。
应用领域拓展
随着技术的不断进步和应用需求的增加，液相层析色谱技 术的应用领域将进一步拓展，包括生物医药、环境监测、 食品安全等领域。
技术成本高
液相层析色谱技术需要高昂的设备和试剂成本，限制了其在 某些领域的应用。
解决方案
通过改进分离介质、优化流动相组成、提高检测灵敏度等手 段，提高分离效果和分离速度；同时，开发新型的样品处理 方法和技术，降低处理难度；此外，降低技术成本也是重要 的解决方向。
未来发展方向与趋势
提高分离效率
未来液相层析色谱技术将更加注重提高分离效率，通过改 进分离介质和优化分离条件，实现更快速、高效的分离。
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
层析技术(色谱法,Chromatography)概念、分类和操作(3)
层析技术(色谱法,Chromatography)概念、分类和操作(3)柱层析的基本装置及基本操作目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。
(1)柱层析的基本装置柱层析的基本装置，如图2－21 。
(2)柱层析的基本操作柱层析的基本操作包括以下一些步骤：①装柱柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。
一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。
否则要重新装柱。
首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。
一般柱子的直径与长度比为1:10~50，凝胶柱可以选1:100～200。
然后将柱子洗涤干净。
将层析用的基质(如吸附剂、树脂、凝胶等)在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸(0.5～1mol/L)、碱(0.5 ~1mol/L)、盐(0.5~ 1mol/L)溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。
然后用去离子水(或蒸馏水)洗涤干净并真空抽气(吸附剂等与溶液混合在一起)，以除去其内部的气泡。
关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm 高。
打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液，吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。
注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。
最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm 高的缓冲液，同时关闭出水口。
②平衡柱子装好后，要用所需的缓冲液 (有一定的pH 和离子强度)平衡柱子。
用恒流泵在恒定压力下走柱子，平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同。
平衡液体积一般为3～5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。
如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。
有时柱子平衡好后，还要进行转型处理，这方面的内容将会在离子交换层析中加以介绍。
③加样加样量的多少直接影响分离的效果。
薄层色谱和柱层析
薄层色谱和柱层析一、薄层色谱（TLC）1.原理：薄层色谱是一种基于分子在固体表面和流动相之间相互作用的分离技术。
它使用薄层固定在玻璃或铝板上的吸附剂（例如硅胶或氧化铝）来分离混合物中的化合物。
在色谱板上涂覆样品后，通过液态或气态的流动相让混合物成分在吸附剂上移动，不同化合物的移动速度不同，从而实现分离。
2.应用：薄层色谱被广泛应用于药物化学、食品科学、环境科学和生命科学等领域。
它通常用于混合物的分析，确定混合物中是否存在特定化合物。
此外，它也可用于纯化样品中的化合物，通过可视化或其他检测方法来定位目标化合物位置。
3.操作步骤：薄层色谱的操作步骤主要包括：（1）准备色谱板：将吸附剂均匀涂覆在固定的玻璃或铝板上，使其成为薄层。
（2）样品的涂覆：将待分离的混合物溶解在适当的溶剂中，并用微量移液管将样品均匀地涂覆在色谱板上。
（3）开展分离：将涂覆了样品的色谱板悬挂在色谱槽中，加入合适的溶剂溶液，使之满足色谱板的一端。
（4）显色：在色谱板完全干燥后，通过目视或化学法将化合物可视化。
常用的显色剂包括碘、紫外线灯或化学染色剂。
二、柱层析（CC）1.原理：柱层析是一种基于分子在固定填料（固相）和流动相之间相互作用的分离技术。
根据样品的特性选择不同的固相材料，并将其装填在柱中。
当样品通过柱时，不同化合物与固相发生不同程度的相互作用，从而分离。
2.应用：柱层析广泛应用于化学和生物化学领域，用于分离和纯化化合物。
它可用于药物合成中的纯度检查、食品中毒素的分离、蛋白质的纯化等。
柱层析的分离效果通常较好，纯度高。
3.操作步骤：柱层析的操作步骤主要包括：（1）准备填料和柱子：根据需要选择适当的固相材料，并将其装填在柱子中。
（2）样品的预处理：将待分离的样品预处理，如溶解在适当的溶剂中，并清除杂质。
（3）样品注入：将样品注入柱中，注意控制样品体积和注入速度。
（4）洗脱：通过加入不同组成的洗脱液（流动相），使样品中不同化合物以不同速率从柱中洗脱。
层析(色谱)技术课程讲义(45页)
层 析 仪 器
层 析 仪 器
紫外检测器
记录仪
泵
收集器
层析柱
第一节 概 述
有关历史和专有名词
色谱法是一种物理或物理化学的分 离分析方法．它的分离原理是：混合物 中各组分在两相间进行分配，其中一相 是不动的，称为固定相 (stationaryphase)；另一相是携带混 合物流过固定相的，称为流动相 (mobilephase)。
位。
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HPLC方法，多采用紫外检测器，若使 用荧光检测器或电化学检测器，可使灵敏 度提高2～3个数量级．对剂量较小、体内 浓度较低的药物可使用荧光或电化学检测 器，但不是所有的物质都有荧光，不能产 生荧光的药物可经衍生化作用形成带荧光 化合物，再用荧光检测器检测，电化学检 测器只能检测具有氧化还原性的药物．
薄层色谱法能合理选择固定相，这种方 法 是 在 1938 年 由 Izmailov 和 Shraiber 首 先 使 用的，50年代末Stahl首次提出薄层色谱法这 个名词。
