三种主要酶活测定方法
酶活性测定的原理
酶活性测定的原理
酶活性测定的原理是通过测量酶催化下特定底物转化为产物的速率来反映酶的活性水平。
主要有以下几种常用方法：
1. 光度法：利用酶催化下底物与某些试剂反应产生有色产物或吸收物质，通过测量产物的吸光度变化来间接评估酶活性。
例如，过氧化物酶活性的测定可以使用过氧化氢和染色剂底物，通过测量产物有色化合物的吸光度变化来评估。
2. 放射性同位素法：将底物标记上放射性同位素，通过测量酶催化下放射性同位素的放射活性来确定酶活性。
例如，通过添加放射性标记的底物[^3H]葡萄糖，测量酶催化下的葡萄糖转化为[^3H]二氧化碳的速率来评估葡萄糖酶活性。
3. 荧光法：利用酶催化下底物与某些荧光试剂反应产生荧光物质，通过测量产物的荧光强度变化来评估酶活性。
例如，酸性磷酸酶活性的测定可以使用荧光底物4-甲基硝基苯磷酸，通过测量产生的荧光信号来评估酶活性。
4. 比色法：利用酶催化下底物与某些试剂反应产生可测定的颜色变化，通过测量产物的颜色强度来评估酶活性。
例如，硫酸酯酶活性的测定可以使用对硫酸酯类底物水解产生的有色产物对硝基酚，通过测量颜色强度来评价酶活性。
这些方法均基于酶催化下底物转化为产物的反应，并结合了不同的测定原理和技术手段来获取酶活性的定量数据。
酶检测方法
酶检测方法引言酶是一类生物催化剂，能够加速化学反应速率而不被消耗。
酶检测方法是通过测定酶活性或酶与底物的反应产物来评估酶的功能和浓度。
酶检测方法在生物医学研究、生物工程、食品检测等领域具有广泛的应用。
酶检测方法的分类酶检测方法可以根据测定酶活性的原理和方法进行分类，常见的分类包括：1.光度法：利用酶催化反应产生的吸光度变化来测定酶活性。
常见的方法有比色法、荧光法和发光法等。
其中，比色法是一种常用的酶检测方法，通过测定反应产物的吸光度来间接测定酶活性。
2.电化学法：利用酶催化反应产生的电流变化来测定酶活性。
常见的方法有电化学阻抗法、循环伏安法和恒电位法等。
电化学法具有高灵敏度、高选择性和实时监测等优点，广泛应用于生物传感器和生物芯片等领域。
3.质谱法：利用质谱仪测定酶催化反应产生的质荷比变化来测定酶活性。
质谱法具有高分辨率、高灵敏度和高特异性等优点，适用于复杂样品的酶活性测定。
4.核磁共振法：利用核磁共振仪测定酶催化反应产生的核磁共振信号变化来测定酶活性。
核磁共振法具有非破坏性、无辐射和无需标记等优点，适用于生物体内酶活性的测定。
5.荧光法：利用酶催化反应产生的荧光信号变化来测定酶活性。
荧光法具有高灵敏度、高选择性和实时监测等优点，广泛应用于生物分子的定量和定位分析。
酶检测方法的步骤酶检测方法的一般步骤包括：1.样品制备：将待测样品进行处理，如离心、过滤、稀释等，以获得适合测定的样品。
2.酶反应体系的建立：根据待测酶的特性和反应条件，选择适当的底物、辅酶、缓冲液和温度等，建立酶反应体系。
3.酶反应的进行：将样品与酶反应体系混合，在恒定的温度和pH条件下进行酶反应。
4.反应终止：通过改变反应条件或添加反应终止剂等方式，停止酶反应。
5.产物的测定：根据酶反应产生的产物特性，选择相应的测定方法进行测定。
常见的方法有分光光度法、荧光法、电化学法等。
6.数据分析：根据测定结果，计算酶活性或酶浓度，并进行数据分析和统计处理。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶的三种活力测定方法纤维素酶是一种广泛存在于自然界中的酶类，具有重要的降解纤维素的功能。
对于工业生产、环境保护及生物能源等领域都有着极为广泛的应用。
因此，纤维素酶的测定方法也越来越受到研究者的关注。
本文将针对纤维素酶的三种活力测定方法进行详细介绍。
一、滴定法滴定法是最为简单、传统的纤维素酶活力测定方法。
其操作步骤相对较简单，但由于其受试物中的葡萄糖数量较小，因此准确度不如其他测定方法。
滴定法的具体操作步骤如下：1.采用苯酚褐或者硫酸铜-硫氰化钾将葡萄糖转化为光滑葡萄糖2.使用离子交换树脂净化试样3.通过酸水解，将可分离出的光滑葡萄糖转化为葡萄糖4.通过NaOH溶液中添加试样，测定试样所需要的NaOH溶液的体积二、反向相色谱法反向相色谱法是一种基于色谱技术的测定方法。
比滴定法更加准确且可靠。
反向相色谱法可以通过改变样品与固相载体的交互时间，实现对样品组分的分离。
其操作步骤如下：1.使用有机溶剂混合纤维素样品2.净化溶液，分离部分有机溶剂和水3.试样在反向相色谱柱上，随柱子流动4.通过检测器检测滴量，确定样品的浓度三、淀粉-纤维素显色法淀粉-纤维素显色法是一种基于酶法和化学显色技术结合的测定方法。
其同时测定酶反应的数量和反应的速率，可以获得相对准确的数据。
