基因克隆-256页PPT
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宿主细胞，常见的有大肠Βιβλιοθήκη Baidu菌、酵母等。
2载体的特征：
能自主复制； 具备筛选标记； 适当大小的分子量和适当限制性内切酶 酶切位点； 在细胞中拷贝数高 除上述特征外，表达载体还应配备有与 宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、 加尾信号、增强子等调控DNA元件。
3 载体的分类
按来源分：质粒、噬菌体、病毒载体等； 按用途和功能分：克隆载体和表达载体。
3 插入载体
经人工改造而成，具有单一的 EcoRⅠ 酶 切 位 点 ， 该 酶 切 位 点 位 于 lacZ基因内，使用蓝白斑筛选法。插入 片 段 长 度 约 几 个 kb ， 主 要 用 于 构 建 cDNA文库。
插入载体的 筛选原理
4 替代载体
λ噬菌体基因组中央部分约有14kb主要 编码抑制性因子，非裂菌性生长所必需， 作为载体这部分可被外源DNA所替代。
1λ噬菌体在细菌内的生长方式：
裂菌性生长（lytic pathway）：在宿主菌中大 量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主菌 裂解。 溶菌性生长（lysogenic pathway）：整合到 宿主菌DNA分子中，随宿主菌DNA复制并转到 子代细菌中。
2λ噬菌体结构
野生型的λ噬菌体基因组庞大而复杂，有约48.5kb，约占基因组总长 度30％的中间部分的基因对噬菌体生长是非必需的，可以直接插入外源 基因或切除该区域而由外源基因代替而不影响噬菌体的生存。
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。 外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
1载体（vector）
携带靶DNA片段（外源DNA片段） 进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
克隆载体与表达载体
克隆载体：主要用来获得大量纯化的目的DNA 片段（目的基因），以便进一步研究其结构和 功能；本章主要以克隆载体为例讲解。 表达载体：主要用来产生插入基因和mRNA， 进而合成相关蛋白质。
二、质粒载体
1 概念
Plasmid ： 细 菌 染 色 体 外小型双链环状DNA，对 细菌的某些代谢活动和抗 药性的表型具有一定的作 用。
Autonomously replicating DNA molecules
(have an origin of replication)
Selectable marker, such as drug resistance Insertion site for foreign DNA
(often a genetically engineered multiple cloning region with sites for several restriction enzymes)
2 严紧型质粒与松驰型质粒的区别
严紧型质粒
松驰型质粒
质粒复制所需的酶
每个细胞中所含的质 粒数 质粒复制与细菌复制 的关系 在基因克隆中的应用 前景
DNA聚合酶 Ⅲ
1～5个
密切
小
DNA聚合酶Ⅰ
10～200个以上 能在没有蛋白质合成 的情况下继续复制
大
3 Specificity of Plasmid Vectors
构成：质粒复制起始点、一个或多个限制性 内切酶位点、抗药性基因、λ噬菌体的cos位 点。粘粒载体大小为4～6kb。
粘粒克隆外源DNA的步骤：
外源DNA与粘粒载体用同一种内切酶酶切； 连接酶连接，外源DNA插入到两个线状粘粒之间； 离体包装，组成成熟的噬菌体颗粒。该过程对DNA分子长 度有严格的限制，过长或过短均不能被包装，所以虽然粘 粒只有几千个碱基，但要求插入的外源基因却必须是大片 段（25～45kb）。 体外包装好的颗粒感染宿主菌，重组载体由于缺乏噬菌体 其他部分基因，故不能像噬菌体一样复制，只能像质粒一 样扩增。
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、 复制起始点（ori）
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
外源基因插入载体后，lacZ被破坏，不能分解 X-gal，菌落呈白色。——“蓝白斑”筛选法。
7质粒载体的主要用途
保存和扩增片段小于2kb的DNA； 构建cDNA文库； 目的DNA测序； 制备探针。
缺点：所能接受的DNA片段容量小；转化效率低。
三、λ噬菌体载体
λ噬菌体的基因组是约50kb的线性双链 DNA分子，两端各有12个核苷酸的5’突 出，碱基互补（cos位点，又称粘端）。 λ噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基 配对而结合，形成环状DNA分子。
此载体中央部分两端有三个酶切位点。可插 入片段的长度约9～22kb，主要用于构建基因 组文库。
不足：
λ噬菌体载体在进行真核基因组文 库构建时，其容量仍然受到一定的限 制。最大插入片段不能超过23kb。
四、粘粒载体
1978年构建，由质粒和噬菌体的cos粘 性末端构建而成。插入片段29～45kb。 可根据载体携带的抗药性标记筛选阳性 克隆细胞株。
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
multiple cloning sites
人工合成的DNA序列，含有密 集排列的多种限制性内切酶识别 序列，以利于不同来源的外源 DNA片段插入载体。
pBR系列载体
4 pBR质粒载体筛选的原理
5 pBR质粒载体的筛选方法——双抗生素对照筛选法
6 pUC系列载体