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1941 年 Martin 和 Synge 因 对 色 谱 法 的 贡献而获得诺贝尔奖 。1952年Martin 和 James 发 表 了 第 一 篇 气 相 色 谱 法 的 论 文 。 从1952年到60年代，气相色谱法发展很快。
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三、按实验操作形式分类
1．柱色谱法 将固定相装于柱管内构成色谱柱，色谱过程 在柱内进行。按色谱柱的不同又可分为填充 柱、毛细管柱及微填充柱色谱。气相色谱法、 高效液相色谱法均属于柱色谱范围。
2．纸色谱法 用纸作为支持物(固定相)，点样后，用流动 相展开，以达到分离检测的目的。
3．薄层色谱法 将固定相涂铺在玻璃板上，按纸色谱法操作。
层析技术简单介绍及其应用
层析法的主要介绍及其应用1.层析法的概念层析法又称色谱法[1]．色层法或层离法（Chromatography），是一种应用很广的分离分析方法。
1903年，俄国的植物学家M，C．UBeT在研究分离植物色素过程中，首先创造了色谱法，这是一种根据化合物的不同结构和不同的物理，化学特性，从而具有不同吸附性能的原理，以分离混合物中的化学成分的一种物理化学分离方法，最初用于有色物质，之后应用于大量的无色物质。
色谱法的名称虽然仍然沿用，但已失去原来的含义。
层析法和其他分离方法比较，具有分离效率高，操作又不太麻烦的优点。
因此，层析法的应用越来越广，对于近代化学科学的发展有巨大的影响。
在制药、化工、农业、医学等方面都有着广泛的应用。
2.层析法的历史及原理层析法的历史1903年3月21日俄国植物学家茨维特（Michael Tswett，1872-1919）在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。
1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法（Chromatography）。
1907年在德国生物学会年会上，展示过带有色带的分离柱管和纯化过的植物色素溶液。
茨维特被世人公认为色谱创始人。
德籍奥地利化学家R.Kuhn 等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a 和b 两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。
Kuhn正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果而获得了1938年诺贝尔化学奖.1952年，Martin和James发表第一篇气液色谱论文，首次用气体作流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的革命。
2.2层析法的原理层析Chromatography(色谱),利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等) ，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。
《液相层析色谱技术》PPT课件
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九、洗脱峰的纯度鉴定
▪ 由于检测系统的分辨率有限所以一个对称的洗脱峰并不 一定代表一个纯净的组分。
▪ 如果洗脱峰峰形不对称，或出现“肩”(shoulder)，则表 示混有杂质。
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▪ 对在一个特定的柱层析分 离条件下显示出的每个峰 要用几个纯度标准(一般23个高分辨率方法)来检验， 才能确定它的均一性。
和生物活性测定法等。
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▪ 如果某一化合物具有特征性物理特性，对可见光或紫 外光有吸收，如蛋白质在280nm，核酸在260nm处有最 大的吸收。可用核酸白质检测仪。
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▪ 洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。
欲得高纯度的化合物，一般根据洗脱峰位置收集合并较窄的 部分；
例如，可采用SDS电泳法、 等电聚焦法、高效液相层析 法和测定N末端氨基酸残基 方法等。
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十、脱盐和浓缩
▪ 洗脱峰在纯度鉴定的基础上，将同一组分合并。 ▪ 若欲得到某一产品，有必要依次经过减压薄膜浓缩法或超
滤(去盐、去水)，透析去盐 ▪ 再用冰冻干燥或有机溶剂沉淀等方法处理，得到干粉或沉
▪ 对于分析性柱层析，加样量一般不超过床体积0.5-1％，制备性柱 层析加样量不超过1-3％。
▪ 离子交换剂的加样量远远大于分子筛。
▪ 如果要求高分辨率时，如分析性柱层析和精制要求高纯度产品时， 则样品的体积尽可能小。
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1．样品的准备
▪ 样品在上柱前必需经预处理，由于分离和制备的目的不 同，预处理的方法也往往不同。
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层析技术的种类及其基本原理
层析技术的种类及其基本原理层析技术是一种分离化合物的方法，它是基于物质在不同相中的分布系数不同而实现的。
层析技术主要包括三种类型：薄层层析、柱层析和气相色谱。
一、薄层层析1.1 基本原理薄层层析是一种简单易行的分离方法，它利用了化合物在固定相和移动相之间的分配系数差异进行分离。
通常情况下，我们将待测样品涂在硅胶或氧化铝等吸附剂上，然后将其放置在一个玻璃板上，形成一个薄而均匀的涂层。
接着，我们将这个玻璃板放入一个密闭的槽中，在槽底部加入适量移动相。
当移动相向上升时，它会与样品发生反应并带走它们。
由于不同化合物在固定相和移动相之间具有不同的分配系数，因此它们会以不同速度被带走，并最终被分离出来。
1.2 分类根据吸附剂的不同，薄层层析可以进一步分为硅胶层析、氧化铝层析和纸层析等。
1.3 应用薄层层析广泛应用于食品、化妆品、药品等行业中，用于分离和鉴定其中的成分。
二、柱层析2.1 基本原理柱层析是一种利用固定相和移动相之间的互作用进行分离的方法。
通常情况下，我们将待测样品注入到一个装有固定相的柱子中，然后通过加入适量移动相来进行分离。
