外源基因的表达体系
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
外源基因的导入和表达研究
外源基因的导入和表达研究随着生物技术的不断进步，人类利用基因工程技术已经可以人为地导入外源基因（即来自不同物种的基因）到特定的生物体中，并在其内部进行表达。
外源基因的导入和表达研究不仅在医学领域有重要的应用价值，而且可以用于植物和动物的育种、菌类的生产等多个领域，具有非常广泛的意义。
一、外源基因的导入方式外源基因的导入通常有三种方式：基因转染、基因克隆和基因突变。
其中基因转染是最常见的一种方法，其通过化学手段或物理手段将外源质粒导入到细胞内，使细胞内的染色体带有外源DNA序列，让生物体在遗传上发生变化。
基因克隆指的是利用重组DNA技术将外源基因插入到载体中，形成重组质粒，再将其导入到宿主细胞。
而基因突变指的是利用基因工程技术将目标基因的部分序列或全部序列进行基因剪切或点突变，从而在细胞内引入特定的改变。
二、外源基因的表达方式一旦外源基因成功地导入到宿主细胞后，就需要利用相应的机制使其被正确表达。
一般而言，外源基因的表达方式主要有两种：转录和翻译。
转录是指将某个基因的DNA序列转换成相应的mRNA序列，为后续的翻译打下基础。
而翻译则是将翻译RNA （tRNA）和核糖体结合，将mRNA的密码子转化成氨基酸序列，最终形成蛋白质。
在这个过程中，外源基因所编码的蛋白质需要能够正确地折叠和组装。
三、外源基因的应用外源基因的应用非常广泛。
在医学领域，外源基因的导入和表达技术已经成为了基因治疗的基础。
通过将正常的基因序列导入到受损或异常的细胞中，可以纠正基因缺陷，并且达到治疗某些遗传病的目的。
同时，外源基因导入技术也可以用于生产重组蛋白，如人类重组胰岛素、重组干扰素、重组免疫球蛋白等，这些蛋白对于多种疾病的治疗都有重要的作用。
在植物和动物育种领域，利用外源基因导入和表达技术也可以获得一些长期以来难以获得的农作物，如对抗虫害、抗病性更强的水稻、高营养价值的谷物等。
此外，外源基因导入技术还可以用于菌类的生产和制药领域。
第七章-外源基因的表达
2021/4/9
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第一节 外源基因在原核细胞中的表达
1.原核生物基因表达的特点
与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点： （1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 （2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。 （3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是 连续进行的。 （4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细 胞的转录后加工系统。 2（0215/4）/9 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对 2
202菌中的表达部位
（1）不同表达部位
克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有 的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是 以分泌到细胞外的方式表达。
■细胞质中表达
大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式 存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集 折叠而成的晶体结构。
（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3
➢具有一个强的tac（trp-lac）启动子，这个启动子是由trp启 动子的-35区、lac UV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列 组成。
➢紧接着tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头，使之很
2容021易/4/9把目的基因定位在启动子和S-D序列之后。
的基因，而不能用基因组DNA。 （3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控 制外源基的表达。 （4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读 框架。 （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外 源基因的表达产物对宿主菌的伤害。
3.原核生物基因表达的调控序列
外源基因的导入和表达机制
外源基因的导入和表达机制随着生物技术的飞速发展，外源基因的导入和表达成为了基因工程领域中的重要课题。
其涉及到基因治疗、转基因作物、药物生产等许多领域。
在导入和表达外源基因的过程中，要考虑到基因的适应性、表达的稳定性、特异性以及对宿主生物的影响等多个方面。
本文将探讨外源基因的导入和表达机制，包括基本原理、工具和技术以及存在的问题和挑战。
基本原理导入和表达外源基因的基本原理是将外源DNA序列引入到宿主细胞中，使其被转录和翻译成蛋白质。
具体而言，一般有两种方式：直接转染和向宿主基因组中嵌入外源基因，后者也称为基因整合。
直接转染是将外源DNA序列直接引入到细胞外，在细胞膜相关的受体介导下，外源DNA序列被进入到细胞质中。
直接转染的DNA所携带的信息将指导它在宿主细胞内的表达。
基因整合是将外源DNA序列整合到宿主细胞染色体上，使其成为宿主细胞的一部分。
基本原理是将外源DNA构建为一个适合于整合的载体，然后具体通过发生基因重组或嵌入基因导入宿主细胞的染色体中。
被整合的外源脱氧核糖核酸(DNA)序列将被遵循宿主细胞一样转录并翻译成蛋白质。
工具和技术导入和表达外源基因要解决的核心问题就是如何将外源DNA 送入宿主细胞。
为此，研究者现有许多的工具和技术可供选择。
电穿孔是将宿主细胞暴露在高电场的冲击下，使细胞膜通透性增强，外源DNA得以进入的技术。
这种技术既可以使用简单的电刺激来进行，也可以通过利用特殊设备专门进行。
这种技术在大多数细胞类型中都是有效的。
群粒化法是利用氟化物和离子溶液百炼生化学反应，在其中产生群粒化团块，通过进一步化学反应打开细胞膜，使外源DNA进入细胞内部。
这种技术适用于一些难以被电穿孔的细胞类型。