具体操作过程如下：1.样品中的淀粉与纤维素同时与碘反应2.通过求字头光度的变化及测试时间的变化，测定酶的活力3.以酶动力学为基础，通过数据分析得到相应的酶反应速率总结起来，以上三种方法均可用于纤维素酶的活力测定。
针对不同的需求，可以选择适当的方法进行测定。
其中，受试物的纯度和净化程度是影响精度的关键因素，因此在测定前要进行适当的纯化。
在生产过程中，可以选择淀粉-纤维素显色法作为主要测定方法，以保证产物质量的稳定性和可控性。
酶活性的检测方法
DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
rnasea酶活定义
rnasea酶活定义RNaseA 酶活是指核酸酶 A 在特定条件下能够水解 RNA 的速率，也是衡量 RNaseA 酶质量的关键指标之一。
RNaseA 酶活的测定方法主要有三种，包括荧光素试剂法、吸收光谱法以及凝胶电泳法，下面将进行详细介绍。
第一步：荧光素试剂法荧光素试剂法是目前应用最广的 RNaseA 酶活测定方法之一。
该方法的原理是在 RNaseA 酶作用下， RNA 分子被水解成短链 RNA，而短链 RNA 分子进一步被荧光素试剂反应，生成荧光物质。
荧光素的荧光强度与 RNaseA 酶的酶活成正比。
该方法需要一定的实验操作技巧和仪器设备，但其灵敏度高、操作简便、精度高，因此广受欢迎。
第二步：吸收光谱法吸收光谱法是一种通过检测 RNaseA 酶作用后 RNA 分子吸收光谱的变化来测定酶活的方法。
RNA 分子的吸收峰在 260nm，而 RNA 水解后生成较短的寡核苷酸，每个寡核苷酸的吸收峰最大在 260nm 左右，而且其浓度增加，吸收峰也相应增加。
因此，通过监测 260nm 点的吸收峰大小及其变化，可以测定 RNaseA 酶活。
但是该方法需要高浓度的 RNA 样品和专业的实验技能，使用范围比较有限。
第三步：凝胶电泳法凝胶电泳法是目前常用的 RNaseA 酶活测定方法之一。
其原理是在凝胶电泳中加入未水解的 RNA 样品和 RNaseA 酶，然后检测 RNA的降解情况。
一般会分别在 120V 和 10V 下电泳 1小时，通过对 RNA 线带的比例和定量泳动判断 RNaseA 酶的酶活。
凝胶电泳法需要懂得凝胶制备、RNA装载、电泳条件设置等操作技巧和实验室专业设备，用于大批量检测中比较可行。
总结：综上，RNaseA 酶活是衡量 RNaseA 酶质量的关键指标之一，其含量的高低直接影响酶的活性和效果。
荧光素试剂法、吸收光谱法和凝胶电泳法都是常用的 RNaseA 酶活测定方法，不同方法依靠的原理各自不同，灵敏度、操作难度、实验时间等参数不同，实验者应选择适合自己的方法进行判断。
酶标仪终点法、动力学法和光谱扫描
酶标仪是一种用于测定酶活性的仪器，它可以通过多种方法来检测酶对底物的作用，其中包括终点法、动力学法和光谱扫描。
这三种方法各有特点，适用于不同类型的酶活性研究。
在本文中，我将深入探讨这三种方法的原理、应用和局限性，以便你能更全面地了解酶标仪在酶活性研究中的应用。
1. 酶标仪终点法酶标仪终点法是通过观察反应终点时酶对底物的转化情况来测定酶活性的一种方法。
在进行实验时，可以在不同时间点上停止反应，并通过测定产物的浓度来推断酶在不同时间点上的活性水平。
这种方法简单易行，特别适用于一些较为稳定的酶反应。
然而，由于无法确定反应速率的变化情况，终点法并不能提供酶反应动力学信息，因此在动态反应中的应用受到一定的局限。
2. 酶标仪动力学法相较于终点法，酶标仪动力学法能够提供更为全面的酶活性信息。
动力学法通过实时监测酶对底物的转化速率来确定酶活性的变化情况，从而可以得到酶的最大反应速率、米氏常数等重要参数。
这种方法适用于研究酶对底物的实时作用情况，能够全面了解酶的活性特性。
然而，动力学法需要实时测量反应产物的浓度变化，因此在实验设计和数据处理上较为繁琐，需要较高的实验技术。
3. 酶标仪光谱扫描除了以上两种方法外，酶标仪还可以通过光谱扫描来测定酶活性。
这种方法是通过监测反应产物在不同波长下的吸光度来推断酶对底物的转化情况，特别适用于一些对底物和产物的吸收光谱有明显差异的酶反应。
光谱扫描方法可以提供关于酶对底物的选择性和反应特异性的信息，对于特定类型的酶研究有重要意义。
然而，由于光谱扫描需要对反应产物的吸收特性进行精确测量，因此对于实验条件和数据校准要求较高。
综合来看，酶标仪终点法、动力学法和光谱扫描各有其适用范围和局限性。
在实际研究中，研究人员可以根据不同酶反应的特点选择合适的方法来进行酶活性测定。
而在今后的研究中，可以借助多种方法的综合应用，在更全面、深入地了解酶反应特性的基础上进一步探索酶的活性调控和应用前景。
在个人观点上，我认为酶标仪作为一种重要的酶活性测定仪器，在生物医学、生物工程和药物研发等领域具有重要应用前景。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶活检测方法