在这个过程中，不同化合物会以不同速度被带走，并最终被分离出来。
2.2 分类根据固定相的不同，柱层析可以进一步分为凝胶柱层析、反相柱层析和离子交换柱层析等。
2.3 应用柱层析广泛应用于生物技术、制药工业以及环境监测等领域中，常用于纯化和提取目标物质。
三、气相色谱3.1 基本原理气相色谱是一种利用气体载流体将混合物分离成单独组分的方法。
通常情况下，我们将待测样品注入到一个装有固定相的柱子中，然后通过加热来蒸发样品中的化合物，并将它们带入气相。
接着，我们将气相送入到一台质谱仪中进行分析。
在这个过程中，不同化合物会以不同速度被带走，并最终被分离出来。
3.2 分类根据固定相的不同，气相色谱可以进一步分为毛细管气相色谱、开放管气相色谱和微柱气相色谱等。
3.3 应用气相色谱广泛应用于食品、环境、制药等领域中，常用于分析和鉴定其中的成分。
色谱层析技术简介
行交换、吸附、络合,从而达到分离、提纯、富集等效果
。因此数十年来离子交换树脂的研究与应用受到人们的极 大关注。
应用 1离子交换树脂法分离纯化核苷酸及核酸
核苷酸及脱氧核苷酸为两性化合物,含有可形成正离子的 碱基和可形成负离子的磷酸基,因此用阳离子交换树脂和阴离
子交换树脂对其进行分离和纯化。
据报道,三磷酸腺苷(ATP)用弱碱性阴离子交换树脂 Vionit AT-1X-4吸附,0.1 M盐酸-0.2 mol/L氯化钠溶 液洗脱,洗脱液进一步处理后,乙醇沉淀,得到ATP钠盐 。 离子交换树脂法从发酵液中提取分离胞苷二磷酸胆 碱,总收率大于40%。 以阴离子交换树脂AmberlitIRC-50和吸附树脂Sepa beads(S-DVB)分离纯化S-腺苷-L-高丰胱氨酸,收率为 88%,纯度高达99.5%。
分离纯化—树脂应用简介
张雪霞 2008年6月
脱色树脂 简介
1 树脂脱色
树脂脱色是活性碳、DEAE、H2O2等脱色手段之外的另 一种选择,常会取得令人惊异的效果。 树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率,表面积较 大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳
定好,在水溶液和非水溶液中都能使用。
4.2 选用原则
一般大孔吸附树脂吸附符合以下规律:非极性物质在极
性介质(水)内被非极性吸附剂吸附,极性物质在非极性介质
中被极型吸附剂吸附,带强极性基团的吸附剂在非极性溶剂
里能很好地吸附极性化合物. 聚苯乙烯型树脂一般适用于非极性和弱极性的化合物 如皂苷类和黄酮类;聚丙烯酸类树脂（中等极性）,一般带 有酯基或酰氨基,对中极性和极性化合物如黄酮甾醇和酚类
苷含量,用60%的乙醇提取, 80%的乙醇洗脱时效果比较好
。
柱 层 析、薄 层 层 析
柱色谱、薄层色谱一、实验目的1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。
2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。
二、实验原理色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。
色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。
色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。
色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面:1、分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。
2、精制提纯化合物有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。
3、鉴定化合物在条件完全一致的情况，纯粹的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要获得重现的比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。
吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。
吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。
分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。
柱色谱常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
有机化学基本技能色谱分析与柱层析技术
有机化学基本技能色谱分析与柱层析技术色谱分析与柱层析技术是有机化学中常用的基本实验技能，它们在有机合成、分离纯化以及分析鉴定等领域都有广泛的应用。
本文将介绍有机化学基本技能中的色谱分析与柱层析技术，并探讨它们在有机化学实验中的应用。
一、色谱分析技术色谱分析是一种将混合物中的成分分离并测定其含量的方法。
它基于分析物在固定相（色谱柱）与流动相（溶剂）之间存在差异，通过运动速度上的差异使其分离开来。
常见的色谱分析技术包括薄层色谱、气相色谱和液相色谱等。
1. 薄层色谱薄层色谱是一种将分离物质分离并测定其含量的快速、简便的方法。
它利用薄层具有吸附能力的材料作为固定相，将待分离物涂覆在薄层板上，然后将薄层板悬置于溶剂中，溶剂通过毛细作用上升，将样品中的组分分离开来。
分离完成后，可以通过观察色斑的位置、颜色和荧光等性质来确定各组分的存在和含量。
2. 气相色谱气相色谱是一种将挥发性或温度稳定的化合物分离和测定的方法。
它利用气态载气作为流动相，在柱子上涂覆液态或固态的固定相，通过分析物在固定相上的吸附和解吸过程中的速度差异，实现物质分离。
通过检测来自柱尾的挥发物质，可以得到各组分的峰值图谱，进而确定它们的存在和含量。
3. 液相色谱液相色谱是一种将有机混合物分离和测定的方法。
它利用溶剂作为流动相，将待分离物溶解在流动相中，流经具有吸附性的固定相（色谱柱），通过分析物在固定相上的吸附和洗脱过程中的速度差异，实现物质分离。
通过检测来自柱尾的溶质，可以得到各组分的峰值图谱，进而确定它们的存在和含量。
二、柱层析技术柱层析技术是一种将分离物质从样品中提取并纯化的方法。
它基于不同物质在固定相（填料）中具有不同的亲和力，通过逐渐改变流动相的成分和浓度，使不同的组分先后从柱子上洗脱出来。
常见的柱层析技术包括凝胶层析、分子筛层析和反相层析等。
1. 凝胶层析凝胶层析是一种利用凝胶作为固定相的柱层析技术。
凝胶的孔隙大小可以根据待分离物质的分子大小来选择，通过选择合适的凝胶和流动相条件，在柱子上进行适当的洗脱操作，可以将待分离物质从样品中提取并纯化。