病毒载体是将外源DNA序列植入病毒中，通过感染宿主细胞扩增表达，使表达的目标基因在细胞内获得较高的表达水平。
存在的问题和挑战虽然外源基因的导入和表达在许多方面得到了极大的改进，但仍然存在着一些问题和挑战。
外源基因的表达
•Ⅱ型启动子
Ⅱ型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。
转录起始位点
TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它 启动子 与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。 基本区 其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置。 CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA 聚合酶的结合有关。 GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处， 与转录因子的结合有关。
s factor:
6.2.1.4 启动子的分离
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。 增强子的特性：
双向性。
重复序列。 增强子行使功能与所处的位置无关。
特异性。
增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
序列特异性
*启动子的特征 方向性 位置特性 种属特异性
6.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为 CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基 （A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启 动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的 重要因素。
6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
外源基因的表达
小节
外源基因的转录系统
蛋白质的翻译系统
基因表达载体
复制子 选择标记
*
4.3.1 重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因
4.3 宿主菌
1
大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统
2
大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子。
3
大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。
*
终止子
2.4 衰减子 转录终止的位置 分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。 调节转录的起始和终止. Trp操纵子
1
2
第三节 外源基因表达系统
3.1 定义 外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。
*
3.2 种类
*
起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG），编码甲硫氨酸（MET），是首选的起始密码子。 GUG、UUG：有极少数生物利用。
翻译起始密码子
③翻译终止密码子
翻译终止密码子：能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。 在大肠杆菌中，新合成的多肽链的释放由RF1和RF2两个释放因子所调控。 RF1识别终止密码UAA和UAG， RF2识别终止密码UAA和UGA 由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。 通常将几个终止密码串连在一起，以保证翻译的有效终止。
启动子和终止子：因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。
1
2
*
①启动子
外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。
外源基因的原核表达
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常见的大肠杆菌表达系统
• PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启 动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和 PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或 溶原循环。 λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产
物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在
细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之 间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞
与起始密码ATG之间的距离及碱基 的种类；防止核糖体结合位点附近 序列转录后形成发卡结构。
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表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标
基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之 间的距离和碱基组成处于一个适当的范围 内。
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核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻
1、原核生物：选择一个RNase缺失 的工程菌株。
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
