水溶性维生素的高效液相色谱测定方法的研究1

[作者简介]　崔蓉(1967-),女,副教授,主要从事食品及生物样

品中金属及有机物的测定。

【测定方法】水溶性维生素的高效液相色谱测定方法的研究

崔　蓉,李　皎,王洪玮

(北京大学公共卫生学院,北京　100083)

[中图分类号]　O65717+2 [文献标识码]　A [文章编号]　1004-8685(2005)01-0055-03

水溶性维生素与人体的生长发育及健康密切相关。水溶

性维生素中又以维生素C及B族维生素较为重要。水溶性维

生素的测定方法主要包括荧光法[1]、微生物法[1]、高效液相色

谱法[2～6]等。本课题对维生素C、B1、B2、烟酸和烟酰胺的高效

液相色谱测定方法进行了研究,并采用该法对复合维生素制

剂和饮料中的上述5种水溶性维生素的含量进行了测定。

1　材料与方法

111　仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪包括Waters1525Binary HPLC

Pump;Waters717plus Autosampler;Waters2487DualλAb2

sorbance Detector。

抗坏血酸、磷酸二氢钾均为分析纯;盐酸硫胺、核黄素均

为生化纯;烟酸、烟酰胺均为化学纯;甲醇为色谱纯。

112　色谱条件

色谱柱:Waters Symmetry C18柱(416mm×150mm,

5μm);流动相:甲醇-磷酸二氢钾溶液(35+63)(p H=5111),

等度洗脱;柱温:室温;流速:0198ml/min;紫外检测波长:

265nm;进样量:10μl。

113　样品处理

11311　复合维生素片　取复合维生素片3片,精确称量,研

细。准确称取100mg研细的样品粉末置于烧杯中,加入

01001mol/L盐酸使其溶解,转移至100ml容量瓶中定容,室

温下水浴振荡10min,取上清液经0145μm针筒式微孔滤膜

过滤器过滤。

11312　饮料　移取一定体积的样品溶液,用01001mol/L盐

酸稀释定容至一定体积,经0145μm针筒式微孔滤膜过滤器

过滤。

2　结果与讨论

211　色谱条件的选择

21111　流动相离子强度的选择　已报道的文献中多以甲醇

-磷酸二氢钾体系作为流动相分析测定水溶性维生素。本课

题以甲醇-磷酸二氢钾溶液(25+75)为流动相,固定其它实

验条件不变,比较了0101mol/L、01025mol/L、0105mol/L3

种不同浓度的磷酸二氢钾溶液作流动相时维生素C、B1、B2和

烟酸4种水溶性维生素的分离效果。结果表明,01025mol/L

磷酸二氢钾溶液作流动相时,上述4种水溶性维生素分离较

好。

21112　流动相pH值的选择　本课题以甲醇-磷酸二氢钾溶

液(25+75)为流动相,固定其它实验条件不变,改变流动相的

pH值,比较了不同pH值对维生素C、B1、B2和烟酸4种水溶性

维生素分离的影响。结果表明,当流动相pH=5111时,上述4

种水溶性维生素分离较好。

21113　流动相配比及流速的选择　本课题以甲醇-磷酸二氢

钾溶液(pH=5111)为流动相,考察了不同的流动相配比及流速

对维生素C、B1、B2和烟酸4种水溶性维生素分离的影响。结果

表明,当甲醇-磷酸二氢钾溶液的配比为35+63,流速为

0198ml/min时,上述4种水溶性维生素色谱分离效果较好。

在上述已选定的色谱条件下,我们又考察了维生素C、B1、

B2、烟酸和烟酰胺5种水溶性维生素的分离情况。结果表明,

上述5种水溶性维生素在已选定的色谱条件下均可得到良好

分离,6min内即可完成分离测定。实验结果参见图1

。

图1　5种水溶性维生素分离色谱图

11维生素C;21烟酸;31烟酰胺;41维生素B1;51维生素B2

21114　检测波长的选择　文献报道维生素C、B1、B2、烟酸和烟酰胺在200nm～300nm波长范围内有较强吸收。本课题比较了245nm、250nm、254nm、260nm、265nm、270nm及275nm几种不同波长下上述5种维生素的吸光度值(用色谱峰面积表示)大小。结果表明,维生素C、B1、B2在波长为265nm时吸光度值最大;烟酸、烟酰胺在波长为260nm时吸光度值大于265nm,但两者间相差不大,相对偏差分别为211%及814%。综合考虑,选择265nm作为上述5种水溶性维生素的紫外检测波长。

