叠加内标法色谱定量分析
试讨论气相色谱各种定量方法的优缺点及适用范围
试讨论气相色谱各种定量方法的优缺点及适用范围气相色谱（GC）是一种常用的分析技术，可用于分离和定量检测挥发性和半挥发性有机化合物。
气相色谱的定量方法主要包括峰面积法、内标法、外标法等多种方法。
以下将讨论每种方法的优缺点及适用范围。
1. 峰面积法（Peak area method）：优点：-简单易操作，不需要额外标准样品或者内标物。
-峰面积与物质的浓度成正比，可用于定量分析。
-不受流速和柱长等因素的影响。
缺点：-定量结果受到峰形和峰宽的影响，精确度较低。
-需要标准曲线来建立峰面积与浓度之间的关系。
-可能出现峰重叠和共享等问题，导致不确定性增加。
适用范围：-适用于测定浓度较高的化合物。
-适用于研究样品中特定成分的浓度变化。
2. 内标法（Internal standard method）：优点：-通过在样品中加入一个已知浓度的内标物，可以用来消除样品准备和分析过程中的变异性。
-可以减少色谱柱和检测器的漂移和变化对定量结果的影响。
-可提高测量的准确性和精确性。
缺点：-需要选择合适的内标物，其性质必须与被测分析物相似，但不会出现在样品中。
-内标物的添加可能引入额外的误差。
-需要确保内标物的纯度和浓度的准确性。
适用范围：-适用于分析复杂样品中低浓度分析物的定量。
3. 外标法（External standard method）：优点：-通过与已知浓度的外部标准样品进行比较，可以直接计算出待测物质的浓度。
-常用于单一组分的分析，样品准备简单。
-精确性高，适用于高灵敏度定量分析。
缺点：-外标法对于样品中可能存在的干扰物的应答程度不同，会导致不确定性的增加。
-需要准确制备一系列外部标准样品，费时费力。
适用范围：-适用于定量分析信号强度较强的物质。
除了以上常用的定量方法外，还有一些其他方法，如面积归一法、标准加入法等。
这些方法在特定情况和实验需求下有其独特的优势和适用范围。
总之，不同的定量方法适用于不同的实验目的和条件。
气质联用-内标法定量流程
气质联用-内标法定量流程1.打开工作站，调用标曲离子图（第一级别），点击“色谱图”→“选择积分器”，选择RTE积分器；2.点击“MS信号积分参数”，调整最小峰面积，使峰面积最小的标准品峰能被积分。
点击应用，保存，保存方法建议放在运行标曲离子图的方法文件中。
3.点击“校正”→“设置定量”，输入校正标题（在定量报告中显示的为此标题），选择积分参数文件为2中所保存的积分参数文件。
输入标品及内标物浓度单位，内标物浓度，点击确定。
4.系统自动弹出“编辑化合物”，点击“插入上方”，弹出“定量设置”，在离子图中找到目标峰，右键双击，在质谱图中单击任一位置，系统会自动记录保留时间，输入目标物名称，如果是内标物需勾选“内标物”。
点击“保存”→“退出”，自动弹出“编辑化合物”，左键单击“化合物列表结束”→“插入上方”，依次进行所有目标物的录入。
内标物必须是在所有化合物的第一位，名称前带星号。
5.点击“退出”→“是”，在“更新校正”随便输入一个化合物浓度，在新级别中输入此次校正的标曲的级别。
点击“进行更新”，在弹出窗口中点击内标物前的“+”，拉开此标曲中所有的化合物，点击“校正”，依次修改除内标物外的所有化合物的浓度，点击“确定”，完成此次级别的校正。
6.点击“校正”→“更新一个级别”，以5中所述完成下一级别的校正。
每个级别的编号不能重复，如果需要删除级别，在“更新校正”中点击“删除级别”，选中所要删除的级别点击“进行更新”即可。
如需修改化合物顺序，点击“校正”→“重新排列化合物顺序”。
如需修改化合物信息，点击“校正”→“编辑化合物”。
7.完成所有级别的校正后，点击“方法”→“保存方法”，完成标曲建立。
8.调用所保存的定量方法，选中任一离子图，点击“定量”→“计算”即可计算化合物浓度。
色谱法定量分析方法及原理
色谱法定量分析方法及原理定量分析就是要确定样品中某一组分的准确含量。
色谱定量分析与绝大部分的仪器定量分析一样，是一种相对定量方法，而不是绝对定量方法。
它是根据仪器检测器的响应值与被测组分的量，在某些条件限定下成正比的关系来进行定量分析的。
也就是说，在色谱分析中，在某些条件限定下，色谱峰的峰高或峰面积（检测器的响应值）与所测组分的数量（或浓度）成正比。
一、原理色谱法定量分析的根据是组分i通过检测器时产生的信号大小，即组分i的峰面积A（或组分i的峰高h i）与进入检测器的组分i的质量mi成正比A x m 或h i x mi，由此得到：A=Sm; h i=S（h）m 或者m=A/S i=Af i ; m=h/S i（h）=hf 心）式中A i -------- 组分i的峰面积，mm；m i -------- 组分i进入检测器的量，g或mol数；h i -------------- 组分i的峰高，mmS i——组分i的绝对响应值；f i -------------- 组分i的绝对校正因子；S i（h）——组分i的峰高绝对响应值；f i（h）-----组分i的峰高绝对校正因子。
二、色谱定量分析的方法1、归一化法定量分析。
归一化法定量是色谱分析法中常用而且简单准确的方法。
归一化法只适用于样品中所有组分都能从色谱柱流出并被检测器检出，且都在线性范围内，同时又能测定或查出所有组分相对校正因子的样品。
各组分含量的计算公式为：f i A iX i 100%Z f i A i式中，X，f i，A分别为试样中被测组分的百分含量、相对质量校对因子和色谱峰面积，这个式子也称为面积校正归一化法。
归一化法定量的特点是比较简单、方便，其结果与进样量无关，仪器的操作条件稍有变动对结果影响不大。
