功能微生物的筛选和育种

配制 6 (g/L)：硫酸铵 10，淀粉 3，K2HPO4 1.5，MgSO4·7H2O 1.5， 去离子水 1000mL， pH 7.2 1.2.1.2 无菌水的准备 （第六排负责） 50ml 三角瓶内盛入 18ml 蒸馏水， 放入 8～10 颗玻璃小珠， 加盖瓶塞， 包扎待灭菌；每 2 人准备一瓶； 50ml 三角瓶内盛入 18-20ml 蒸馏水，加盖瓶塞，包扎待灭菌；每 4 人准备一瓶。 1.2.1.3 灭菌材料与器皿的包扎 1) 试管的包扎： 7 支试管为一包扎单位，用报纸将试管塞部分包扎 严实并绳之以纱线； 2) 三角瓶的包扎：用报纸将瓶塞部分包扎严密，以纱线系之； 3) 培养皿的包扎： 6 个平皿为一包扎单位，用报纸以滚筒方式将其 包紧；每 2 人扎一包； 4) 1.5mL 离心管的包扎 ： 6 个离心管为包扎单位， 用报纸包成小包。 每人扎一包。 1.2.1.4 高压蒸汽灭菌 过程：加热锅体夹层中的水至沸腾，当饱和 蒸汽压达到 1kg/cm2 的时候，锅内温度即可 达到 121℃， 在该温度下维持 20-30 min 即可 杀死包括细菌芽孢在内的所有微生物，达到 彻底灭菌之目的（灭菌釜内的空气是否排尽
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在 3 块淀粉培养基滴加路哥氏碘液显色， 观察水解圈并测量菌落 大小(C) 和水解圈大小(H) 。
� 找到水解圈最大的 1-2 个菌落和编号，在对应编号的点种平板上 做好标记。 � 将点种平板继续置于 30℃培养。 1.2.3 不同营养和培养条件对淀粉酶产生菌生长的影响 1.2.3.1 发酵液接种 提前 24h 将平板菌种用接种环挑取，在液体试管中打散混匀，然后按 0.5％接种量分别转接如下六种液体摇瓶发酵培养基。 (pH 4.0; pH 7.2; 碳源淀粉; 碳源葡萄糖; 氮源硝酸钠; 氮源硫酸铵.) 1.2.3.2 菌种保藏
将直接影响到锅体内物品的灭菌效果） 。 （对 1.2.1.3 中的试管，三角瓶，培养皿，玻璃器皿，离心管进行高 压蒸汽灭菌。 ） 1.2.2 产胞外淀粉酶细菌的分离和筛选 1.2.2.1 制备土壤稀释液 称取土壤 2g，放入 18mL 带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡 5min 10-4 稀释度。 （稀释度已为 10-1） ， 然后在离心管中依次稀释至 10-3、 1.2.2.2 制备淀粉培养基平板 每组制 5 块淀粉牛膏蛋胨培养基平板：微波炉加热融化淀粉培养基， 冷却至不烫手的温度，倒入灭菌的空培养皿中(20ml 左右)，并轻轻摇 晃混匀，冷却。 1.2.2.3 稀释涂布 无菌操作法分别吸取 10-3、10-4 土壤稀释液 0.1 mL，加在淀粉平板 培养基上（每个稀释度一块） 。用无菌玻璃涂棒均匀涂布，静置 5min 后，置于恒温培养箱中培养。 1.2.2.4 划线分离 用接种环挑取一环 10-1 土壤稀释液，在一块淀粉培养基上进行划线 分离。倒置于恒温箱培养。
1.2.4 产淀粉酶菌种的鉴定 1.2.4.1 产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征的观察与鉴定 a. 培养特征的观察：菌落形状与大小，边缘，表面，隆起形状，透 明度，菌落与培养基颜色等； b. 细菌细胞的显微观察： 细胞形状是杆状 （长杆或短杆） 还是球状？ 有无芽孢？有无荚膜？ c. 细菌的革兰氏染色：按照书上操作方法进行（设立标准的革兰氏 阳性和阴性菌为对照） 。 G+ GG+和 G-的混合
1.2.5.1 紫外线对细菌的诱变效应 a. 细菌悬液制备： 取液体培养物 （各组提前 24 小时， 将之前保 藏