212　样品提取溶剂的选择

本课题以复合维生素片为样品,比较了01001mol/L盐酸、体积分数为011%冰乙酸溶液、p H为5111的磷酸二氢钾溶液作为样品提取溶剂时维生素C、B1、B2、烟酸和烟酰胺相应吸光度值大小。结果表明,上述3种溶剂对于维生素B1、B2、烟酸和烟酰胺的吸光度值影响不大,其相对标准偏差分别为819%、1211%、613%和711%,而维生素C在01001mol/L 盐酸作为样品提取溶剂时的吸光度值明显大于后两种溶剂,故选择01001mol/L盐酸作为样品提取溶剂。

213　溶剂提取时间的选择

本课题以复合维生素片为样品,比较了在10min、20min、30min的不同提取时间下,维生素C、B1、B2、烟酸和烟酰胺相应吸光度值大小。结果表明,维生素C、B1、B2、烟酸和烟酰胺在不同提取时间的吸光度值的相对标准偏差分别为810%、0195%、319%、412%及0184%,均在10%以内,因此可以认为在所考察的提取时间范围内,提取时间对于组分吸光度值的影响无明显差异。故选择10min作为样品提取时间。

214　标准曲线及线性范围

准确称取一定量的维生素C、B1、B2、烟酸和烟酰胺置于烧杯中,加入01001mol/L盐酸溶解定容,室温下水浴振荡10min,在选定的色谱条件下,进样分析。分别以5种水溶性维生素的浓度(μg/ml)为横坐标,峰面积(μv・s)为纵坐标,绘制标准曲线,并计算其回归方程。结果见表1。由表中可见,5种水溶性维生素在一定浓度范围内线性关系良好。

表1　5种水溶性维生素的线性范围及回归方程

维生素线性范围(μg/ml)回归方程相关系数

维生素C0～8810Y=-1853710+4237114X019999

维生素B10～3010Y=-618019+1425914X019997

维生素B20～8132Y=-353818+5083918X019998烟酸0～62172Y=-540010+1379110X019998

烟酰胺0～60116Y=-532416+1287311X019998 215　检出限

以2倍噪声所相当的待测物质的浓度作为方法的检出限,维生素C、B1、B2、烟酸和烟酰胺的检出限分别为0105μg/ml、0116μg/ml、0104μg/ml、0115μg/ml及0116μg/ml。

216　精密度

本课题在选定的色谱条件下,同1d内连续测定5种水溶性维生素高、低2种不同浓度的样品溶液4～5个平行样,以测定结果的相对标准偏差表示,考察其日内精密度。在选定的色谱条件下,用相同的实验方法连续4～6d测定5种水溶性维生素高、低2种不同浓度的样品溶液,以测定结果的相对标准偏差表示,考察其日间精密度。结果见表2～5。表2～5的测定结果表明,5种水溶性维生素的精密度可满足定量分析的要求。

表2　高浓度样品溶液日内精密度实验结果维生素测定次数x±s(mg/g)相对标准偏差(%)维生素C52813±119617

维生素B153117±0125719

维生素B24210±0121010烟酸52112±112517

烟酰胺5916±017713

表3　低浓度样品溶液日内精密度实验结果维生素测定次数x±s(mg/g)相对标准偏差(%)维生素C51415±1151013

维生素B151158±0115915

维生素B250198±0109819烟酸41018±016515

烟酰胺5417±014815

表4　高浓度样品溶液日间精密度实验结果维生素测定次数x±s(mg/g)相对标准偏差(%)维生素C62512±118711

维生素B153130±0125716

维生素B25211±011418烟酸52018±113612

烟酰胺6916±017713

表5　低浓度样品溶液日间精密度实验结果维生素测定次数x±s(mg/g)相对标准偏差(%)维生素C51217±110719

维生素B141166±0108418

维生素B241108±0109813烟酸51016±016517

烟酰胺5419±012411

217　准确度

本课题用加标回收率进行方法准确度的评价。取复合维生素3片,准确称量,研细。准确称取一定量研细的样品粉末,分别加入高、低两种不同量的维生素C、B1、B2、烟酸和烟酰胺的标准物质或溶液,按照样品处理方法制备样品溶液,经0145μm针筒式微孔滤膜过滤器过滤后进样分析,计算其加标回收率。结果见表6～10。由表6～10测定结果可知,5种水溶性维生素的加标回收率可满足定量分析的要求。