当所有组分的校正因子都相同时，上式可简化为：A iX i 100%、A i此式又称为面积归一化法，在FID上，各种烃类的f i都很相近，在计算时采用此式给定量分析带来了极大的方便。
色谱定量分析,外标法和内标法如何进行选择
色谱定量分析，外标法和内标法如何进行选择色谱定量分析，外标法和内标法如何进行选择色谱分析的重要作用之一是对样品定量。
而色谱法定量的依据是：组分的重量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。
常见定量分析方法分为面积归一化法、内标法、外标法、标准曲线法等。
大家常常容易傻傻分不清楚的莫过于内标法、外标法了。
以内标法为例，选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。
再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数，用内标法公式计算即可。
其实，从定义上来区分的话，外标法就是用标准品的峰面积或峰高与其对应的浓度做一条标准曲线，测出样品的峰面积或峰高，在标准曲线上查出其对应的浓度，这是最常用的一种定量方法；内标法是对应外标法说的，内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。
外标法需要用样品和标准品对比，但是有时我们很难保证样品和标准品进的体积是一样的，毕竟要有误差，这时候就用内标法，就是在外标法的基础上,在样品和标准品里在加入一种物质，通过加入物质的峰面积或峰高的变化,就可以看出我们标准品和样品进样体积的差别，但同时会引进加入物质的秤量误差。
所以一般用外标法来定量，如果进样体积很难掌握，就用内标法，可以消除进样体积的误差。
外标法外标法（标准曲线法、直接比较法）首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。
具体作法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。
若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。
标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。
当欲测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含量时，也可以不必绘制标准工作曲线，而用单点校正法，即直接比较法定量。
气相色谱仪的定性分析和定量分析有什么不同？
气相色谱仪的定性分析和定量分析有什么不同？当我们开始接触气相色谱仪的时候，就会知道气相色谱仪主要是利用色谱分离的分离技术和检测技术，对多组分的复杂混合物进行定性和定量分析的一种仪器。
就分类来说，由于气相色谱仪的分析方法包括定性分析和定量分析两个部分，所以气相色谱仪的类别可以分为定定性分析和定量分析两种类别。
那么问题来了，气相色谱仪的定性分析和定量分析究竟有什么不同呢？我们来给大家详细介绍以下：首先介绍定性分析，由于定性分析的应用在实际操作中会受到一些限制，所以它的应用范围远远没有定量分析那么广泛。
利用保留值进行定性分析是气相色谱仪分析中常用到的方法，保留值是保留时间和保留体积的总称。
当实验操作条件没有发生变化的时候，说明被测物的保留值只与化学性质有关，由此可用于定性分析。
如果被测样品中某一组分与一直标准品的保留值一样的时候，我们可初步判断这组分与标准品可能是一样化合物。
但同时我们需要注意一点，有些时候多种物质在一定的操作条件下是具备相同的保留值的，所以我们不能完全根据保留值相同来判断它们是否是同一种物品。
这种情况下我们选用其他具备不同极性的色谱柱来进行二次甚至是更多次的分析，如果经过多次分析后，保留值还是一样的，那么我们可以判断被测物是同一种物质。
然后介绍定量分析，由于在一定的范围内，色谱峰的峰面积和被测组分中的含量或浓度成线性关系，所以我们通过测量相应的峰面积来判断被测物的含量。
在定量分析中我们常用的方法是内标法和外标法。
内标法是指测量样品中某一组分或某几个组分的含量时，将一定量的某一纯组分加入样品中作为内标物，然后进行色谱分析，通过测量并对比内标物的峰面积和待测组分的峰面积，就可以求出待测组分在被测样品中的含量。
外标法则是用已知浓度的标准品进行色谱分析，得出关于峰面积和浓度的标准曲线，然后在完全相同的条件入被分析物，得到相应的峰面积，最后我们根据标准曲线计算待测样品的浓度。
以上就是气相色谱仪的定性分析和定量分析的不同之处。
色谱的定量分析
色谱的定量分析1.色谱分析有几种定量方法色谱分析常用的定量方法：归一化法、内标法和内加（增量）内标法、外标法。
1、面积归一化法优点是简便、准确，当操作条件变化时对结果影响较小，宜于分析多组分试样中各组分的含量。
但是试样中所有组分必须全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。
2、外标法是用纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液（或直接购买不同浓度标准溶液）分别取一定体积，注入色谱仪，根据峰面积和浓度做标准曲线。
在分析未知样时按与标准曲线相同的操作条件和方法，由标准曲线查出所需组分的浓度（现在在工作站上直接就能求出浓度）。
此法要求进样准确，操作条件稳定，分析样品和标准曲线条件必须一致。
3、内标法是试样中所有组分不能全部出峰或只要求测定试样中某个或某几个组分时，可采用此法。
内标法是在准确称取一定量的试样中，加入一定的标准物质（内标物），根据内标物和试样的质量以及色谱图上的相应峰面积，计算待测组分的含量。
