第三章人工授精技术..

奶牛育种过程中，对产奶量高强度选择使 高产奶牛繁殖力下降，特别表现在产后发情 延迟、早期胚胎死亡、流产及子宫疾患。 （一）定时发情和输精 针对产后发情表现不明显、安静发情，卵 巢活性差的母牛。 LRH-A3 20μg诱导卵泡液中的卵泡排卵形 成黄体，7d后注射PGF2α 3mg溶黄体，诱导 发情，2d后注射LRH-A3 20μg，16～20h后输 精。受胎率与对照组差异显著。
安瓿（ampoule）冻精：是操作比较简单的
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一种类型。将稀释后的精液分装于0.5～ 1ml的玻璃安瓶中，每个输精剂量有效精子 数不少于1500万，平衡后进行冷冻。 优缺点：优点是操作比较方便，不易被污 染；但标记麻烦，贮存时占用体积大，现 在已逐渐被颗粒型和细管型所替代。
各种动物的冻精剂型：
韩雪蕾
一、人工授精技术的定义
二、人工授精技术的优越性
三、人工授精技术的技术程序 四、精液的保存技术
五、人工授精技术与胚胎移植技术的关系
六、牛繁殖技术进展
人工授精技术是利用器械采集雄性动物 的精液，经检查和处理后，再用器械将精液 输入到发情雌性动物的生殖道内，以代替自 然交配而繁殖后代的一种技术。 人工授精技术经历了三个发展阶段：
（一）X、Y精子的分离 1．仪器的改进和效率的提高 流动细胞分类检索仪经改进，目前效率达到每 小 时 分 离 X、Y 精 子 各 10 0 0 万 （ 一 个 输 精 剂 量）。实用标准为100个剂量/h。 用无毒的荧光染料与精子DNA结合。由于X-精 子和Y-精子的DNA含量不同（X精子DNA含量 比Y精子高3.8%），所发出的荧光量也不同。 这样，通过计算机控制，使发荧光量不同的精 子带上不同的电荷（X-精子带正电荷，Y-精子 带负电荷）。 最后，在精子通过高压电场时，带不同电荷的 精子发生偏斜而进入不同的收集管内。
1．方法：由开张器法到直肠把握输精，情期 受胎率提高了10%～15%。
2．部位：子宫颈深部→子宫体→排卵侧子宫 角（受胎率提高幅度不大）。
1 ．输一次即可。必要时隔 12 ～ 18h 复配一次。 2 ．输精量：细管精液 1 支，或颗粒冻精 1 粒
（解冻液1～1.5ml ）、鲜精1～1.5ml。
2.精液品质检查：
（1）常规检查：射精量，色泽
，气味，云
雾状，pH值 （2）精子活率 （3）精子密度 （4）死活精子百分率 ⒉定期检查 ⑴精子计数（亿/毫升） ⑵死、活精子百分率测定 ⑶精子畸形率测定 ⑷精子顶体完整率的测定
3.精液稀释
⒈营养剂：功能作用。主要是糖类（果糖、
水浴升温到30℃以上。
低温保存的猪精液在镜检和使用前，必须
升温并伴以充氧）。
（二）冷冻精液的保存技术 冷冻保存就是将精子在-79℃干冰或－ 196℃液氮中保存。 目前精液保存应用最广泛的是冷冻保存， 在家畜生产中具有重要的使用价值。
（二）冷冻精液的保存技术
1.精液冷冻保存原理
精子具有受温度变化直接影响其本身活动力 和代谢能力的生物学特性。精液经过特殊处 理后，保存在超低温下，精子的代谢活动完 全受到抑制，其生命在静止状态下长期保存 下来，当温度回升后又能复苏，且具有受精 能力。
防治各种疾病，特别是生殖道传染病的传播（布氏 杆菌病，衣原体感染，沙门氏菌病，病毒性腹泻） 有利于提高母畜的受胎率 克服公母畜体形悬殊而出现的交配困难，克服“无 障碍配种” 有利于种质交流和扩大配种地域