酶活检测方法酶活检测方法是一种常见的生化实验方法，通过测定酶活性来评估生物体内某种特定酶的功能状态。
酶是生物体内的一种催化剂，可以加速化学反应的速率。
酶活检测方法通常用于生物医学研究和临床诊断中，其优点包括高灵敏度、高特异性和快速检测结果等。
酶活检测方法的原理是利用某种底物与酶反应产生的产物的化学性质不同，通过测量反应物或产物的浓度变化来评估酶活性。
常用的酶活检测方法包括光度法、荧光法、比色法等。
光度法是一种常用的酶活检测方法，它利用酶催化反应产生的产物吸收或散射光线的变化来测定酶活性。
光度法适用于测定酶活性较低的样品，如血清中的酶活性。
荧光法是一种高灵敏度的酶活检测方法，它利用酶催化反应产生的产物吸收或发射荧光的性质来测定酶活性。
荧光法适用于测定酶活性较高的样品，如细胞内的酶活性。
比色法是一种常用的酶活检测方法，它利用酶催化反应产生的产物吸收或反射光线的颜色变化来测定酶活性。
比色法适用于测定酶活性中等的样品，如尿液中的酶活性。
酶活检测方法的操作步骤包括样品处理、反应体系制备、反应条件控制、反应终止和测定等。
样品处理是酶活检测方法中的关键步骤，样品的处理方法应该根据不同的样品类型和检测要求进行不同的处理。
在酶活检测方法中，需要注意的是选择适当的底物和反应条件，以及对反应终止和测定的方法进行优化，以获得准确、可重复的结果。
此外，酶活检测方法还需要进行质量控制和质量保证，以确保实验结果的准确性和可靠性。
酶活检测方法是一种常用的生化实验方法，适用于生物医学研究和临床诊断中。
酶活检测方法的原理简单、操作方便、结果准确可靠，是现代生物医学研究和临床诊断的重要工具。
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶活性测定方法
酶活性测定方法磷酸酶是一类涉及重要生命过程的酶，研究它们在许多生理病理过程中的功能及其调控机制对了解细胞代谢，发育和信号转导的重要意义。
磷酸酶的活性可以通过测定其反应中形成的产物的数量来评价。
该测定可以为研究它们在特定环境中的活性变化提供重要的信息，因此，磷酸酶活性测定方法对于生物学研究显得尤为重要。
磷酸酶活性测定可以采用多种方法完成，其中，最常用的色谱法、光度法、EC法等。
一、色谱法色谱法是一种测定磷酸酶活性的常用方法，它采用磷酸酶催化把被测物质（典型的指磷酸核苷等）水解后形成可见的特异物质，其吸光度可以被检测和测定。
实施此方法的具体流程是：（1）振荡：将磷酸酶、被测样本、受体者和调节剂等组分，按照一定比例配制在离心管中，在一定温度下振荡混匀；（2）定量：经过一定时间的反应，取样经过色谱检测，测定经磷酸酶催化水解后形成的特异物质的吸光度，以计算出磷酸酶活性；（3）统计处理：比较样本和标准曲线，对测定磷酸酶活性做出统计处理，得出最终结果。
二、光度法光度法是直接测定磷酸酶反应中受体者的吸光度来计算磷酸酶活性的方法，其具体原理是：当受体者发生磷酸酶催化水解反应时，会形成有明显吸光度的特定产物，其吸光度及得数可以用来计算磷酸酶活性。
三、EC法EC法是用电导率检测磷酸酶引起受体物质离子化的方法，它是一种快速精确、方便有效的测量磷酸酶活性的方法；其原理是：当受体物质在磷酸酶的作用下水解发生时，电导率会发生显著增加，根据其程度及电导率值变化程度，可以直接由测试数据计算磷酸酶的活性。
以上就是磷酸酶活性测定的三种常用分析方法，它们各自具有自身的优缺点，实验者可以根据自身需求选择适合的分析方法，从而更直观的分析和了解磷酸酶活性的变化情况。
测土壤酶活方法
测土壤酶活方法酶活性是评价土壤质量和生物活性的重要指标之一。
测定土壤酶活性可以帮助我们了解土壤中微生物的活动水平和土壤中有机物的分解能力，从而判断土壤的肥力和健康状况。
本文将介绍几种常用的测土壤酶活性的方法。
一、脲酶法测定土壤酶活性脲酶法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。
该方法是通过测定土壤中脲酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。
脲酶是一种催化尿素分解的酶，可以将尿素分解为氨和二氧化碳。
测定土壤中脲酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。
脲酶法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有尿素和缓冲液的试剂混合。
2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。
3. 用碱性试剂滴定未反应的尿素，计算出脲酶的活性。