内标法的关键是选择合适的内标物，内标物应是试样中不存在的纯物质，物质与被测物质相近，能溶于样品中，但不能于样品发生反应。
此法比较费事，一般不使用于快速分析。
2.常用的层析分析方法有哪些在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
色谱内标法定量
色谱内标法定量（多点校准）一）校准曲线的绘制１、由主菜单View进入Data Analysis界面；２、由主菜单的File到Load Signal，调出第一种浓度的标准品的色谱图（第一点），并调整其坐标参数和积分参数等；３、由主菜单Calibration进入New Calibration Table，在Automatic Setup Level 后的对话框中输入1，然后点击OK；４、在校准表上分别输入已知组分的名称及其浓度，右下方即出现对应曲线：1)在Compond栏中输入组分名称；2)在Amt(mg) 栏中输入组分浓度；3)在ISTD栏中，内标那一行设为Yes。
５、由主菜单Calibration进入Calibration Settings，分别修改浓度单位、校准曲线类型和时间窗口等：1)在Amount Units栏中输入组分浓度单位；2)在Type栏中输入曲线类型（Linear＝直线，Power=抛物线等）；3)在Origin栏中选择曲线过不过原点（Ignore=忽略，Include=包含，Force=强制，connect=连接）；4)在Other Peaks栏中设定峰识别时间窗口（一般设为５％）；６、点击OK，退出校准表；７、调出第二种浓度的标准品的色谱图（第二点），并调整其坐标参数和积分参数等；８、由主菜单的Calibration进入Add Level，对照响应组分，分别输入第二点的各组分浓度，点击OK退出；第三点、第四点等类推；９、由主菜单的Calibration进入Calibration Table，可检查、修改校准表上的各参数；１０、由主菜单上的Report ，进入Specify Report，将Calculate: 后改为ISTD （内标法），点击OK退出；二）样品分析１、由主菜单的File到Load Method…，在D:\HPCHEM\1\METHOD\…中调出所需方法；２、调出样品色谱图，调整其坐标参数和积分参数等，预览报告及打印；３、对于同一浓度的标样，可多次平行进样，取其平均值，加以校准：调出同一浓度标准品的色谱图，由主菜单Calibration进入Recalibrate取Average,再OK,即得到同一浓度的两次进样的平均校准表。
液相色谱分析之内标法
液相色谱分析之内标法内标法是结合了峰面积归一法和外标法的优点的一种方法，它在加入内标物后，按峰面积归一法的分析方法进行分析，这就避免了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的偶然误差。
因而，它的分析精密度也是比较高的，是一种比较理想的定量分析方法。
它的弱点是前处理比较复杂，所花费的时间也比较长，同时必须要有合适的标样及内标物才能进行内标法定量分析。
内标法的优缺点内标法的优点：对进样量不严格要求，测定的结果也较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了进样量、仪器不稳定等变化所引起的误差，只对欲分析的组分峰做校正。
内标法的缺点是必须加一个组分进到样品，易增加面积测量误差。
操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。
内标物的选择原则采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。
理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的已知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。
当然，在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。
需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化合物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化合物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。
对于内标法定量分析来说，内标物的选择必须满足如下的条件：1、内标物与被分析物质的物理化学性质要相似（如：沸点、极性、化学结构等）；2、内标物应是该试样中不存在的纯物质；3、它必须完全溶于被测样品（或溶剂）中，且不与被测样品起化学反应；并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；4、能加入内标物的量应接近于被测组分；5、色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。
色谱定量分析内标法与外标法的对比
色谱定量分析内标法与外标法的对比色谱定量分析是一种常用的分析方法，广泛应用于化学、环境、生物、医药等领域。
在色谱定量分析中，内标法和外标法是常用的两种方法。
它们在原理、操作步骤以及适用性上有一些区别和优劣，下面将分别对内标法和外标法进行详细对比。
首先，内标法又称为内标记法、内标记物法或内标定量法。
其原理是在待分析样品中添加一个与目标分析物化学性质相近但易于分离的内标化合物，通过内标化合物和目标分析物在分析中的共同的特性参数值来定量目标分析物。
常用的内标化合物有氚标记化合物、碳13标记化合物、氘标记化合物等。