的试管斜面菌种转接液体摇瓶过夜培养。 ）1mL 于 dorf 管中，每 组 3 管，8000rpm，离心 5min，弃上清；菌体用无菌水洗涤-离心 一次，最后每个 dorf 管各加 1.5mL 无菌水制成均匀的菌悬液。 b. 平板制作：融化淀粉培养基，每组倒 4 块平板，在平板上做好标 识。 c. 紫外线处理：将紫外灯打开预热 20 分钟；取 6cm 无菌平皿一个， 加入 2 管菌悬液，共 3ml；将上述平皿置于紫外灯下的脱色摇床 上，打开皿盖，距离紫外灯管 30cm，照射 3min（单号排）或者 6min（双号排） ，盖上皿盖。 d. 稀释菌液：在超净台内，将照射后的菌悬液用无菌水按 10 倍稀释 法依次稀释成 10-1-10-5（在 dorf 管中进行） 。 e. 涂布平板：取 10-3、10-4（单号组）和 10-4、10-5（双号组）两 个稀释度的菌悬液各 0.1ml 涂布均匀。以同样的操作，取未经紫 外线处理的菌悬液稀释涂布平板作为对照。 1.2.5.2 培养与观察及结果判断 1) 涂布好的平板置于瓷盘中，盖上盖子，置于 30℃避光倒置培养 48 小时。 2) 计数：将培养好的平板取出进行细菌菌落计数； 根据对照板上的 CFU(colony forming unit)数,计算出每毫升 菌悬液中的 CFU 数， 同样计算出紫外线处理后的 CFU 数。
离心管，微量移液枪，枪头，PCR 管，接种环，20 W 紫外灯； � 仪器：移液管，高压蒸汽灭菌锅，电子台秤，普通天平，摇床， 分光光度计，光学显微镜，凝胶电泳仪，水平电泳槽，紫外检测 灯，PCR 仪、磁力搅拌器、离心机； � 玻璃器皿：玻璃平皿，玻璃试管，玻璃三角瓶，玻璃烧杯，玻璃 量筒，分装漏斗，玻璃棒，玻璃涂棒，载玻片； � 药品：配制牛肉膏蛋白胨培养基，摇瓶发酵培养基相关的化学药 品，试剂与原料，1mol/L 的 NaOH 和 HCl，新鲜土壤样品（同学 自备） ，稀碘液，2%淀粉溶液，乙酸溶液，无菌水三角瓶，带有 玻璃珠装有 20mL 菌种：各组分离获得的产淀粉酶细菌 1 株（无 菌水） ，{革兰氏染色全套试剂，Taq 酶，反应缓冲液，dNTP，16S rRNA 基因上下游引物，模板（菌落）}（PCR 反应试剂） ，琼脂 糖，溴化乙锭， ，TAE 电泳缓冲液，每组分离并鉴定的菌种。 1.1.2 培养基 � 培养基：淀粉培养基，无菌培养皿，前一步制备的各种摇瓶发酵 培养基，产淀粉酶的待检菌的平板菌落 （提前 24 小时划线接种） ， 肉膏蛋白胨固体培养基。 1.2 实验方法 1.2.1 培养基的配制和实验材料的准备与灭菌 1.2.1.1 淀粉培养基的配制 （第一排负责） 配方(g/L)：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，可溶性淀粉 2，琼脂 20，
微 生 物 实 验 论 文
功能微生物的筛选和选育
本 科 生： 指导教师： 培养单位： 学科专业： 完Байду номын сангаас时间：
朱金风 戴亦军 教师教育学院 生物师范 2011 年 12 月 4 日
功能微生物的筛选和选育
摘要：微生物种类繁多，且生长快速，它不仅在生态环境、工农业生 产中有重要作用，而且与人类健康密切相关。许多种类为人类开发利 用，造福社会。正因为它在各方各面都有着其巨大的影响，则要求我 们更好地掌握功能微生物的筛选和育种， 所以我们对功能微生物进行 了实验研究，以产淀粉酶细菌为例，在实验过程中我们做了培养基的 配置和灭菌、产淀粉酶细菌的分离筛选和纯化、研究了不同条件对产 淀粉酶细菌产酶的影响、 学习了产淀粉酶细菌的鉴定和它的紫外诱变 育种方法。通过实验我们掌握了试管培养基的分装、包扎，纱线的系 法，了解了高压蒸汽灭菌的方法和原理，液体摇瓶培养技术，斜面接 种技术和倒平板技术以及平板划线分离技术， 还进一步掌握了稀释涂 布分离菌种技术，学习了 PCR 的操作技术，琼脂凝胶电泳法。我们 完整地开展了一次应用微生物课题研究的实训。 不仅掌握了相关实验 技术和方法还更好的掌握了如何应用这些技术去解决科学实验和生 产实践中的具体问题，培养了学生的创新思维和动手能力。 关键词： 功能微生物； 产淀粉酶细菌； 紫外诱变育种； 高压蒸汽灭菌； 液体摇瓶培养技术；PCR 的操作技术；琼脂凝胶电泳法。 1、材料和方法 1.1 实验材料及培养基 1.1.1 实验材料 � 其它：pH 试纸，牛角匙，废旧报纸，试管塞，三角瓶塞，棉花， 纱布，纱绳，记号笔，酒精灯，火柴，吸耳球，无菌吸管，无菌
琼脂糖凝胶电泳装置