二、过氧化氢酶法测定土壤酶活性过氧化氢酶法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。
该方法是通过测定土壤中过氧化氢酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。
过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可以将过氧化氢分解为水和氧气。
测定土壤中过氧化氢酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。
过氧化氢酶法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有过氧化氢和缓冲液的试剂混合。
2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。
3. 用碱性试剂滴定未反应的过氧化氢，计算出过氧化氢酶的活性。
三、醋酸红法测定土壤酶活性醋酸红法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。
该方法是通过测定土壤中醋酸红酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。
醋酸红酶是一种催化醋酸红分解的酶，可以将醋酸红分解为醋酸和二氧化碳。
测定土壤中醋酸红酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。
醋酸红法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有醋酸红和缓冲液的试剂混合。
2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。
3. 用碱性试剂滴定未反应的醋酸红，计算出醋酸红酶的活性。
测定土壤酶活性可以通过脲酶法、过氧化氢酶法和醋酸红法等方法来进行。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
酶活测定 原理
酶活测定原理
酶活测定是一种常用的实验方法，用于测定酶在一定条件下的活性。
酶活性是指酶在特定条件下催化底物转化的速率，是衡量酶功能的重要指标。
酶活测定的原理基于酶与其底物之间的专一性反应。
当酶与底物结合形成酶-底物复合物时，酶会使底物发生化学反应，产生产物。
产物的生成量与酶活性成正比，可以作为测定酶活性的指标。
常见的酶活测定方法包括光度法、荧光法、融合法、电化学法等。
其中，光度法是最常用的方法之一。
该方法通过测量底物的某种性质的变化来间接测定酶活性。
例如，可以根据底物的吸光度变化来测定酶活性。
在酶活测定实验中，常使用专一底物来与特定的酶反应，以增强实验的专一性和敏感性。
同时，为了控制实验条件，通常需要对温度、pH值等参数进行调整，以确保实验结果的准确性和可比性。
酶活测定在许多生物学和生物化学研究中起到了重要的作用。
通过测定酶的活性，可以评估酶的功能状态、酶活性的变化以及酶与底物之间的相互作用。
这对于深入理解生物过程、研究酶的功能以及开发新药物等方面具有重要意义。
酶活测定的原理
酶活测定的原理酶活测定是一种用来定量测量酶活性的方法，酶活性是酶催化底物转化为产物的速率。
酶活测定的原理是通过测量底物的消耗或产物的生成来间接测量酶催化反应的速率。
酶活测定的原理可以分为两种方法：连续监测法和间断测定法。
1. 连续监测法：连续监测法是指在反应过程中连续测量底物浓度或产物浓度的变化，从而得到酶活性。
常用的连续监测法有光度法、荧光法、滴定法等。
光度法是通过测量酶催化反应后的混合物的吸光度的变化来确定酶活性。
在光度法中，可以选择适当的底物与酶催化反应形成产物，而该产物通常具有一定的吸光度。
通过不断监测反应体系的吸光度或透过率的变化，可以得到随时间变化的底物或产物浓度，并计算出酶活性。
荧光法和光度法类似，不同之处在于荧光法是通过测量荧光物质的荧光发射或吸收的变化来确定酶活性。
荧光法的优点是具有极高的灵敏度和选择性，适用于对底物和产物浓度要求较低的酶活测定。
滴定法是通过在酶催化反应过程中滴加一定浓度的滴定剂来测定酶活性。
滴定剂一般选择可以与底物或产物发生特定反应的化学物质。
当底物滴定到一定的量时滴定剂会发生颜色变化，从而可以通过滴定液的体积与时间的比值来计算酶活性。
2. 间断测定法：间断测定法是在一定时间内采集样品，在样品采集后通过颜色反应等方法测定底物或产物的浓度。
常用的间断测定法有比色法和电化学法。
比色法是通过底物和产物的颜色反应来测定酶活性。
比色法是酶测定中最常用的一种测定方法。
在比色法中，可以选择适当的底物与酶催化反应形成产物，而该产物通常具有一定的颜色。