其操作步骤如下：1.选定内标物：选择一种相对于目标分析物在物理、化学和谱学性质上相似但易于分离的化合物作为内标物。
2.内标标准曲线的制备：制备一系列含有不同浓度目标分析物和相同浓度内标物的标准溶液。
3.分析样品：将待分析样品中的目标分析物和内标物一同进样进行色谱分析。
4.数据处理：通过内标物和目标分析物在色谱图上的峰面积比值，绘制内标标准曲线并进行数据处理。
内标法的优势在于：1.可以消除样品制备、提取、色谱分离过程中的误差，减小了由操作技术不稳定性引起的误差。
2.内标物和目标分析物在色谱分析中共同进样，减小了分析所需的实验时间，提高了分析效率。
3.内标法对于复杂样品矩阵的干扰具有较好的抗干扰能力。
但是，内标法也存在一些不足之处：1.内标法要求目标分析物和内标物具有相似但易于分离的化学性质，因此对于一些复杂样品或目标分析物与内标物差别较大的情况，内标法的适用性较差。
2.内标物的选择和纯度要求较高，而且内标物以及目标分析物的标准品价格较高，增加了实验成本。
3.内标法在样品制备过程中的矩阵效应还是会对分析结果造成一定的影响，需要通过合适的样品前处理方法进行去除。
相比之下，外标法又称为外标定量法。
其原理是通过将待测样品与已知浓度的目标分析物标准溶液进行对比分析，通过对样品和标准品的信号进行测量和比较，推算出样品中目标分析物的浓度。
【气相色谱定量分析方法】
【气相色谱定量分析方法】一、归一化法当试样中所有组分都能流出色谱柱，且在色谱图上都显示色谱峰时，建议你用归一化法计算组分含量。
所谓归一化法是以样品中被测组分经校正过的峰面积（或峰高）占样品中各组分经校正过的峰面积（或峰高）之和的比例来表示样品中各组分的含量的定量方法。
设试样中有几个组分，各组分的质量分别为m1、m2……m n在一定条件下测得各组分峰面积分别为A1、A2、……A n，则组分i的质量分数W i可按下式计算：式中各组分的校正因子均采用相对质量校正因子。
若试样中组分是同分异构体或同系物，各组分f<’值很接近，可以不用校正因子，将面积直接归一化，这样式5-28可简化为：（5-29）当色谱峰狭窄，峰形对称，操作条件稳定，各组分色谱半峰宽不变时，建议你用峰高归一化法计算组分含量，即：（5-30）式中f i'(h)为峰高校正因子，必须自行测定，测定方法与峰面积校正因子相同。
归一化法简便、准确，进样量的多少与测定结果无关，操作条件的变化对结果影响也较小，但如果试样中的组分不能全部出峰，则不能采用这种方法。
二、内标法若试样中所有组分不能全部出峰；或只要求测定试样中某个或某几个组分的情况时，你可以考虑采用内标法定量。
所谓内标法就是将一定量选定的标准物（称内标物S）加入到一定量试样中，混合均匀后，在一定操作条件下注入色谱仪，出峰后分别测量组分i和内标物S的峰面积（或峰高），按下式计算组分i的含量。
（5-31）式中、分别为组分i和内标物S的质量校正因子；A i、A s分别为组分i 和内标物S的峰面积。
也可以用峰高代替面积，则：(5-32)式中、分别为组分i和内标物S的峰高校正因子。
内标法中，常以内标物为基准，即=1.0则式5-31可以写为：(5-33)式（5-32）可改为：(5-34)内标法的关键是选择合适的内标物，对于内标物的要求是：１．应是试样中不存在的纯物质；２．内标物的性质应与待测组分性质相近，以使内标物的色谱峰与待测组分色谱峰靠近并与之完全分离；３．内标物与样品应完全互溶，但不能发生化学反应；４．内标物加入量应接近待测组分含量。
色谱定量计算三种方法,归一化法,内标法和外标法
色谱法是根据色谱峰的面积或高度进行定量分析的。
色谱定量计算方法很多，目前比较广泛应用的有归一化法、内标法和外标法。
1. 归一化法如果试样中所有组分均能流出色谱柱并显示色谱峰，则可用此法计算组分含量。
设试样中共有n个组分，各组分的量分别为m1，m2，……，m n，则i种组分的百分含量为：归一化法的优点是简便、准确，进样量的多少不影响定量的准确性，操作条件的变动对结果的影响也较小，对组分的同时测定尤其显得方便。
缺点是试样中所用的组分必须全部出峰，某些不需定量的组分也需测出其校正因子和峰面积，因此应用受到一些限制。
2. 内标法当试样中所有组分不能全部出峰，或只要求测定试样中某个或几个组分时，可用此法。
准确称取m(g)试样，加入某种纯物质ms(g)作为内标物，根据试样和内标物的质量比m s/m及相应的色谱峰面积之比，基于下式可求组分i的百分含量W i%：因为所以内标物的选择条件是：内标物与试样互溶且是试样中不存在的纯物质；内标物的色谱峰既处于待测组分峰附近，彼此又能很好地分开且不受其它峰干扰；加入量宜与待测组分量相近。
内标法的优点是定量准确，操作条件不必严格控制，且不象归一化法那样在使用上有所限制。
缺点是必须对试样和内标物准确称重，比较费时。
3. 外标法(亦称标准曲线法)该法是在一定色谱操作条件下，用纯物质配制一系列不同的浓度的标准样，定量进样，按测得的峰面积对标准系列的浓度作图绘制标准曲线。
进行试样分析时，在与标准系列严格相同的条件下定量进样，由所得峰面积从标准曲线上即可查得待测组分的含量。
外标法的优点是操作和计算简便，不需要知道所有组分的相对校正因子，其准确度主要取决于进样量的准确和重现性，以及操作条件的稳定性。
内标法
内标法（Internal Standard Method）是将一定重量的纯物质作为内标物（参见内标物条）加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，按公式即可求出被测组分在样品中的百分含量。
内标法是色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。