各类层析色谱分析技术完全讲解
各类层析色谱分析技术完全讲解层析色谱是一种常见的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物化学、环境分析等领域。
根据所用的分离相和分离原理的不同，可以分为多种不同的层析色谱技术。
下面将分别介绍几种常见的层析色谱分析技术。
1. 气相色谱（Gas chromatography，GC）气相色谱是利用气体载气将样品中的挥发性化合物分离的技术。
它主要包括进样、分离柱和检测器三个部分。
进样时，样品被蒸发进入气相柱，然后在柱中与载气混合并分离。
最后利用不同的检测器对分离后的化合物进行检测和定量。
2. 液相色谱（Liquid chromatography，LC）液相色谱是利用液体溶剂将样品中的化合物分离的技术。
根据不同的液相分离机制，液相色谱可以分为几种类型，如反相色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱等。
液相色谱通常由进样系统、柱和检测器组成，其中柱是最重要的部分，不同的柱可以用来实现不同的分离目标。
3. 离子色谱（Ion chromatography，IC）离子色谱是专门用于分离和分析离子化合物的技术。
它使用离子交换柱和离子交换树脂，通过控制流动相的pH值和离子浓度来实现不同离子的分离。
离子色谱广泛应用于水质分析、环境监测和生物分析等领域。
4. 薄层色谱（Thin layer chromatography，TLC）薄层色谱是一种简单且快速的分离技术，它使用特殊涂层的玻璃、金属或塑料薄片作为固定相。
样品溶液通过毛细作用或被吸附和分离在固定相上，然后可以使用不同的显色剂或检测器进行可视或仪器定量分析。
以上是其中几种常见的层析色谱分析技术，每种技术都有自己的特点和应用领域。
层析色谱技术的应用范围广泛，可以用于分离和检测不同类型的化合物，从而为科学研究和实验室分析提供了有力的工具。
层析技术讲义
层析技术讲义层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。
他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。
当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。
随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。
为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。
他们首先提出了色谱塔板理论。
这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。
其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。
特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。
前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。
因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。
如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。
但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。
现在我们简称为层析法或层析技术。
层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。
而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。
因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。
各类层析色谱分析技术完全讲解 ppt课件
层析介质的性能
❖ 层析介质的形状：球形，不定形 ❖ 技术指标
粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢 均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。
❖ 纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层 分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和 物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之 分离。
❖ 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特 别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单， 操作比较容易，重现性好。
三、层析前蛋白质处理
层析技术是一种分离技术，是混合物 最有效的分离、分析方法。
经典色谱（offline)
Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳 酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上 端;
洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过；
在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下 移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同 颜色的清晰色带；
检测器
固定相
❖ 固定相是不溶于溶剂和水的固定化颗粒，又 称为层析介质、层析填料、填充剂等。
❖ 包括：
无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺
层析介质与生物大分子的关系
❖ 大孔径的，亲水性好的球形材料。 ❖ 多糖类凝胶层析介质最常用
Sephadex Sepharose Bio-Gel
2、等电点沉淀
❖ 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白 质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉 淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子 散开，溶入水中。
