高效液相色谱结果分析-第二讲

3.准确度(accuracy)
准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接 近的程度，用百分回收率表示。
相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度, 应控制在100%左右(95%～105%)。
绝对回收率 模拟生物样品经整个样品处理过程,而相 应标准溶液直接分析,两者的响应值之比称为绝对回收 率。绝对回收率一般应大于70%,过低说明方法中待测 物质损失严重。
检测器
记录仪
积分仪
色谱工作站
色谱仪信号输出图
数据处理原理
峰的检测 数据采集 基线校正和重叠峰的分离
数据处理方法
自动处理 人工修正
二.色谱图 (Chromatogram)
色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图, 其纵坐标为信号强度, 横坐标为时间
样品组分分离示意图
半峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点 作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间 的距离 .
峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值.
切线 半峰宽 切线峰宽
响应值
峰面积
色谱峰的判断 (最小面积)
时间
三.液相色谱图名词术语(3)
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试 验法”和“加样回收试验法”。
(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定， 测定值为 M
M - 空白
回收率 R =
X 100%
A
(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
Fc: 流动相的流速 mL/min.
三.液相色谱图名词术语(5)
谱带扩展(Band Broadening): 由于纵向扩散,传质阻 力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象.
三.液相色谱图名词术语(6)
拖尾峰(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰. 前伸峰(Leading Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰. 鬼峰(Ghost Peak): 并非由试样所产生的峰,亦称假峰.
结果处理与分析 第二部分
高效液相色谱
(High performance Liquid Chromatography，HPLC)
一、色谱数据处理 二、色谱图 三、色谱图名词术语 四、色谱峰检测 五、HPLC测定步骤与内容
一.色谱数据处理
色谱数据处理是通过ADC转换器,把模拟信号转换成数 字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。
调整保留时间：tR’＝ tR－t0
三.液相色谱图名词术语(4)
保留体积(VR)(Retention volume): 组分从进样到出 现峰最大值所需的流动相体积.
死体积(V0)(Dead volume): 不被固定相滞留的组分, 从进样到出现峰最大值所需的流动相体积.
调整保留体积：VR’＝VR－V0＝tR’ • FC
色谱柱的选择 流动相 流速 检测波长 柱温 进样量
2.绘制标准工作曲线
标准曲线是定量分析的根本依据. 药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号
（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!
依 照 信 号 斜 率 的 变 化检测信号
依 照 积 分 面 积 检 测 峰信号
切线 色谱峰的判断 最小面积
五.HPLC 测定步骤与内容
1.确定色谱条件: 色谱柱的选择，流动相、流速、 检测波长、柱温及进样量Ｓ等。
2.绘制标准工作曲线 3.精密度试验与回收率试验 4.实际样品含量测定
1.确定色谱条件
三.色谱图名词术语(1)
色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响 应信号.
峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线. 峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离.
响应值 (mV)
←色谱峰
峰底 时间(分)
基线 ↓
峰高
三.色谱图名词术语(2)
切线峰宽(Peak Width, 峰宽):在峰两侧拐点处所作切 线与峰底相交两点之间的距离.
Excellent t = 1.0 - 1.05
Acceptable t = 1.2
Unacceptable t=2
AwfHale Waihona Puke Baidul t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线 波动.
基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变 化.
基线
基线噪音
基 线 飘 移
三.液相色谱图名词术语(8)
标准偏差(σ)(Standard deviation): 0.607倍峰
高处峰宽的一半，为便于测量，改用半峰宽。目的

是为了计算柱效率(柱效)。 柱效（理论塔板数） ：N ＝
回收率 R = M - P X 100% A
数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价， 如高、中、低三个不同浓度样品各测三次.
4.精密度(precision)
精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取
样测定所得结果之间的接近程度,表示测定的重现性。用
偏差（d）、标准偏差(SD )、相对标准偏差(RSD )(变异

tR

2

或
N＝5.54
tR W1/
2
2
标准偏差σ
进样
半峰宽
峰宽
塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡
图示中塔板数为3.
四.色谱峰检测
峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个 “阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采 用下面两种方式判别峰讯号的变化：
保留时间(TR)(Retention time): 组分从进样到出峰最 大值所需的时间.
死时间(t0)(Dead time): 不被固定相滞留组分的出峰时 间.（其测定测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸 收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色 谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）.