内标法是将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，根据测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比及相对校正因子，来计算被测组分的含量。
其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别为加入内标物和对照品的量。
再取含有内标物的待测组分溶液进样，记录色谱图，再根据含内标物的待测组分溶液色谱峰响应值，计算含量（mi）：其中 Ai和As分别为待测物和内标物的峰面积或峰高，ms为加入内标物的量。
必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成为标示量的百分含量，或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量。
影响因素影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。
由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。
化学方面的因素包括：1、内标物在样品里混合不好；2、内标物和样品组分之间发生反应，3、内标物纯度可变等。
对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。
进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。
如果认为方法比较可靠,而色谱柱看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。
对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定。
高效液相色谱定性定量分析方法
1
134.2
220.2
0 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)
由分子量及其 质谱图可以确 定该代谢物为 乙酰化氨脒
定性分析—两谱联用定性
定性分析—其他方法
1 收集洗脱物后进行定性分析
` 收集色谱分离后的每一个分离组分 ` 对所得组分分别进行仪器、化学分析或其他物理
参数（如熔点、沸点、折光、旋光等）测定
定性分析—其他方法
收集组分时应注意
` 某些情形，如色谱分析，宜采用非破坏性检测器，电化 学检测器不可；
` 如使用破坏性检测器，则须在检测器前分流，使分离后 的一小部分组分进入检测器
` 可根据文献数据和对照品选用已知标准物 ，再用已知标准物进行定性
定性分析—保留值定性
3 利用已知物增加峰高法定性
将已知标准物质加到待测样品，若某一峰 增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使 该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物 为同一物质
定性分析—保留值定性
4 用三维图谱检测器定性
` 如果HPLC仪配备有三维图谱检测器，除比较未 知组分与已知标准物保留时间外，还可比较两 峰的立体构形
条件下应该有相同的保留值； 但相反结论却不成立，即相同色谱条件下
，具有相同保留值的两个物质不一定是同一 个物质。尚需一些辅助技术 ` 利用两谱联用定性；
其他方法定性
定性分析—保留值定性
1 已知物保留值直接对照法定性
` 未知峰保留值(t’R或V’R)与某标准物完全 相同，可初步确定为同一物质
` 改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍 完全相同，则可认定为同一物质
色谱定性和定量分析方法
Identification
2019/9/22
二、 色谱定量分析方法 1. 峰面积的测量
（1）峰高（h）乘半峰宽（Y 1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算 出的面积是实际峰面积的0.94倍：
A = 1.064 h·Y1/2 （2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰 宽，由下式计算峰面积：
fi' Ai
f
' s
AS
ci
%
mi W
100
ms
fi' Ai
f
' s
AS
W
100
ms W
fi' Ai
f
' s
AS
100
2019/9/22
内标法特点
(1) 内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响 不大。
(2) 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。 (3)若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：
Ai Ai
)
100
i 1
特点及要求： 归一化法简便、准确； 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大； 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。
2019/9/22
（2）外标法
外标法也称为标准曲线法。 特点及要求： 外标法不使用校正因子，准确性较高， 操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。
1.0 DEG/MI N
HEWLET PTACKAR
5972A
D
Mass Selectiv eDetecto r