在固定时间内，收集反应液并停止酶活，然后通过比色分析仪器来测定产物的吸光度或透过率变化，并通过标准曲线计算酶活性。
电化学法是通过通过电极与反应体系接触的方式来测定底物或产物的浓度。
常用的电化学法有电位法和电流法。
在电位法中，通过测量电极的电位变化来确定酶活性。
在电流法中，通过测量通过电极的电流变化来确定酶活性。
除了以上介绍的方法外，还有许多其他酶活测定方法，如色谱法、质谱法等。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
酶活的测定方法
酶活测试及试剂1 木素过氧化物酶（Lip）：3ml反应体系：①0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0) 1.5mL；②10mmol/L藜芦醇1.0mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，25℃反应3min。
于310nm测其光密度，以1.0mL缓冲液代替藜芦醇作空白对照，定义每分钟使1μmol的藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)，藜芦醛的摩尔吸光系数9 300 mol-1cm-1。
0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0)：配0.1mol/L的酒石酸和酒石酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为3.0。
（酒石酸：分子量75，0.1mol/L溶液为7.5g/L。
酒石酸钠：分子量230，0.1mol/L溶液为23g/L）10mmol/L藜芦醇：1.682g藜芦醇添加到1L水中即可（试剂藜芦（3,4-Dimethoxybenzyl alcohol）的分子量为168.19）10mmol/L H202（按1L计算）：称取1.13g过氧化氢试剂加入到1L纯水中即可（原试剂含30% H202）2 锰过氧化物酶（MnP）：3ml反应体系：① 0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5) 2.0mL；②15mmol/LMnSO4 0.5mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，37℃反应3min。
240nm测吸光值变化。
三价锰离子的吸光系数为8100 M−1 cm−1）0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5)：配0.05mol/L的琥珀酸和琥珀酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为4.5。
（琥珀酸：分子量118.09，0.05mol/L 溶液为5.9g/L。
琥珀酸钠：分子量270.15，0.05mol/L溶液为13.5g/L）15mmol/L MnSO4（按1L计算）：2.535g硫酸锰加入到1L纯水中溶解即可。
线粒体酶活性的测定方法
线粒体酶活性的测定方法
测定线粒体酶活性的方法主要分为三类：光度法、荧光法和电化学法。
1.光度法：
光度法是常见的酶活性测定方法之一。
通常使用4-氨基乙酚(AEBSF)或巴比妥酸等常用酶抑制剂，以阻止线粒体外膜和膜内酶的干扰。
其测定步骤如下：（1）将待测标本加入反应体系中，加入合适的底物，混匀后在恒温下孵育一定时间；
（2）加入显色剂，混匀后再孵育一定时间；
（3）停止反应，并测定反应体系中显色剂的吸光度值；
（4）通过与标准曲线对比，计算出待测样品的酶活性。
2.荧光法：
荧光法是利用荧光物质在线粒体内产生的荧光信号测定酶活性的一种方法。
在测定过程中，荧光物质可以通过与底物或反应产物结合，或与环境中某些分子发生作用而发出荧光信号，进而通过荧光强度的变化来反映酶活性的变化。
常用的荧光物质有琥珀酸钠（NADH）、亚麻酸和ATP等。
3.电化学法：
电化学法利用电极对电化学反应进行监测，测定酶活性的一种方法。
常用的电极有氧化还原电极（ORP）、电化学生物传感器等。
该方法对于测定酶活性具有高
灵敏度、高选择性和高重复性等优点。
通常先将待测标本加入反应体系中，然后通过电极测定反应体系中电压或电流的变化，反映出酶反应的速率和活性水平。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。
在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。
所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。