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的分子与同一单位时间内的该介质的同一表面上解吸附的分
子达到了动态平衡，处于该环境中吸附介质的吸附作用达到 饱和。
吸附剂的选择
性能：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定
性强、成本低廉
极性：羟基磷灰石，硅胶，氧化铝，人造沸石 非极性：活性炭
吸附剂
活性炭 硅胶 氧化铝 聚酰胺 羟基磷灰石
2、等电点沉淀
在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋 白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成 沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分 子散开，溶入水中。
3、有机溶剂沉淀
降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电 荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚 度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增 强，从而产生沉淀。
四、层析基本操作过程
装置选择上样和洗脱结果 Nhomakorabea测基质均匀性 柱层析的L/d比值
上样均一性 洗脱装臵
目的不同 检测方法不同 活性检测
1、柱层析的L/d比值
2、洗脱装置
不改变溶剂体系
依靠液面的水位差产 生的静压力致使洗脱液不 断流经层析柱 缺点：随着溶液的流去， 水位差也逐渐减小，流速 也在变小。
薄层层析法
纸层析法
薄膜层析法
纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层 分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和 物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之 分离。 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特 别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单， 操作比较容易，重现性好。
气体
气-液层析法
超临界分析：利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点 的条件下进行分离，更具专一性。
按操作形式不同分类
名称 操作形式
层析分类法
柱层析法
固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
将适当粘度的固定相均匀涂铺 在薄板上，点样后用流动相展 开，使各组份分离 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离 将适当的高分子有机吸附剂制 成薄膜，以类似纸层析方法进 行物质的分离
4、层析装置的仪器化
HPLC
与电脑、质谱等连用
伯乐公司duoflow中高压层析仪
安马西亚公司akta高效快速层析仪
液相层析技术
概况
分离范围： 无机化合物 有机化合物 生物大分子 活体生物
应用范围： 大规模生产 小型制备、微量分离 定性定量分析
液相层析仪
伯乐公司duoflow中高压层析仪
三、层析前蛋白质处理
主要是利用盐析法、等电点沉 淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的 蛋白与其它较大量的杂蛋白分开， 这些方法的特点是简便、处理量大、 既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白 质，但分辨率低。
1、盐析法
盐离子与水分子作用，原来溶液中大 部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而 降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用， 破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的 蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。
层析技术的原理
层析系统都由两个相组成：一是固定相 (不动的一相)， 它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是 流动相 ( 携带样品流过固定相的流动体 ) ，即可以流动的物质， 当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存 在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能 力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互 作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向 前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向 前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各 单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
层析技术
第一节 层析概述
一、概况
层析法也称色谱法 (chromatography)，是1906年俄 国植物学家Michael Tswett发现 并命名的。他将植物叶子的色素通 过装填有吸附剂的柱子，各种色素 以不同的速率流动后形成不同的色 带而被分开，由此得名为“色谱 法”。 后来无色物质也可利用吸附柱层析 分离。
吸附介质的分类及其性质（一）
改变溶剂系统
♦ 梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度连续地进入处 于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中， 经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为 洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶 液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。 注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存 在两个性质接近的蛋白质。