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外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表
达体系时应考虑以下问题：
1、AUG为首选起始密码子 2、SD序列为与核糖体结合位点
3、SD序列与起始密码子之间的距离为 3～9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子
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尽量提高核糖体结合位点本身和附近 的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5’ 端形成的 “茎环” 结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意 的事项。
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。
以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。
质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。
2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。
这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。
3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。
选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。
4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。
这一步通常涉及DNA 连接酶。
5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。
质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。
6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。
这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。
7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。
8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。
这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。
9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。
这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。
整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。
这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。
外源基因在真核细胞中的表达
（1）新霉素磷酸转移酶（氨基葡萄糖苷磷酸转移酶， neomycin phosphotransferase Ⅱ, NptⅡ）
Npt Ⅱ 基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生 素（如新霉素，庆大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化， 使抗生素失去对细胞的毒性，这是由于磷酸化的抗生素不能 与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，进一步 影响70S起始复合体合成，干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物 合成，使植物细胞最终死亡，因此，与外源基因结合的Npt基 因转化细胞后，就可在含有抗生素的培养基上存活下来。
gfp基因是从维多利亚水母中分离纯化的一种可以发出绿
色荧光的物质。GFP为238个氨基酸的小蛋白，发色团能吸 收可见光而发射荧光，用荧光显微镜可检测到GFP产生的绿 色荧光。GFP检测不需要添加任何底物或辅助因子，不使用 同位素，不需要测定酶的活性等优点，且在原核和真核生 物中都能表达，表达产物对细胞无毒性。
外源基因在真核生物细胞中的表达，对于分
子生物学理论研究，对真核生物基因表达调控的
探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。
外源基因如何才能转入真核细胞？又如何能
从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞？
又是如何对转化的真核生物进行鉴定？
一、选择标记基因和报告基因：
1. 基因转化的选择标记
选择标记一般是一种基因，即选择标记基因，他在转化 前与待转化外源基因相连接，当把已转化和未转化的细胞 群体臵于加有选择剂的（抗生素）的培养基上进行培养时， 已转化的细胞群体或再生植株由于带有选择标记基因，该 基因的产物---酶能分解培养基中加入的选择剂，因此，转 化细胞对选择剂具有抵抗能力，不受选择剂毒害而正常地 生长，发育。相反未转化细胞或再生植株受培养基中选择 剂的毒害，而不能存活下来而被淘汰。
外源DNA在细胞中的转移和表达
外源DNA在细胞中的转移和表达随着科技的不断发展，我们对基因组的研究越来越深入。
在研究过程中，我们发现外源DNA的转移和表达对于生物的遗传特征和功能有着深远的影响。
本文将探讨外源DNA在细胞中的转移和表达的相关问题。
一、外源DNA的转移外源DNA指的是与受体生物个体基因组不同来源的DNA。
它主要通过三种方式转移：共轭转移、转化和病毒感染。
1.共轭转移共轭转移是指某些细菌通过细胞接触传递质粒来进行外源DNA的转移。
质粒是一种环形DNA分子，存在于细胞质中。
质粒常常拥有一个带有选择性抗性基因的繁殖元件，其可以使细胞对抗多种抗生素的攻击。
共轭转移是一种有目的的方式，它使得受体个体获得了不同的基因信息，从而增强了生命体对环境的适应能力。
2.转化转化是指细菌在自然环境中吸收外源DNA的过程。
在自然环境中，有许多细菌死亡，并释放出它们的DNA。
这些DNA被其他细菌吸收并整合到自己的基因组中。
这个过程被称为“自然转化”。