三、人工授精技术的技术程序 人工授精技术的技术程序： 采精 精液品质检查 精液稀释 精液的分装 精液的保存（液态保存、冷冻保存） 精液的运输 精液的解冻与检查 输精 概括来说，动物人工授精技术由采精技术、 精液处理技术和输精技术三大部分组成。
保存原理
* 常温保存主要是利用一定范围的酸性环境抑 制精子的活动，或用冻胶环境来阻止精子活动， 以减少其能量消耗，使精子保持在可逆性的静 止状态而不丧失受精能力，在精液稀释液中加 入弱酸类物质。 * 常温有利于微生物的生长，因此，还要用抗 菌物质抑制微生物对精子的有害影响。此外， 加入必要的营养和保护物质，隔绝空气，也会 有良好的作用。
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牛、羊：细管精液，颗粒冻精， 安瓿冻精
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•ห้องสมุดไป่ตู้•
马属动物：大颗粒状。
猪：大颗粒状或饼状。
其他动物： 颗粒冻精。
五、人工授精技术与胚胎移植技术的关系
人工授精技术是胚胎移植技术成功的关键一环
决定了是否受精，因此是卵母细胞形成胚胎 的关键技术
这两项技术分别是充分利用优良公畜和母畜的
具有里程碑意义的技术
2.低温保存
低温保存法就是将稀释后的精液置于0~5 ℃的 低温条件下进行保存。
保存原理
* 低温保存主要是在抗冷剂的保护下，防止精子 冷休克，缓慢降温至0~5 ℃保存，利用低温来 抑制精子的活动，降低代谢和能量消耗，抑制 微生物生长，同时加入必要的营养和其他成分， 并隔绝空气，以达到延长精子存活时间的目的。
颗粒冻精：颗粒型冷冻精液是发展中国家
和我国普遍采用的一种类型。颗粒型冻精 是将稀释、平衡后的精液在 -80 ～ -120 ℃ 下冻结成颗粒状，每个颗粒为 0.1 毫升， 解冻后的输精剂量有效精子数不少于 1200 万。
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优缺点：颗粒型冷冻精液最大优点是，冷 冻时不需很多设备，冻后贮存方便；缺点 是手工操作，易造成污染。
（二）促进黄体功能 hCG 的 应 用 ： 周 期 5 d 或 1 4 ～ 1 6 d 注 射 hCG 1000～1500 IU，诱发副黄体，辅助妊娠 干扰素τ的抗溶黄体作用（妊娠信号）。 促生长因子、生长素（GH）、胰岛素和类 胰岛素生长因子（IGF-1）等的促早期胚胎 发育防退化作用。
保存方法
通常采用隔水降温处理，先将精液与稀释液 在30℃ 同温下，按一定比例混合后，分装在 贮精瓶内，密封后放入30℃ 温水容器内，然 后在同容器放进15~25 ℃温水保温瓶内保存。 保存时要防止温度上升，保持相对稳定。也 可将贮精瓶直接放在室内、地窖或自来水中 保存。 保存期限：一般为数天（牛1～5d，马2～5d， 猪3～5d ，绵羊1d ）。
保存方法
冬季置于不结冰的室内（温度要符合要求） 其它季节可放在冰箱内或加有凉水的保温瓶内 保存。 如果没有冰源，也可用化学制冷降温，或吊入 水井深处保存。

精液低温保存的注意事项 降温速度不可过快（通常按0.2℃/min ）。 保存期间，尽量使温度保持恒定，避免升
温。
低温保存的精液在镜检和使用前，要通过
葡萄糖等单糖）以及卵黄和奶类（鲜全奶、 脱脂奶或纯奶粉）等。 ⒉保护剂： • ⑴缓冲剂：保证精液适宜PH值，利于精子 的存活。如柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷 （Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）等。 • ⑵抗冷保护剂：如 新鲜卵黄、奶类。
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⑶抗冻保护剂：可以提高精液冰点，少量渗 入精子可降低冷冻损伤（减少冰晶形成）， 从而达到抗冻作用，如甘油和二甲基亚砜 （DMSO，对精子的毒性较大） ⑷抗菌素类：抑制精液中和操作中带入的 微生物的繁殖。如青霉素、链霉素、硫酸新 霉素、林肯霉素、氨苯磺胺（结晶磺胺即外 用消炎粉）等。
精子在冷冻过程中，在抗冻保护剂的作用下
会尽可能形成玻璃化，防止了精子细胞内水 分的冰晶化所造成的破坏作用。
（二）冷冻精液的保存技术 2.冷冻精液的制作技术
冻精剂型及其优缺点： 细管精液：将稀释后的精液平衡后利用分装机
分装于 0.25 ～ 0.5ml 剂量经过标记的无毒塑料细 管中，封口冷冻后制成。每个输精剂量有效精 子数不少于 1000万。 （有效精子0.1亿/ 0.25ml 。 全球通用）。 优缺点： • 细管冷冻精液需要专门的机器操作，打印、分 装、封口、冷冻一次完成。 • 细管型精液剂量准确，卫生条件好，质量稳定， 冻后活力高，使用方便，还可以减少在空气中 或在液氮保存中的污染，输精时利用专门的输 精枪，不需解冻液，直接解冻便可应用。 • 其缺点是，全套机器价格昂贵，小型冻精站不 便推广。
试验阶段 生产性实用阶段
冷冻精液阶段
二、人工授精技术的优越性：
提高优良种公畜的配种效能和种用价值，扩
大配种头数 牛：自然交配——1：40～1：100头/年， AI——1：6000～1：12000头/年。 大幅度减少种公畜的头数，降低饲养成本

加速家畜品种改良，促进育种工作进程 年份 1946 1966 1986 方法 本交 人工授精技术 人工授精技术+ 冷冻精液 年均产奶量 1900kg/头 3826kg/头 5846kg/头
1.采精
家畜的采精方法 ：
假阴道法 适用于各种家畜（犬除外）。 手握法 适用于猪。 按摩法 适用于禽类、犬科动物（对不能站
立的牛也可用） 电刺激采精法 适用于野生兽类的采精方法， （常需用氯胺酮等镇静剂保定，但采出的精 液往往射精量大而精子密度很低；对某些动 物如家兔只能引起阴茎强直性勃起而不射 精）。
每个剂量应含有效精子数：液态精液 0.2亿～
0.5 亿，颗粒冻精 ≥ 0.12 亿 / 粒，细管精液 ≥ 0.1 亿/支。
水牛
一般在发情开始后24～48h或于排卵前 约 6h输精一次，必要时间隔8～ 12h再输一次， 其余的不变。
（三）自动工厂化细管冷冻精液生产工 艺的应用。 标准化的生产，提高了冻精的产量、 质量（菌落数量减少），增加经济效益。 （四）种公牛科学饲养管理 全价日粮、合理的饲养方式、适宜 的环境、日常保健、合理调教等措施的 采用，延长利用时限（北京种公牛站由 63月龄→98月龄）。
（一）工艺进一步成熟：移植前对胚胎质量 的检查和筛选、受体选择、饲养管理和同 期化程度，部分生产应用达到 30% 以上的 受胎率。 （二）分离精子体外雌性胚胎的生产 （三）活体采卵效率的研究
B超活采仪