3) 电泳：100V 电泳 20 分钟。 4) 染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色；10min，然后将凝胶 置于紫外灯下进行检测，当在凝胶上出现预期大小的 DNA 条带 （约 1.5Kb） ，则认为是 PCR 阳性，这时将与此电泳样品对应的 PCR 反应管放置冰箱短期保存。 1.2.5 淀粉酶产生菌的紫外诱变育种
pH7.0～7.2。 (注： 配制 3000mL， 分装于 250mL 三角瓶， 每瓶 200mL。 ） （第二排负责） 配方(g/L)：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，可溶性淀粉 2，琼脂 20， 2） pH7.0～7.2。(注：分装 20 支固体斜面试管（不超过试管高度的 1/ 1/2 和 20 支液体试管（不超过试管高度的 1/3） ）
1.2.2.5 观察水解圈和测量 H/C 值 � 24 小时后（第二天天下午） ，在之前稀释涂布和划线的 3 块淀粉 培养基上选取典型细菌菌落（尽量选取边缘整齐和规则的菌落） ， 并用记号笔进行编号。 � 将编号后的菌落用无菌牙签挑取，在备用的 1 块淀粉培养基平板 上分别点种。
挑 取 点 种 示 意 图
1.2.4.2 细菌的 16S rRNA 分子鉴定 用灭菌枪头挑取单菌落边缘少许菌体，刮蹭于 PCR 管壁底部少许。 反应体系：在一个 PCR 管中用微量移液枪加入下列物质的混合液 24.5ul，置于冰上备用。 Taq buffer（10×） MgCl2（25mM） dNTP（2.5 mM） 2.5μl 1μl 2.5μl
不 超 过 试 管 高 度 的 2 不超过试管高度的 1/ 1/2
（第三排负责） 不同 pH 值（每种每组 1 瓶，每瓶 10mL） 配制 1 (g/L)：淀粉 3，蛋白胨 10，NaCl 5， pH 4.0 配制 2 (g/L)：淀粉 3，蛋白胨 10，NaCl 5， pH 7.2 （第四排负责） 不同碳源（每种每组 1 瓶，每瓶 10mL） 配制 3 (g/L)：淀粉 3，蛋白胨 10，K2HPO4 1.5，MgSO4·7H2O 1.5， 去离子水 1000mL， pH 7.2 K2HPO4 1.5， MgSO4·7H2O 1.5， 配制 4 (g/L)： 葡萄糖 3， 蛋白胨 10， 去离子水 1000mL， pH 7.2 （第五排负责） 不同氮源（每种每组 1 瓶，每瓶 10mL） 配制 5 (g/L)：硝酸钠 10，淀粉 3，K2HPO4 1.5，MgSO4·7H2O 1.5， 去离子水 1000mL， pH 7.2
Primer Forward（50 mM） Primer Reverse（50 mM） ddH2O
1μl 1μl 16.5μl
振荡，将菌体和反应体系充分混匀 最后加入：rTaq（2U/ul） 0.5ul
PCR 反应条件： 95℃预变性 5min 后， 95℃变性 1min， 59℃退火 1min， 72℃延伸 2min，共 25 个循环，72℃延伸 10min。 1.2.4.3 琼脂糖凝胶电泳 1) 制胶：配制 0.7%琼脂糖溶液 20mL，用 1×TAE 电泳缓冲液做溶 剂，加热溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待胶凝固。 2) 制样：PCR 反应结束后，取出 PCR 管，用微量移液枪吸取 5ul 与 1ul 6×loading Buffer 混合后全部点入浸于 TAE 电泳缓冲液中的琼 脂糖凝胶的样品孔中。
挑取平板菌落，在斜面试管培养基上划线，30℃培养，然后置冰箱低 温保藏。 1.2.3.3 菌体生长量的测定 1) 将培养 24h 后液体摇瓶培养物分别取出 2mL 于试管中， 加入 8mL 蒸馏水，进行 5 倍稀释。 2) 将各稀释液分别倒入比色杯中，在 721 型分光光度计 600nm 波长 下测定吸光值(OD600 值)。 3) 如果菌液浓度过大，可继续稀释后再进行测量，保证 OD600 值应 控制在 0.1-1 之间。 4) 分别记录各种不同培养基和不同培养条件下 OD600 值大小， 评价 对菌体生长量的影响。 1.2.3.4 不同条件对淀粉酶活性的影响测定