纤维素酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂1）甲苯2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。
3）pH5.5醋酸盐缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天），5）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
培养结束后，过滤并取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。
（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。
）四、结果计算纤维素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。
纤维素酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／ma样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m 表示烘干土重木聚糖酶活性测定方法一、方法原理样品的木聚糖酶对底物——燕麦木聚糖进行水解，用DNS（3，5－二硝基水杨酸）试剂分光光度法测定水解所产生的还原糖量。
二、活性单位定义在温度为50℃，pH 5.3条件下，1s内从燕麦木聚糖中产生1nmol木糖所需的酶量，为1个木聚糖酶的活性单位（BXU）。
三、应用范围本法用于来源于曲霉属（Aspergilious）或木霉属（Trichoderma）的木聚糖酶样品的测定。
当分析其它来源的酶时，该法的线性需要校正。
本法适用于各种含有木聚糖酶的产品。
四、测定条件4.1 底物：燕麦木聚糖4.2 pH：5.34.3 温度：50℃±0.5℃4.4 保温时间： 5min五、仪器5.1 超级恒温水浴锅：50℃5.2 水浴锅： 100℃5.3 旋涡磁力搅拌器5.4 分光光度计：可在540nm下测定吸光度5.5 分析天平：感量0.0001g六、试剂所有试剂溶液均需用去离子水配制。
6.1 柠檬酸缓冲液（0.05mol/l、pH5.3）溶解10.5g柠檬酸（C6H8O7•H2O）于800ml水中，并用1mol/L氢氧化钠调pH至5.3，（消耗约110ml 1mol/L氢氧化钠），再用水定容至1000ml。
6.2 底物—1%燕麦木聚糖称取1.0g燕麦木聚糖，溶于80ml 60℃柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。
用柠檬酸缓冲液定容至100ml。
此底物溶液在4℃时最多保存一周，或将底物溶液分成等份在-20℃下冰冻保存，临用前融解，搅拌均匀使用。
6.3 DNS试剂溶解50.0g 3，5二硝基水杨酸于4000ml水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0g 氢氧化钠，使之完全溶解，在继续磁力搅拌下，将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。
冷却至室温后定容至5000ml。
如溶液不澄清，用Wheatman1号滤纸过滤，然后室温保存于深色瓶中。
七、样品制备精确称取样品1.0000g，置于研钵内，加入5ml的柠檬酸缓冲液，研磨片刻，放置30min 后，用柠檬酸缓冲液稀释受检样品。
调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间。
八、测定步骤8.1 试样测定分别向2支试管加入1.8ml底物溶液，置50℃水浴保温5min。
在其中1支试管中加入200μl稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置50℃水浴中，准确保温5min。
分别加入3.0ml DNS 试剂至2支试管中，搅拌均匀。
在另一试管（空白管）中加入200μl缓冲液。
同时将2支试管置入沸水浴准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。
在540nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。
继续做2个重复测定。
8.2 标准曲线的制定8.2.1 配制10μmol/ml木糖储备液将150mg木糖溶解于柠檬酸缓冲液中，并用柠檬酸缓冲液定容至100ml。
储备液可分成小量在-20℃下冰冻。
使用前，融解并混合均匀。
