土壤生态学实验指导 PDF

土壤生态学实验指导 PDF
1 土壤生态学曹志平胡菊编 2007年10月24日资源环境学院生态系
2 实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量--------------------1 实验二、土壤中线虫的分离方法及杀死固定--------------------4 实验三、土壤螨类的分离------------------------------------6
实验四、氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳 3 实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量目前国际上通常采用的有直接计数法和间接计数法两种。

直接计数法direct counting method顾名思义就是对土壤中的原生动物不进行培养而是取一定量的新鲜土壤加一定量的水或土壤浸出液摇匀后即进行镜检得到土壤原生动物丰度单位重量土壤中的原生动物个数。

间接记数法主要是培养记数法。

鉴于土壤这一特定环境土壤原生动物种类都能形成胞囊以渡过土壤干旱环境。

风干后土壤原生动物形成的胞囊用培养的方法诱导脱开胞囊以推知其种类和数量分布。

在培养过程中一切器皿、培养基均经高压灭菌接种时也应避免尘埃落入以确保培养不受污染。

本实验主要采用Singh1995和Stout1962的“3级10倍”环式稀释法。

仪器、设备和材料烘箱、培养箱、灭菌锅、培养箱、镊子、玻璃环、三角瓶、烧杯等。

方法与步骤 1土样采集土壤原生动物很难直接从土壤、水体中采集要通过室内培养。

土壤原生动物在土壤环境干旱时都能形成胞囊以等待土壤水分来临后再脱胞囊而活动。

所以土壤原生动物的采集实际上是采集土壤样品带回实验室进行培养而取得标本。

由于原生动物在土壤中的分布是不均匀的因此在一个采样区内需采集10个采样点。

用圆形采样器取土样把土样放入铝盒带回室内。

在培养之前需测定土样含水量。

2 稀释土样 2克风干土样如有条件也可以直接用湿土加18毫升无菌水充分振荡可用超声波仪粉碎土壤使之与水充分混合这时的稀释度为10然后用定量吸管吸取2毫升102的土壤悬浮液加入18毫升无菌水充分摇匀此时稀释
度为103。

依此法逐级稀释即可得到103、104、105、106????的稀释液。

根据原生动物的丰富度选择土壤的稀释度但每一定量土样均要选择连续的3个稀释度即“3级10倍”之意图1。

3培养基制备 0.5克氯化钠加1.2克琼脂加98毫升蒸馏水如用量较多可按此比例增加搅拌后在高压灭菌锅中加热灭菌然后趁热到入培养皿在凝固之前插入5个内径为1.8厘米、高为0.6厘米的玻璃环。

每个土样需6个培养皿30个玻璃环。

4接种、培养和镜检取其中的连续3级悬浮液摇匀后每级稀释液各取1ml接种于各自的玻璃杯内即1、2号培养皿的10个玻璃杯内各滴入1ml第一级稀释液同样3、4号和5、6号培养皿的10个玻璃杯内分别滴入第二级和第三级稀释液第一、二、三级稀释液的稀释度是多少则取决于研究的土壤中原生动物数目的多寡如采用104-106稀释度系列则第一级稀释液为104第二级为105第三级为106置于光照培养箱25?以下培养图1。

分别在第4、7、11天时在低倍镜下观察每个环中有无原生动物按肉足虫、鞭毛虫、纤毛虫分别记录。

低倍镜下可分清此三大类但无法鉴定种类。

可在实验结束时再吸出在高倍镜或油镜下鉴定种类。

4 图1 土壤原生动物定量培养法的稀释和接种示意图 5 结果统计根据未出现环数查Stout“3级10倍稀释法”表1原生动物密度换算表得知每克土壤中的原生动物数量即密度。

