孔雀石绿的分析

孔雀石绿的分析
孔雀石绿 ：
化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式C23H25ClN2， 又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、维多利亚绿或中国绿,属三 苯甲烷类,用于制陶、纺织、皮革、食品着色剂和细胞染剂, 目前多用于抗真菌感染和杀灭寄生虫,在水产领域一般用于鱼 类防治水霉病,烂鳃病以及寄生虫等,由于其性价比高,曾一度 在水产养殖业中广泛应用。 但各种毒理学实验表明,MG具有高毒、高残留、“三致” 等毒副作用,其在水产领域的应用已为世界各国所禁止。近年 来发现孔雀石绿(MG)特别是其代谢产物无色孔雀石绿(LMG) 在水产动物体有明显的蓄积残留现象,而其化学官能团三苯甲 烷是一类致癌物质
建立小分子免疫分析技术,关键点有3个:
人工抗原合成和抗体制备。 酶和抗体标记物的备。 检测技术方法学的建立。 LMG是小分子质,在免疫学上称半抗原,必须要同大分子 载体偶联后才能免疫动物制备抗体。
无色孔雀石绿的修饰
无色孔雀石绿的衍生化反应途径
一、免疫原及包被抗原的制备
利用重氮化法将无色孔雀石绿修饰物与牛血清白蛋白 (BSA)和卵清蛋白(OVA)交联,制成免疫原及包被抗原
结果处理：
用酶标仪于450nm处测定各孔溶液的吸光度(A)。标 准溶液中无色孔雀石绿的浓度越大,吸光度越小。以A～ logC作图得到测定无色孔雀石绿的标准曲线,从图中可以 算出检出限(DL)和IC50值。IC50值越小,灵敏度越高。待 测样品中无色孔雀石绿的浓度可根据其相应的吸光度从标 准曲线中求出。
二、多克隆抗体的制备
将免疫原(LMG-BSA)与福氏完全佐剂以1∶1混溶, 对两只新西兰大白兔进行多次免疫(第一次动物免疫将 免疫原与福氏完全佐剂混溶,之后的动物免疫将免疫原 与福氏不完全佐剂混溶),经5次免疫后,制得多克隆抗体。
三、间接酶联免疫吸附分析法步骤
用包被抗原(LMG-OVA)包被酶标板,200μL/孔， 4℃过夜。 用PBST缓冲液洗板3次, 300μL/孔，加入1%Casein进行 封阻，室温放置1h,洗板。 加入抗体,标液(或样品稀释液)各100μL/孔,室温孵育1h。 包被在酶标板上的固定抗原(LMG-OVA)和添加的标液中 的LMG游离抗原与竞争抗体的结合位点。PBS洗涤扣干3 次，游离的抗原抗体复合物被洗涤去除。 加入用PBS稀释的山羊抗兔 IgG2辣根过氧化物酶偶合物 (GaRIgG-HRP), 200μL/孔,室温1h。形成抗原-抗体-酶标 二抗的复合物固定在酶标二抗上，洗板, 。PBS洗涤扣干3 次，游离的酶标二抗被洗涤除去。 加入TMB底物溶液200μL/孔,显色,避光反应,在微量振荡器 上振摇约15～20min。 加入5%硫酸,80μL/孔,终止反应。
孔雀石绿(MG)的结构式：
无色孔雀石绿(LMG)的结构式:
孔雀石绿的检测方法
目前孔雀石绿的检测以理化检测法和免疫学检测法为主。
一、理化检测法
薄Leabharlann Baidu层析法 分光光度法 气相色谱法( GC) 高效液相色谱法( HPLC)
液相色谱质谱串联检测法( LC-MS)
气相色谱质谱联用法( GC-MS)
二、免疫学检测主要用酶联免疫检测法。
国内孔雀石绿检测标准
酶联免疫检测法
理化检测方法适用于专业检测和实验室使用，,但难以满足现 场快速检测和基层样品初筛的要求。近年来发展迅速的免疫分析 法(IA)集免疫反应、有机合成、酶催化等先进技术于一身,具备快 速准确,成本低廉等特点,可以满足现场初筛,快速判定的要求。