线性梯度洗脱装臵
♦性能未知样品的蛋白质分离： 改变缓慢的梯度洗脱→若为单峰：分级洗脱
3、结果检测
活性检测
比活没有提高
目的蛋白与杂蛋白并没有分开 比活有所提高，但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象 测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋 白的生物活性
结果保存
薄层层析&纸层析 照相保存or 扫描仪转为图形or 积分 仪变成数据
柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理
将潮湿的碳酸钙挤出玻璃管，用刀将各色带切下，对其中 的组分用合适的分析方法分别进行测定。
现代色谱（online)
当一个二组分（A和B）的混合样品在t1时间从柱头加入; 随着流动相不断加入，洗脱作用连续进行，直至A和B组 分先后流出柱子而进入检测器; 从而使各组分浓度转变成电信号后记录在记录纸上，或 显示在荧光屏上，或由电脑贮存后打印出来。
性、溶解度、稳定性等）选择缓冲溶液及其浓度、 pH值、离子强度、缓冲容量等。
保护剂：抗氧化剂、稳定剂、蛋白酶抑制剂等
有机溶剂：根据待检测物质的极性及溶解度来选
择不同极性的溶剂。
第一节 吸附层析
吸附层析
定义：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物 中的各组分分离的方法。
原理：层析介质表面的吸附基团对溶质发生吸附作用， 该基团对不同溶质的吸附能力的强弱有较大的差异，可 根据这种差异性，将不同溶质进行分离。
凝胶层析法/排阻层析
亲和层析法
按层析原理分类（二）
名称 分配层析 分离原因 被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附的 作用，在移动的过程汇总物质在两相之间进行分配。 利用固定相载体表面偶联的疏水性配基与流动相中的一些 疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法。 利用固定相载体表面偶联的疏水性较强的配基，在一定非 极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非极 性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的物 质。 利用固定相载体表面偶联的载体两性电解质分子，在层析 过程中所形成的pH梯度，并与流动相中不同等电点的分子 发生等点聚焦反应进行分离的方法。 利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与 流动相中溶质分子相对分子量的差异进行分离的方法。
二、层析法的特点
分离效率高：复杂混合物、有机同系物、异构体、手性异 构体。
灵敏度高：可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级
的物质量。
分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试 样的分析。
应用范围广
不足之处：被分离组分的定性较为困难。
层析应用范围
凡是溶于水和有机溶剂的分子和离子，在性质上有 一定差异均可通过层析方法进行分离。 分离的范围包括：
HPLC以分析为主。
通过层析方法可以对物质进行一定程度的定量、 定性和纯度鉴定。
按层析原理分类（一）
名称 吸附层析法 金属螯和层析法 离子交换层析法 分离原理
组份在吸附剂表面吸附固定相的能力不同
利用二价金属离子与流动相中的含有半胱氨 酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯和 作用而进行分离的方法 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂 亲和力不同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同， 因而在凝胶上受阻滞的程度不同 固定相只能与一种待分离组份专一结合，以 此和无亲和力的其它组份分离
疏水层析
反向层析
聚焦层析
灌注层析
按层析过程的机理分类 离子交换层析：利用不同组 分对离子交换剂亲和力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同 分子大小的组分阻滞作用的不同。
吸附层析：利用吸附剂表面对 不同组分吸附性能的差异，达 到分离鉴定的目的。
按两相所处状态分类
流动相 液体
液体 固定相 固体 液-固层析法 气-固层析法 液-液层析法
原理
根据物料中各组分对固定相(吸附剂) 的吸附程度不 同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异 来实现。经反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的 过程，达到分离目的。 无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华 力和偶极力相互作用。
吸附力的产生
吸 附
吸附：任何两相都可以形成界面，其中一相的 物质或溶解在其中的溶质在另一相表面上发生 密集行为。
粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢
均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。
流动相
流动相
缓冲溶液：根据待分离物质的性质（等电点、极
经典色谱（offline)
Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳 酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上 端;
洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过； 在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下 移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同 颜色的清晰色带；
无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