例如已知鞭毛虫在30个环中有5环中未出现则查表得λ69.5若稀释度为104-106则鞭毛虫的密度为695000个/克土壤。

肉足虫和纤毛虫的密度也同此法求得三大类密度之和即为总的原生动物密度。

这是根据微生物数量统计法的原理从没有原生动物和土壤稀释度求出最或然数MPN以此推断每克风干土壤中原生动物数量。

将表上查得的数量乘以土壤湿度即为每克湿土中原生动物数量。

表1 “3级10倍”环式稀释法原生动物密度换算表Stout1962 无原生动物的环数λ 土壤中原生动物的个数/g
10-103 102-104 103-105 1 230.3 2303 23030 230300 2 160.9 1609 16090 160900 3
120.4 1204 12040 120400 4 91.6 916 9160 91600 5 69.5 695 6950 69500 6 52.0 520
5200 52000 7 38.7 387 3870 38700 8 29.2 292 2920 29200 9 22.7 227 2270 22700 10
18.0 180 1800 18000 5 11 14.5 145 1450 14500 12 1107 117 1170 11700 13 9.42 94 942
9420 14 7.52 75 752 7520 15 5.90 59 590 5900 16 4.56 45 456 4560 17 3.51 35 351 3510
18 2.73 27 273 2730 19 2.16 21 216 2160 20 1.73 17 173 1730 21 1.40 14 140 1400 22
1.14 11 114 1140 23 0.92 9 92 920 24 0.74 7 74 740 25 0.58 6 58 580
26 0.44 4 44 440
27 0.31 3 31 310 28 0.20 2 20 200 29 0.09 1 9 90 30 0.00 0 0 0 6 实验二、土壤中线虫的
分离方法及杀死固定分离线虫方法多种多样主要根据分离线虫的种类和数量、寄主
植物种类、标本的固有属性、采集时间和所分离线虫的用途而定。

本文介绍传统的
贝曼漏斗法和经改良后的淘洗—过筛—离心法。

一贝曼漏斗法贝曼漏斗法是
Baermann于1917年提出来。

其本原理是线虫是喜水动物遇水便会从土壤或植物组织
内游出同时由于地心引力及线虫自身的重量便会下沉至漏斗的管内集中。

这种方法
仅限分离活动性的蠕虫型线虫对死虫、不活动的线虫和虫态如胞囊线虫和根结线虫
的雌虫则是无效的。

仪器、设备和材料贝曼漏斗试验装置如图2。

常用的是直径为
8-10厘米的玻璃漏斗漏斗管连在一段乳胶管以止水夹弹簧夹控制胶管的开闭漏斗放
在或铁架台上或自制的木制漏斗架的圆环内。

图2 贝曼漏斗法Baermann funnel分离
线虫示意图刘维志1995 方法与步骤取土样或含线虫的植物材料如根系切成大约
0.5厘米-1厘米长的小段用四层纱布或二层高级卫生纸棉质包住土样或根样轻轻放
入盛水的漏斗内令水漫过、浸透如水量不足轻轻加水防止冲出泥浆经48小时用空烧
杯接在漏斗的胶管内轻轻松开止水夹从漏斗流出水内含大量线虫。

关闭胶管向漏斗
轻轻补充清水可以再次收集线 7 虫。

二淘洗—过筛—离心法淘洗—过筛—离心法
是在几种最基本的分离方法上为适应大量快速分离线虫的要求而改进的一种方法。

其基本原理是根据虫体大小及线虫的密度比水轻或与水的密度接近线虫在淘洗过程
中可浮在水面或悬浮在水中。

在过筛时依虫体大小可以在不同筛目上收集线虫。

过
筛时往往在密筛如325目上留有很多泥浆。

为了进一步把线虫从泥浆中分离出来可利
用比重差异应用不同浓度的蔗糖溶液或其他制剂密度比水大结合离心的方法使收集
到的线虫更加纯净。

仪器、设备和材料 1.仪器、设备 40、60、325目筛子各一低
速离心机100ml或大于100ml离心管天平250ml烧杯脸盆洗瓶喷头试管洗干净的青霉
素瓶。

2.材料 TAF固定液三乙醇胺—福尔马林固定液吸取2ml 40甲醛7ml 三乙醇
胺溶于91ml蒸馏水。

蔗糖溶液454克蔗糖溶于1000ml水中密度1.18g/cm3浓度为
38.5。

方法与步骤 1 线虫标本的采集。

挖取植株根系去掉5cm表土在根围5-20cm
深度取带根土样500cm3左右放在大塑料袋中在小塑料袋中放入标签注明采集寄主、
地点、采集人将小塑料袋放入大塑料袋中封口后带回实验室。

2 分离过程。

淘洗
程序从40目、60目和325目筛子上过筛40目筛内收集根系有根结线虫编号后存入塑料
袋内60目筛内收集胞囊亦存入塑料袋内把325目筛子里的泥浆内含线虫洗入烧杯
150ml左右。