色谱定量分析方法可以分为外标法
色谱定量分析方法可以分为外标法、内标法、归一化法三大类。
当能够精确进样量的时候，通常采用外标法进行定量。
这种方法标准物质单独进样分析，从而确定待测组分的校正因子；实际样品进样分析后依据此校正因子对待测组分色谱峰进行计算得出含量。
其特点是标准物质和未知样品分开进样，虽然看上去是二次进样，但实际上未知样品只需要一次进样分析就能得到结果。
外标法的优点是操作简单，不需要前处理。
缺点是要求精确进样，进样量的差异直接导致分析误差的产生。
外标法是最常用的定量方法，其计算过程如下：1．绝对校正因子gi的计算gi＝ms／Ai式中ms是标准样品中组分i的含量，Ai是标准样品谱图中组分i的峰面积。
2．外标法的计算公式mi＝Ai * gi这里mi是未知样品中组分i的含量。
（相对校正因子是某组分的绝对校正因子与标准物质绝对校正因子的商。
计算公式如下：Gi＝gi／gs式中gi是组分i的绝对校正因子，gs是标准物质的绝对校正因子。
对同一类型的不同检测器来说，在组分i和s相同的情况下，相对校正因子是基本一致的。
它只和检测器的性能、待测组分的性质、标准物质的性质、载气的性质相关，与操作条件无关。
也就是说基本上可是认为相对校正因子Gi是一个常数。
相对校正因子在好多相关文献上可以查到，在无法找到所有组分标准样品的时候，可以参考使用。
但是由于不同检测器的性能有一定的差异，因此相对校正因子最好在使用的色谱上单独测定）归一化法有时候也被称为百分法（percent），不需要标准物质帮助来进行定量。
它直接通过峰面积或者峰高进行归一化计算从而得到待测组分的含量。
其特点是不需要标准物，只需要一次进样即可完成分析。
归一化法兼具内标和外标两种方法的优点，不需要精确控制进样量，也不需要样品的前处理；缺点在于要求样品中所有组分都出峰，并且在检测器的响应程度相同，即各组分的绝对校正因子都相等。
选择适宜的物质作为预测组分的参比物，定量加到样品中去，依据欲测定组分和参比物在检测器上的响应值（峰面积或峰高）之比和参比物加入量进行定量分析的方法叫内标法。
高效液相色谱定性定量分析方法
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器 响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
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为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
• Ci=fiAi • Ci=fiHi
• 实际修饰公式为：y=ax+b
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定量分析方法
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面积归一化法
不能作为准确定量的方法、仅在特殊情况下使用
• •
公式： 特点：
C%
Ai Ai
100%
– 各组分要全部流出、全部被检测，要求所有响 应因子相当
– 进样量不要求严格
– 不需标样
– 无需做校正、简单、快速
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内标法
• 选择适宜的物质作为欲测组分的参比物， 定量加到样品中去，依据欲测组分和参比 物在检测器上的响应值（峰面积或峰高） 之比和参比物加入的量进行定量分析的方 法。
• 内标法与标准曲线法相比，有利于消除色 谱条件不完全重现、进样量不准确等所带 来的误差。
6.色谱分析中的定性与定量方法
色谱定量分析
色谱定量分析
• 绝对校正因子：单位峰面积对应的物质量：fi = mi/Ai • 定量校正因子与检测器响应值成倒数关系： • fi=1/Si • 相对校正因子fi ：即组分的绝对校正因子与标准物质 的绝对校正因子之比。
fi mi / Ai mi As fi f s ms / As ms Ai
• 化学反应定性：利用化学反应，使样品中某些 化合物与特征试剂反应，生成相应的衍生物。 • 柱前反应：被分离混合物进入色谱柱前与某些 特征性试剂反应，观察色谱图上某些色谱峰发 生消失、提前或滞后而断定有无此类化合物。 • 柱 上： 如装有5A分子筛的前置柱，可吸附C3C11的正构烷烃，KOH处理的石英粉可将羧酸 和酚除去（吸附）等。 • 柱 后： 柱后流出物收集后，加入特征试剂与 其反应，可对未知物定性。
色谱定量分析
• 叠加内标法：以样品中已有的组分做内标，比 较该组分加入前后面积的改变，计算被测组分 含量
A1 mS ci % 100 A2 A1 W
• 特点：要求两次进样量完全相同。
色谱定量分析
• 叠加内标法：两次进样量不同时的处理
'
• 当 m i 、 m S 为质量单位时，为质量相对校正因子；当 m i 、 mS用摩尔单位时相应于摩尔校正因子。
色谱定量分析
• 归一化法：
mi ci % 100 m1 m2 mn
f i ' Ai
' ( f i Ai ) i 1 n
100
归一化法的特点： • 对同系物可认为校正因子一样，通过峰面积直接测定； • 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不 大； • 试样中所有组分必须全出峰并且无分解反应发生。
叠加内标法色谱定量分析
叠加内标法色谱定量分析摘要：叠加内标法是指在色谱定量分析中将内标法与叠加法结合而成的一种新的定量方法。
本文叙述了叠加内标法定量的理论依据，规定了其操作步骤，并详细说明了这种方法的适用条件和优缺点。