8.2.2 配制标准稀释液用缓冲液稀释储备液配制以下标准稀释液：稀释比例木糖(μmol/ml) 酶活(BXU/ml)1+0 10.0 33.331+1 5.0 16.671+2 3.33 11.111+4 2.0 6.678.2.3 制备标准曲线每种标准稀释液做2次重复测定。
分别向2支试管中加入1.8ml底物溶液，50℃水浴保温5min。
加入3.0mlDNS试剂和200μl标准稀释液，在沸水浴中准确保温5min，冷却后在540nm处测量样品对试剂空白的吸光度。
以200μl柠檬酸缓冲液代替标准稀释液配制试剂空白。
每批样品制备一次标准曲线。
九、测定结果的计算木聚糖酶活性(BXU/g) = （木糖浓度*1000*稀释倍数）/（样品重量*反应时间300S）土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法）一、原理测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。
研究证明：磷酸酶有三种最适PH值：4~5、6~7、8~10。
因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.0~5.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.0~8.5）、和硼酸缓冲液（PH9~10）。
磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α-或者β-萘酚磷酸钠等。
现介绍磷酸苯二钠比色法。
二、试剂1）缓冲液：（1）醋酸盐缓冲液（PH 5.0）0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至1L.（2）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.0）0.1mol/L 柠檬酸溶液 19.2g C6H7O8溶至1L.0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.取6.4ml 0.1mol/L 柠檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至100ml. （3）硼酸盐缓冲液（PH 9.6）0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至1L.0.2mol/L NaOH溶液 8g NaOH溶至1L.取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀释至200ml.2）0.5% 磷酸苯二钠（用缓冲液配制）3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
4）甲苯5）0.3%硫酸铝溶液6）酚标准溶液酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，存于棕色瓶中。
酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液稀释至1L。
三、操作步骤称5g土样置于200ml三角瓶中，加2.5ml甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，37℃下培养24h。
然后在培养液加入100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上660nm处比色。
标准曲线绘制：取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml硼酸缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后，在分光光度计上660nm处比色。
以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
注意事项:1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。
2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。
3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样四、结果计算以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。
磷酸酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m表示烘干土重。