离心程序 1 将烧杯里的泥浆倒入离心管250ml称重平衡 2 将离心管
放入离心机中1000转/分离心4-5分钟。

3 倾去上清液加入蔗糖液38.5称重离心15秒
钟1000转/分离心 4 用烧杯收集上清液加水稀释防止蔗糖液渗透压过高虫体破裂。

5 烧杯中的上清液在325目筛子过筛筛子倾斜将325目筛上的线冲洗到烧杯里再转入
试管里将试管垂直放置过夜24-48小时夏天时间短春、秋季时间长饥饿把上清液用长
吸管吸掉试管底部为线虫。

3 杀死.。

向试管加入热水到60?将线虫杀死15分钟。

4 固定。

1 将下部虫液用吸管吸入青霉素瓶加入固定液。

2 固定一周后再换洗固定液永久保存。

固定两周后才能进行鉴定。

8 实验三、土壤螨类的分离仪器、设备和材料 1 仪器、设备干漏斗架、40瓦灯泡若干、塑料瓶、载玻片、盖玻片、解剖镜、挑针、吸管、显微镜。

2 试剂霍氏封固剂Hoyers medium配方为阿拉伯树胶15克水合氯醛100克纯甘油10克蒸馏水25毫升。

该封固剂的配制按下列程序进行先将阿拉伯树胶粉状或结晶完全溶解于蒸馏水然后再加入水合氯醛和甘油再经过滤去杂。

为便于阿拉伯树胶的完全溶解可稍加大蒸馏水用量减低了粘度也便于过滤。

待滤过后将清夜置如水浴锅上加热以蒸发多加的水分。

75酒精量取790ml95乙醇用蒸馏水稀释1000ml。

方法与步骤 1土壤螨的搜集称量250300克土样置干漏斗带铁丝网的盘中在放置盛有75酒精的塑料瓶注意瓶口于漏斗出口对齐并注意补充塑料瓶中的酒精溶液防止干涸。

这样使用40瓦灯泡连续光照48小时盖上塑料瓶既可。

2清洗保存。

对体表有粘附物的标本要进行清洗用细毛笔在50酒精中洗涮体表剔除粘附物但不要损坏体表结构。

以上方法不能去污时可以将标本放入封固液中拨动标本让封固液粘去污物。

牢固的粘附物可用超声波震荡仪清洗根
据虫体大小确定清洗时间防止虫体被震碎。

为准确观察虫褰峁褂α粝乱恍?瓯静磺逑础?3透明去污后的标本必须进行透明最常用的有效方法是用乳酸浸泡。

为了缩短透明时间可放在温箱或灯光下加热透明时间根据标本大小、温度及乳酸浓度而定。

个体越大温度越低乳酸浓度越低透明时间越长。

只要标本已透明就应该将标本取出来放在7075的酒精中保存。

有些甲螨标本体色极深可用过氧化氢去色但不必过份漂白。

4临时玻片与永久玻片的制作临时玻片用盖玻片封盖凹玻片的半个凹孔加入乳酸放入标本整形调整位置固定马上可以镜检完成后放入酒精中保存图3。

永久玻片将处理好的标本放在载玻片上沾一小点霍氏封固液于近旁将标本整肢象中气门螨类应尽量使四足伸展甲螨标本比较圆厚应固定位置让封固液稍干后覆上加有封固液的盖玻片。

为了更完整、准确得镜检还常需解剖标本解剖需根据标本身体结构以甲螨为例图3可先从后半体背腹沟将后背板剖开再卸下四足、前背板、口器和基节板、腹板依次制片。

永久玻片干涸后沿盖玻片四周涂上一圈指甲油以免受潮滑片。

9 图3 螨类标本制片法 A.B.临时封片法C:解剖标本永久制片法实验四、氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳一、采样与样品预处理土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。

采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物如蚯蚓等然后迅速过筛23 mm或放在低温下24?保存。

如果土壤太湿无法过筛进行晾干时必须经常翻动土壤避免局部风干导致微生物死亡。

过筛的土壤样品调节到田间持水量的50左右在室温下于密闭装置中预培养1周密闭容器中要放入两个50mL的烧杯分别加入水和稀NaOH以保持其湿度和吸收释放的CO2。

预培养后的土壤最好立即分析若需要放置一段时间在低温下24?最好不要超过10d。

二、方法—氯仿薰蒸浸提法FE 1、方法原理土壤经氯仿薰蒸处理微生物被杀死细胞破裂后细胞内容物释放到土壤中导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。