（1）构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。
2载体的特征：
能自主复制； 具备筛选标记； 适当大小的分子量和适当限制性内切酶 酶切位点； 在细胞中拷贝数高 除上述特征外，表达载体还应配备有与 宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、 加尾信号、增强子等调控DNA元件。
3 载体的分类
按来源分：质粒、噬菌体、病毒载体等； 按用途和功能分：克隆载体和表达载体。
3 插入载体
经人工改造而成，具有单一的 EcoRⅠ 酶 切 位 点 ， 该 酶 切 位 点 位 于 lacZ基因内，使用蓝白斑筛选法。插入 片 段 长 度 约 几 个 kb ， 主 要 用 于 构 建 cDNA文库。
插入载体的 筛选原理
4 替代载体
λ噬菌体基因组中央部分约有14kb主要 编码抑制性因子，非裂菌性生长所必需， 作为载体这部分可被外源DNA所替代。
1λ噬菌体在细菌内的生长方式：
裂菌性生长（lytic pathway）：在宿主菌中大 量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主菌 裂解。 溶菌性生长（lysogenic pathway）：整合到 宿主菌DNA分子中，随宿主菌DNA复制并转到 子代细菌中。
2λ噬菌体结构
野生型的λ噬菌体基因组庞大而复杂，有约48.5kb，约占基因组总长 度30％的中间部分的基因对噬菌体生长是非必需的，可以直接插入外源 基因或切除该区域而由外源基因代替而不影响噬菌体的生存。
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。 外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
1载体（vector）
携带靶DNA片段（外源DNA片段） 进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
克隆载体与表达载体
克隆载体：主要用来获得大量纯化的目的DNA 片段（目的基因），以便进一步研究其结构和 功能；本章主要以克隆载体为例讲解。 表达载体：主要用来产生插入基因和mRNA， 进而合成相关蛋白质。
二、质粒载体
1 概念
Plasmid ： 细 菌 染 色 体 外小型双链环状DNA，对 细菌的某些代谢活动和抗 药性的表型具有一定的作 用。
Autonomously replicating DNA molecules
(have an origin of replication)
Selectable marker, such as drug resistance Insertion site for foreign DNA
(often a genetically engineered multiple cloning region with sites for several restriction enzymes)
2 严紧型质粒与松驰型质粒的区别
严紧型质粒
松驰型质粒
质粒复制所需的酶
每个细胞中所含的质 粒数 质粒复制与细菌复制 的关系 在基因克隆中的应用 前景
DNA聚合酶 Ⅲ
1～5个
密切
小
DNA聚合酶Ⅰ
10～200个以上 能在没有蛋白质合成 的情况下继续复制
大
3 Specificity of Plasmid Vectors
构成：质粒复制起始点、一个或多个限制性 内切酶位点、抗药性基因、λ噬菌体的cos位 点。粘粒载体大小为4～6kb。
粘粒克隆外源DNA的步骤：
外源DNA与粘粒载体用同一种内切酶酶切； 连接酶连接，外源DNA插入到两个线状粘粒之间； 离体包装，组成成熟的噬菌体颗粒。该过程对DNA分子长 度有严格的限制，过长或过短均不能被包装，所以虽然粘 粒只有几千个碱基，但要求插入的外源基因却必须是大片 段（25～45kb）。 体外包装好的颗粒感染宿主菌，重组载体由于缺乏噬菌体 其他部分基因，故不能像噬菌体一样复制，只能像质粒一 样扩增。
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、 复制起始点（ori）
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
外源基因插入载体后，lacZ被破坏，不能分解 X-gal，菌落呈白色。——“蓝白斑”筛选法。
7质粒载体的主要用途
保存和扩增片段小于2kb的DNA； 构建cDNA文库； 目的DNA测序； 制备探针。
缺点：所能接受的DNA片段容量小；转化效率低。
三、λ噬菌体载体
λ噬菌体的基因组是约50kb的线性双链 DNA分子，两端各有12个核苷酸的5’突 出，碱基互补（cos位点，又称粘端）。 λ噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基 配对而结合，形成环状DNA分子。
此载体中央部分两端有三个酶切位点。可插 入片段的长度约9～22kb，主要用于构建基因 组文库。
不足：
λ噬菌体载体在进行真核基因组文 库构建时，其容量仍然受到一定的限 制。最大插入片段不能超过23kb。
四、粘粒载体
1978年构建，由质粒和噬菌体的cos粘 性末端构建而成。插入片段29～45kb。 可根据载体携带的抗药性标记筛选阳性 克隆细胞株。
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
multiple cloning sites
人工合成的DNA序列，含有密 集排列的多种限制性内切酶识别 序列，以利于不同来源的外源 DNA片段插入载体。
pBR系列载体
4 pBR质粒载体筛选的原理
5 pBR质粒载体的筛选方法——双抗生素对照筛选法
6 pUC系列载体
（1）构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。