纳他霉素的发酵生产、分离提纯及检测-广州大学实验报告

纳他霉素的发酵生产、分离提纯及检测

学院：生命科学学院

班级：XXX

学号：XXX

姓名：XXX

摘要本实验利用褐黄孢链霉菌进行发酵生产纳他霉素，通过对褐黄孢链霉菌进行孢子和种子液培养以及摇瓶发酵培养，使其产纳他霉素，并分离纯化得到0.35g/L纳他霉素。期间每24h对培养液取样镜检观察菌体生长，并用分光光度计测定OD值。本实验表明，随着培养时间增加，纳他霉素的含量逐渐增加，菌体生长，菌丝变长而紧密。

关键词纳他霉素摇瓶发酵褐黄孢链霉菌

1 前言

纳他霉素（Natamycin）是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，也称游链霉素或匹马霉素(Pimaricin)。它是由5个多聚乙酰合成酶基因编码的多酶体系合成。由于它能够专性地抑制酵母菌和霉菌，被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗。

纳他霉素是近白色至奶油黄色结晶粉末，几乎无臭无味，溶点280℃（分解），分子式C33H47O13，相对分子量665.75，结构式如图所示。纳他霉素是一类两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5。

在大多数食品的pH值范围内，纳他霉素是非常稳定的。高温、紫外线、氧化剂及重金属等会影响纳他霉素低的稳定性。但可以瞬时高温（温度可达100℃）不影响其活性。N-Natamycin(3-N-dimethylaminopropylsuccimido)的活性比较低，可能是对它的化学修饰都会降低其活性，纳他霉素是经深层发酵和多步提取工艺精制而成，其制剂通常是50%纳他霉素和50%乳糖的混合物。

纳他霉素的生产菌种主要有Streptomyces chattanovgensis, Streptomyces natulonso, Streptomyces gilvosporeus等3种链霉菌。本实验所用菌种为褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus），孢子丝螺旋形。孢子表面带刺。

在发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源(葡萄糖)。纳他霉素在以葡萄糖作为碳源时产量最高，这是因为葡萄糖能渗入纳他霉素的分子中去。有资料表明，氮源的类型对菌体生长和纳他霉素的产量有较大影响，菌体细胞生长最好的氮源是酵母抽提物，而纳他霉素产生的最佳氮源是牛肉浸出物。

纳他霉素是26种多烯烃大环内酯类抗真菌剂的一种，多烯是一平面大环内酯环状

结构（图1），纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华力和真菌细胞质膜上的甾醇分子结合，形成抗生素－甾醇复合物，破坏细胞质膜的渗透性；分子的亲水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔，损伤膜的通透性，从而引起菌内氨基酸、电解质等重要物质渗出而死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些类甾醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用。

图1纳他霉素的分子结构

2 材料与方法

2.1材料

摇床（HYG-B全温度摇瓶柜）、真空干燥箱（型号：DZX-6090）、显微镜、离心机、生化培养箱、紫外分光光度计、褐黄孢链霉素、酵母提取粉、麦芽提取粉、葡萄糖、蛋白胨、琼脂、氯化钠、大豆分离蛋白、麦芽糊精、酵母提取粉、乙醇、甲醇、20%NaOH、抗氧化剂BHA、1,2丙二醇、纳他霉素标准品、250ml三角瓶等等

2.2方法

2.2.1培养基制备

2.2.1.1斜面孢子培养

2.2.1.1.1孢子培养基

酵母提取粉4g/L，麦芽提取粉10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂20g/L，pH7.0

2.2.1.1.2孢子斜面制备

按斜面孢子培养基配方称好原料，用融化琼脂溶解，定容，用20%氢氧化钾调pH，121℃灭菌15min，摆斜面冷却后置于37℃培养1-2天，备用。用斜面转管接种，25℃培养10天，待孢子长满后，放置冰箱5天以上再用。

涂片观察孢子形态，并显微拍照。

2.2.1.2摇瓶种子培养

2.2.1.2.1摇瓶种子培养基

葡萄糖15g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、pH7.0

2.2.1.2.2摇瓶种子制备

按摇瓶种子培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调pH，分装（250ml装50ml），121℃灭菌15分钟。待培养基冷却后，刮取孢子接种摇瓶，每支斜面接种5瓶摇瓶。，29℃，200rpm振荡培养24小时。无菌取样，涂片观察种子菌球形态，并显微拍照。2.2.1.3摇瓶发酵培养

2.2.1.

3.1摇瓶发酵培养基

大豆分离蛋白19.5g/L、麦芽糊精50g/L、酵母提取粉4g/L、葡萄糖6g/L、pH7.0

2.2.1.

3.2 摇瓶发酵

按摇瓶发酵培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调pH，分装（250mL装40mL），121℃灭菌25分钟。待培养基冷却后，取摇瓶种子1ml接种，29℃，200rpm振荡培养120－168hr。每隔24hr无菌取样，涂片观察菌球形态，并显微拍照。

2.2.2 制作标准曲线

取50mg的纳他霉素，溶于100mL丙二醇，得浓度为500μg/mL的纳他霉素原液。按表8-1制作曲线，横坐标为纳他霉素工作溶液浓度，纵坐标为OD303nm。注意给出回归方程（y=kx+b）和相关系数（R2），如果相关系数＜0.99，要求重做标准曲线。产物浓度计算公式为：

纳他霉素含量（mg/L）=X×100×n

其中：X为将所测样品的OD303nm作为y值，代入回归方程中求出的相应的x值。100为样品处理时2次稀释倍数之积。如果所得样品OD303nm超出标准曲线范围为，则稀释n倍后再次测定。

表1 纳他霉素标准曲线工作表

管号123456

工作溶液浓度（μg/mL）0 1.25 2.5 3.755 6.25

纳他霉素原液（mL）添加量00.0250.050.0750.10.125水（mL）109.9759.959.9259.99.875

2.2.3 纳他霉素的提取与检测

纳他霉素不溶于水，因此它在发酵液中呈晶体状。纳他霉素晶体有针型的，圆盘型的等等。它们都是在发酵过程中形成，直径一般在0.5～20nm。

从接种后第48h开始，每隔24h从每瓶发酵液中取0.5mL的发酵液，混合均匀，取混合后的发酵液0.5mL，加4.5mL的丙二醇（此过程样品稀释了10倍），在摇床上震荡1小时，12000rpm离心10min，取0.5mL上清液，加4.5ml蒸馏水（此过程样品再次稀释了10倍），摇匀，在紫外分光光度计303nm测定光密度。如果吸光度太大，需要再稀释一次，计算结果时记得乘以此稀释倍数。剩余的混合后的发酵液平批分成2份，分别用于测定还原糖和氨氮。

2.2.4 纳他霉素的分离纯化

2.2.4.1 发酵液6000rpm离心10min。离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差

即为湿菌泥的体积。

2.2.4.2 湿菌泥加2倍体积95%乙醇，20%氢氧化钠调pH10～10.5，边加边搅拌0.5hr

（注意一定要调过pH后再计时），以便纳他霉素充分溶解。

2.2.4.3 6000rpm离心10min，保留上清液。

2.2.4.4 用1N盐酸调pH6.5，静置3hr以上（或冰箱过夜），以便纳他霉素在等电点处

沉淀析出。

2.2.4.56000rpm离心10min，保留沉淀（产物）。

2.2.4.655℃真空干燥2hr，称重。

3．结果与分析

3.1 发酵过程褐黄孢链霉菌形态的变化