通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。

浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定也可用微量碳分析仪测定。

此处介绍比较简单的重铬酸钾容量
方法。

2、仪器及设备培养箱真空干燥器真空泵往复式振荡机速率200rev/min冰柜磷酸浴。

3、试剂 1.无乙醇氯仿量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中加
入50mL硫酸溶液H2SO45充分摇匀弃除下层硫酸溶液如此进行3次。

再加入50 mL 去离子水同上摇匀弃去上部的水分如此进行5次。

将
下层的氯仿转移到蒸馏瓶中在62?的水浴中蒸馏馏出液存放在棕色瓶中并加入
约20g无水K2CO3在冰箱的冷藏 10 室中保存备用。

2.硫酸钾溶液cK2SO4 0.5 mol?L-1:
称取硫酸钾K2SO4化学纯87.10g加热溶于去离子水中稀释至1L。

可加热溶解3.重铬酸钾c1/6K2Cr2O70. 4000 mol?L-1: 称取经130 oC烘干23h的重铬酸钾
K2Cr2O7分析纯19.622g溶于1000mL的去离子水中。

其他浓度9.811 g 4.9055 g 4.邻啡罗啉指示剂称取邻啡罗啉指示剂C12H8N2?H2O分析纯1.49g溶于含有0.70g FeSO4?7H2O的100mL去离子水中密闭保存于棕色瓶中。

5.硫酸亚铁溶液
cFeSO40.0333 mol?L-1称取硫酸亚铁FeSO4?7H2O化学纯9.26g溶解于600800mL
去离子水中加浓硫酸化学纯20mL搅拌均匀定容至1000mL于棕色瓶中保存。

此溶液不稳定需每天标定其浓度。

硫酸亚铁溶液浓度的标定吸取重铬酸钾标准溶液试剂85.00mL放入100mL三角瓶中加水约20mL加浓硫酸5mL和邻啡罗啉指示剂2滴用FeSO4溶液滴定根据FeSO4溶液的消耗量即可计算FeSO4溶液的准确浓度。

4、操作步骤 4.1薰蒸称取相当于20.0g烘干土重的湿润土壤3份分别放在约100 mL
的烧杯中一起放入同一干燥器中干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度同时放入一个装有50mL NaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片用少量凡士林密封干燥器用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2 min。

关闭干燥器的阀门在25oC的黑暗条件下放置24h。

打开阀门如果没有空气流动的声音表示干燥器漏气应重新称样进行薰蒸处理。

当干燥器不漏气时取出装有水、碱液和氯仿的烧杯氯仿倒
回瓶中可重复使用。

擦尽干燥器底部用真空泵反复抽气每一次都要打开干燥器以加快除去氯仿的速度直到土壤闻不到氯仿气味为止。

5.2浸提薰蒸结束后将土壤全部转移到250 mL的三角瓶中加入40 mL 0.5mol/LK2SO4溶液在振荡机上振荡浸提30min25?185rev/min转速根据仪器进行调整必须使得土壤完全振荡开过滤。

薰蒸开始的同时称取等量土壤3份同上用K2SO4溶液试剂2浸提同时做不加土壤为空白对照。

浸提液在室温下可以放置1周4?下放置1个月或在-15oC下保存。

6.3测定准确吸取浸出液10.00 mL放入硬质消煮管中加入重铬酸钾标准溶液试剂35.00 mL、浓H2SO4 5mL加入少量的抗暴物质在170-180?磷酸浴上煮沸10min冷却后用去离子水全部转移至150mL三角瓶中总体积为70mL左右。

加入2滴邻啡罗啉指示剂用硫酸亚铁溶液试剂5滴定剩余的K2Cr2O7。

4.4 测定土壤含水量称5.00g 上述湿润土壤放在铝盒中在105?烘箱中烘8h然后称其干重。

5、结果计算 1.有机碳Oc的计算 11 WC V0-V1×c×3×ts × 1000 /DW 式中WC 有机碳Oc质量分数mg?kg-1 V0 滴定空白样时所消耗的FeSO4体积mL V1 滴定样品时所消耗的FeSO4体积mL c FeSO4溶液的浓度mol?L-1 3 碳1/4C的毫摩尔质量M1/4C3mg/mmol 1000 转换为kg的系数 ts 分取倍数 DW 土壤的烘干质量g。

2.生物量碳Bc的计算 WC2.64Ec 式中WC 微生物量碳Bc质量分数mg?kg-1 Ec 薰蒸土样有机碳量与未薰蒸土样有机碳量之差mg?kg-1。