关键词：色谱定量，叠加法，内标法1 前言内标法是经典的色谱定量方法，在配制分析样品时要求加入一个或数个内标物组份，内标物必须是分析样品中不含有的组份，而且要求与样品中的其它组份有良好的分离[1，2]。
由于受分离因素制约，很多情况下给内标物的选择带来不便，有时甚至无法选到合适的内标物。
鉴于这种情况，我们尝试将内标法与叠加法相结合成为一种新的定量方法，称为叠加内标法，用于没有合适内标物的场合。
2 叠加内标法定量原理已知某样品中含有k，i，x三个组份(可以有更多的组份，x1，x2，x3......)，命名k 组份为峰面积校正组份，i组分为叠加内标组份，x组分为任意组份，样品经色谱分离后得到三个组份的峰面积分别为Ak，Ai，Ax，上述三个组份相对于i组份的校正因子分别为Fki、1.000和Fxi，样品中三个组份的含量分别为Ck、Ci和Cx。
现分别准确称取m克样品和Ws克i组份，然后将二者混合，混合物称为加标样品。
加标样品经色谱分离后得到三个组份的峰面积分别是：k组份峰面积为A1，i组份峰面积为A2（A2是样品中原有的i组份和加入的叠加i组份共同构成的峰面积）。
x组份或其它组份峰面积与计算无关。
求样品中各组份百分含量的步骤如下：2．1 利用k组份进行峰面积校正令k组份加标后与加标前的峰面积的比值为K（k组份加标后与加标前的峰面积在理论上是相同的，此处引入校正系数K的目的是为了消除进样量误差），则K的表达式为：K = A1/Ak （1）再利用K对加标前的k，i，组份的峰面积进行修正如下：A = K×Ak （2）B = K×Ai （3）式（2）、式（3）中的K为加标后与加标前的两次进样的峰面积校正系数，虽然K是从组份k得到的，但亦适合其它组份。
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式 （ !） 、 式 （*） 中的 & 为加标后与加标前的两次进样 的峰面积校正系数。虽然 & 是从组分 A 得到的， 但 亦适合其他组分。 ! 和 ’ 分别为 ! A 和 ! / 的校正 值。 " # ! $ " 引入叠加法 ［$］ ： 引入叠加法的计算公式 % E % D G ! "（ F ! 7 H ! "） （(） 式 （(） 中， % 表示样品中原有内标物组分的质量； % D 表示加入的内标物组分的质量； ! " 表示样品中 原有内标物组分的峰面积； ! 7 表示加标后内标物组 分总的峰面积。 在本文中， ! ! 相当于 ! 7 ， ’ 相当于 ! " ， % 与 因此有： % D 含义不变， % E % D G ’（ ( ! ! H I） 将式 （$） 及式 （*） 代入式 （)） ， 可得： （ ! $ F ! A） （ ! $ F ! A） %E G ! / G % D［ F !! H G ! /］ （’） 式 （ ’） 又可写成： % E ! $ G ! / G % D（ F ! A G ! ! H ! $ G ! /）（%） " # ! $ % 引入内标法 ［$］ 引入内标法计算公式 ： （ ! B F ! D） #B E G " BD G $"" G % ( $ （+） 式 （+） 中， # B 为样品中 B 组分的含量； % 为样品中 原有内标物组分 D 的质量； $ 为样品的质量； " BD 为 被测组分 B 相对于内标物组分 D 的校正因子； ! B， ! D 分别为组分 B 和内标物组分 D 的峰面积。 （)）
/01234 =44!1!3; !;109;6C
!
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叠加内标法与叠加法和内标法的比较
优点 叠加内标法的内标物可以是 与内标法比较： （(）
#16;4694 I01234 K;109;6C #16;4694 I01234 =44!1!3; I01234
被测样品中已有的组分， 因此， 不必考虑内标物的分 离问题， 可以选择样品中分离良好的任一组分作为 内标物； （-） 用于没有合适内标物的分析。 与叠加法的比较： 在叠加法中， 虽然理论上一次 加入并不限制测定组分的数目， 但需要对每个被测 定组分同时进行加入， 当被测定组分较多时， 实际操 作很繁琐； 而叠加内标法只需要一次加入和两次进 样即可以同时测定多个组分。 !"$ 缺点 与内标法比较： 需两次进样， 即分别测量一次样 品和加标样品。 与叠加法比较： 在测定内标物以外的组分时需 要知道该组分的校正因子。
%&’() $ /01234 =44!1!3; !;109;6C #16;4694 I01234 K;109;6C #16;4694 I01234 =44!1!3; I01234
表 $ ! 种方法测定白酒中异戊醇含量的精密度 %*) 8+),/0/-4 -1 /0-&23( &(,-*-( /4 5/4) 6)7)+2/4)6 ’3 7*) 7*+)) 2)7*-60 >3:;4 （ 8 & <） ) D E(E ) D E(E ) D E)J ) D E(( ) D E() ) D E)" ) D E() D E() D E(( ) D E(F ) D E)" ) D E)* ) D E)* ) D E(F ) D E() D E() ) D E(( ) D E() ) D E)" ) D E)+ ) D E)G ) D E(E ) D E(E ) D E((
甲醇、 异戊醇和异丁醇含量的数据及计算结果。设 其色谱峰面积分别为 " , ， 在 () H )) I< 白酒 " !， " $；
