三种主要酶活测定方法
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土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)一、原理
纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下,它的最初水解产物是纤维二糖,在纤二糖酶作用下,纤维二糖分解成葡萄糖。所以,纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关,因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂
1)甲苯
2)1%羧甲基纤维素溶液:1g 羧甲基纤维素钠,用50%的乙醇溶至100ml。
3)pH5.5醋酸盐缓冲液:
0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.
0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.
取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4)3,5-二硝基水杨酸溶液:称1.25g二硝基水杨酸,溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中,再加75g酒石酸钾钠,用水稀释至250ml(保存期不过7天),
5)葡萄糖标准液(1mg/mL)
预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中,用蒸馏水溶解后,移至50mL容量瓶中,定容,摇匀(冰箱中4℃保存期约一星期)。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象,则应弃之,重新配制。
三、操作步骤
葡萄糖标准曲线:分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中,再补加蒸馏水至1mL,加DNS溶液3ml混匀,于沸腾水浴中加热5min,取出立即泠水浴中冷却至室温,以空白管调零在波长540nm处比色,以OD值为纵坐标,以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
称10g土壤置于50ml三角瓶中,加入1.5ml甲苯,摇匀后放置15min,再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液,将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。培养结束后,过滤并取1ml滤液,然后按绘制标准曲线显色法比色测定。(为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差,每一土样需做无基质对照,整个试验需做无土壤对照;如果样品吸光值超过标曲的最大值,则应该增加分取倍数或减少培养的土样。)
四、结果计算
纤维素酶活性以72h,1g干土生成葡萄糖毫克数表示。
纤维素酶活性=(a样品-a无土-a无基质)×n/m
a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数;n为分取倍数;m 表示烘干土重
木聚糖酶活性测定方法
一、方法原理
样品的木聚糖酶对底物——燕麦木聚糖进行水解,用DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂分光光度法测定水解所产生的还原糖量。
二、活性单位定义
在温度为50℃,pH 5.3条件下,1s内从燕麦木聚糖中产生1nmol木糖所需的酶量,为1个木聚糖酶的活性单位(BXU)。
三、应用范围
本法用于来源于曲霉属(Aspergilious)或木霉属(Trichoderma)的木聚糖酶样品的测定。当分析其它来源的酶时,该法的线性需要校正。本法适用于各种含有木聚糖酶的产品。
四、测定条件
4.1 底物:燕麦木聚糖
4.2 pH:
5.3
4.3 温度:50℃±0.5℃
4.4 保温时间: 5min
五、仪器
5.1 超级恒温水浴锅:50℃
5.2 水浴锅: 100℃
5.3 旋涡磁力搅拌器
5.4 分光光度计:可在540nm下测定吸光度
5.5 分析天平:感量0.0001g
六、试剂
所有试剂溶液均需用去离子水配制。
6.1 柠檬酸缓冲液(0.05mol/l、pH5.3)
溶解10.5g柠檬酸(C6H8O7•H2O)于800ml水中,并用1mol/L氢氧化钠调pH至
5.3,(消耗约110ml 1mol/L氢氧化钠),再用水定容至1000ml。
6.2 底物—1%燕麦木聚糖
称取1.0g燕麦木聚糖,溶于80ml 60℃柠檬酸缓冲液中,磁力搅拌加热至沸腾,继续搅拌冷却至室温,加盖缓慢搅拌过夜。用柠檬酸缓冲液定容至100ml。此底物溶液在4℃时最多保存一周,或将底物溶液分成等份在-20℃下冰冻保存,临用前融解,搅拌均匀使用。
6.3 DNS试剂
溶解50.0g 3,5二硝基水杨酸于4000ml水中,不断磁力搅拌,缓缓加入80.0g 氢氧化钠,使之完全溶解,在继续磁力搅拌下,将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入,并小心加热,溶液最高温度不超过45℃。冷却至室温后定容至5000ml。如溶液不澄清,用Wheatman1号滤纸过滤,然后室温保存于深色瓶中。
七、样品制备
精确称取样品1.0000g,置于研钵内,加入5ml的柠檬酸缓冲液,研磨片刻,放置30min 后,用柠檬酸缓冲液稀释受检样品。调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10~0.40之间。
八、测定步骤
8.1 试样测定
分别向2支试管加入1.8ml底物溶液,置50℃水浴保温5min。在其中1支试管中加入200μl稀释酶样,磁力旋转搅拌均匀,置50℃水浴中,准确保温5min。分别加入3.0ml DNS 试剂至2支试管中,搅拌均匀。在另一试管(空白管)中加入200μl缓冲液。同时将2支试管置入沸水浴准确保温5min,取出置入冷水中冷却至室温。在540nm处测量酶样对空白的吸光度,在酶活标准曲线上读取酶活,再乘以酶样稀释倍数。继续做2个重复测定。8.2 标准曲线的制定
8.2.1 配制10μmol/ml木糖储备液
将150mg木糖溶解于柠檬酸缓冲液中,并用柠檬酸缓冲液定容至100ml。储备液可分成小量在-20℃下冰冻。使用前,融解并混合均匀。
8.2.2 配制标准稀释液
用缓冲液稀释储备液配制以下标准稀释液:
稀释比例木糖(μmol/ml) 酶活(BXU/ml)
1+0 10.0 33.33
1+1 5.0 16.67
1+2 3.33 11.11
1+4 2.0 6.67
8.2.3 制备标准曲线
每种标准稀释液做2次重复测定。分别向2支试管中加入1.8ml底物溶液,50℃水浴保温5min。加入3.0mlDNS试剂和200μl标准稀释液,在沸水浴中准确保温5min,冷却后在540nm处测量样品对试剂空白的吸光度。以200μl柠檬酸缓冲液代替标准稀释液配制试剂空白。每批样品制备一次标准曲线。
九、测定结果的计算
木聚糖酶活性(BXU/g) = (木糖浓度*1000*稀释倍数)/(样品重量*反应时间300S)