表! %&’() ! 叠加内标法测定白酒中醇的含量数据 9-47)470 -1 &(,-*-(0 /4 7*) 5/4) 6)7)+2/4)6 ’3 &66/7/-4 /47)+4&( 07&46&+6 2)7*-6 P06, 6906 N3IO3;0;1 #6IOC0 /0126;3C K#36IAC 6C7323C K#3R:1AC 6C7323C + H -FG GJ H (+G (- H +GJ 64404 #16;4694 #6IOC0 (( H EJG (-" H -FE N399071!3; Q67139 ( H *FF ( H ))) ( H )") N3;10;1 （ 8 & <） ) D )"" ) D E(F ) D )"E
从表 ( 可以看出： 叠加内标法和内标法的回收 率很接近， 只有叠加法的回收率偏低。所以， 在准确 度方面叠加内标法和内标法的差异是较小的。因 此， 在无合适的内标物的情况下， 用叠加内标法完全 可以代替内标法和叠加法。 从表 - 可以看出： 叠加内标法在精密度上优于 内标法和叠加法， 但内标法和叠加法的 ?LM 也都没 有超过 (B ， 因此， F 种方法用于上述测定都是可行 的， 只是各有所长而已。
（$ > 齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 $’$""’；! > 黑龙江北大仓集团有限公司， 黑龙江 齐齐哈尔 $’$"")；* > 齐齐哈尔市卫生防疫站，黑龙江 齐齐哈尔 $’$""’； ( > 中国科学院大连化学物理研究所 国家色谱研究分析中心，辽宁 大连 $$’"$$） 摘要： 叠加内标法是指在色谱定量分析中将内标法与叠加法结合的一种新的定量方法。叙述了叠加内标法定量的 理论依据， 规定了其操作步骤， 并详细说明了这种方法的适用条件和优缺点。 关键词： 色谱定量分析； 叠加内标法； 叠加法； 内标法 中图分类号： ?’)+ 文献标识码： @ 文章编号： （!""$） $"""#+%$* ")#"(’(#"*
参考文献：
［!］ "#$ %&’()*&+’(，,- .&)/01’( 2 30415+61(4+708 +’+98:&: 5;601<2 301’(=&’(： 301’(=&’( >’&?;4:&68 @4;::，
!""#$#%& ’&$()&*+ ,$*&"*)" -($.%" #& /.)%0*$%1)*2.#3 45*&$#$*$#6( !&*+78#8
;
使用叠加内标法对内标物试剂的要求
加入的内标物试剂不一定是 ( D 已知纯度数据： 含 ! 组分的纯物质， 但要求 ! 组分的纯度为已知。 加入的内标物试剂本身不含 - D 不含有 , 组分： 有 , 组分， 允许含有其他组分。 F D 不含有降低 , 组分和 ! 组分分离度的组分。
<
结论
叠加内标法具有内标法和叠加法所不具备的优
第 $& 卷第 ) 期 !""$ 年 & 月 !" !!!!!!!!"
色
谱
JKLM,N, O?PQM@R ?S JKQ?T@U?VQ@WKX
YZ05 $& MZ 5 ) N:[ \ 5 !""$
经验交流
叠加内标法色谱定量分析
妍! ， 冯英智! ， 张
( 榕* ， 张维冰$，
!!"
!!!!!!!"
郑永杰$ ， 康
约， 很多情况下内标物的选择非常困难， 有时甚至无 法选到合适的内标物。鉴于这种情况， 我们尝试将 内标法与叠加法相结合构成一种新的定量方法， 称 之为叠加内标法， 用于没有合适内标物的色谱分析。
"
叠加内标法定量原理
已知某样品中含有 A， （可以有更 /， B * 个组分 多的组分， ……） ， 命名 A 组分为峰面积校 B$ ， B! ， B* ， 正组分， / 组分为叠加内标组分， B 组分为任意组分。 样品经色谱分离后得到 * 个组分的峰面积分别为 上述 * 个组分相对于 / 组分的校正因 ! A， ! / 和 ! B； 子分别为 " A/， 样品中 * 个组分的含量 $ > """ 和 " B/； 分别为 # A ， # / 和 # B 。分别准确称取 $ C 样品和 然后将两者混合， 混合物称为加标样 % D C / 组分， 品。加标样品经色谱分离后得到 A 组分的峰面积为 ! $， / 组分的峰面积为 ! （ ! ! ! 是样品中原有的 / 组 分和加入的叠加内标 / 组分共同的峰面积） 。 B 组分 或其他组分的峰面积与计算无关。 "#! 求样品中各组分含量的步骤 " # ! $ ! 利用 A 组分进行峰面积校正 令 A 组分加标后与加标前的峰面积的比值为 此处引入校正系数 & 的目的是为了消除进样量 &， 误差） ， 则 & 的表达式为： & E !$ F !A （$）
考察了叠加内标法、 内标法和叠加法的回收率 表 -。 和精密度， 试验结果列入表 (、
表# ! 种方法测定白酒中异戊醇的回收率
%&’() #
%*) +),-.)+/)0 -1 /0-&23( &(,-*-( /4 5/4) 6)7)+2/4)6 ’3 7*) 7*+)) 2)7*-60 567,893:;4 =4404 >3:;4 ?073@09A /06; （ 8 & <） （ 8 & <）（ 8 & <） （ B ） （ B ） ) D E(F ) D E(F ) D E(F ) D E(F ) D E(F ) D E(F ) D E(F ) D E(F ) D E(F ) D F)) ) D G)) ) D *)) ) D F)) ) D G)) ) D *)) ) D F)) ) D G)) ) D *)) ) D -GG ) D J(G ) D +") D -+( ) D J-" ) D +") ) D -FG ) D E*) D +)G "" H G+ "G H )) "G H "* *) H FF "" H )) "G H G+ +" H G+ "- H )) +" H J) +* H +( "" H FF "+ H (*