3.病毒感染有些病毒会把它们的DNA复制到细胞中。
这些病毒被称为“转座子”。
转座子能够整合到基因组的一个特定位置上，并且能够激活或关闭其他基因。
这种方式是一种被动的转移，但是病毒感染也可以改变个体的生物遗传特征。
二、外源DNA的表达外源DNA被转移到受体个体后，在细胞中，需要进一步经过转录和翻译等过程才能表现出来。
外源DNA在受体个体中的表达三种方式：转录、翻译和蛋白质修饰。
1.转录转录是指DNA信息通过RNA分子传递到蛋白质的生物合成过程。
外源DNA在受体个体中的转录，需要使用特殊的酶来“阅读”DNA序列。
这些酶负责转录DNA，把它们转化成类似于RNA的分子。
这种方式被称为“反转录”。
反转录发生在病毒、反转录病原体和外来基因的转染过程中。
2.翻译翻译是指RNA指导的蛋白质骨架的合成过程。
外源DNA被转录为mRNA后，mRNA要到核外才能被翻译成蛋白质。
在核外，mRNA被翻译成蛋白质，然后该蛋白质在细胞中被修改，最终形成目标蛋白质。
ecoli表达体系
ecoli表达体系E. coli表达体系引言：E. coli（大肠杆菌）是一种常见的细菌，广泛应用于基因工程和蛋白质表达领域。
其独特的表达体系为科学家们在基因工程研究中提供了强大的工具。
本文将介绍 E. coli表达体系及其在蛋白质表达中的应用。
一、E. coli表达体系的基本原理E. coli表达体系是利用大肠杆菌作为宿主细胞来表达外源基因的一种方法。
其基本原理是将目标基因插入到表达载体中，然后将载体转化到E. coli细胞中，通过细胞的代谢和转录机制来实现目标基因的表达。
E. coli表达体系具有高效、简便、经济的特点，因此被广泛应用于基因工程领域。
二、E. coli表达体系的关键组成部分1. 表达载体：表达载体是E. coli表达体系的核心部分，通常由启动子、多克隆位点、选择标记和复制起始子等功能元件组成。
启动子用于启动目标基因的转录，多克隆位点用于插入目标基因，选择标记用于筛选转化成功的细菌，复制起始子用于维持载体的复制。
常用的表达载体有pET、pBAD、pGEX等。
2. 宿主细胞：E. coli细胞是E. coli表达体系的宿主细胞，其具有较高的生长速度和简单的培养条件，能够满足大规模表达的需求。
同时，E. coli细胞也具有较高的遗传稳定性和表达效率，使其成为理想的表达宿主。
3. 外源基因：外源基因是指需要表达的目标基因，可以是来自其他物种的基因序列，也可以是人工设计的合成基因。
外源基因的选择应根据研究目的和需求进行合理设计。
三、E. coli表达体系的应用E. coli表达体系在蛋白质表达领域具有广泛的应用前景。
以下是几个常见的应用领域：1. 重组蛋白表达：利用E. coli表达体系可以高效表达各种重组蛋白，如药物、酶、抗体等。
通过对目标基因的合理设计和优化表达条件，可以实现大规模的蛋白质产量，并且具有较高的纯度和活性。
2. 代谢工程：E. coli表达体系在代谢工程中也发挥着重要的作用。
外源基因的导入和表达技术
外源基因的导入和表达技术生物工程是一个仍在不断发展的领域，其中的基因工程尤其备受关注。
而外源基因的导入和表达技术则是基因工程领域中的重要组成部分。
本文将从外源基因的导入方式、表达技术、应用等方面进行讲解，以期为读者展开一个全面的了解之旅。
一、外源基因的导入方式外源基因的导入方式包括：化学转化、物理转化和生物转化三种。
其中，化学转化指的是利用一系列的化学试剂将外源基因导入到细胞中；物理转化是将外源基因通过物理方式（如电击、微射膜等）直接导入到细胞膜内；生物转化则是利用微生物（如农杆菌）的天然转化机制，将外源基因转移至宿主细胞中。
三种导入方式各有优缺点，需根据具体情况进行选择。
例如，化学转化可以较为方便地实现基因导入，但同时也容易导致不可逆的细胞损伤；生物转化虽然安全可靠，但其稳定性与效率相对较低；物理转化则可以在不影响细胞生存的前提下完成基因转化，但也存在操作复杂、转化效率低等问题。
二、外源基因的表达技术对于外源基因的表达技术而言，主要有以下几种：1.原核细胞表达：指在原核细胞（如大肠杆菌等）中实现外源基因的转录和翻译。
该方式快速、高效，适用于小分子蛋白的表达和药物筛查。
2.真核细胞表达：指在真核细胞（如哺乳动物细胞等）中实现外源基因的转录和翻译。
与原核细胞表达相比，该方式可满足更多的表达需求，但同时也更为复杂。
3.质粒表达：指将外源基因插入质粒中，利用质粒的复制和转录机制实现基因的表达。
该方式容易操作，但不适用于大分子蛋白的表达。
以上三种方式各有利弊，需根据具体需求进行选择。
例如，对于高产量、大分子量的蛋白表达而言，真核细胞表达较为优越；对于筛查药物、构建基因工程菌等，则可以采用原核细胞表达。
三、外源基因表达技术的应用外源基因表达技术在许多领域都具有广泛的应用，以下列举几个典型示例：1.蛋白质表达：基因重组技术可以有效地提高某些蛋白质的表达量，为生物学研究和医药开发提供了有力的技术支持。
例如，基因重组技术在制备重组人胰岛素、静脉营养液等方面得到了广泛应用。
外源基因表达的基本流程
外源基因表达的基本流程包括以下几个关键步骤：克隆：1.1.选择合适的限制性内切酶将外源基因从其原始DNA中切割出来。
2.将切割后的外源基因插入到表达载体（如质粒、病毒载体等）的多克隆位点，确保正确的阅读框和若为分泌型蛋白还需考虑信号肽序列的一致性。
重组载体构建：1.通过连接酶的作用将外源基因与线性化的载体连接起来形成重组DNA分子。
2.验证重组体是否成功构建，通常采用PCR、酶切分析或测序技术。
2.转化：1.将重组载体导入宿主细胞，常见宿主有大肠杆菌、酵母菌或其他哺乳动物细胞系。
2.转化方法可以是电穿孔法、热激法、PEG介导法或者原生质体融合法等。
3.筛选与鉴定：1.在含有合适选择标记（如抗生素抗性基因）的培养基上筛选转化成功的细胞。
2.进一步通过PCR验证、Southern blotting 或 Westernblotting等方法确认外源基因是否已整合入宿主染色体并正确表达。
4.诱导表达（对于可调控表达系统）：1.如果使用的是诱导型表达系统，会在适当时间加入诱导剂（如IPTG对 lac 操纵子的诱导），促使外源基因开始转录和翻译。
5.表达产物检测与纯化：1.表达出的蛋白质可以通过SDS-PAGE、Western blotting等方法进行定性和定量分析。
2.对于需要进一步应用的重组蛋白，还需要通过亲和层析、离子交换层析等多种纯化策略得到高纯度的目的蛋白。
功能鉴定：1.最后，对外源基因编码的蛋白质进行生物学功能的测定，以证明其活性和用途，比如在药物研发、疫苗生产或遗传疾病治疗中的应用。
外源基因表达机制
B）构建重组异源蛋白表达系统 将SD序列和启动子安装在外源基因的5’端 ATG碱基前的正确位置，使外源基因高效表达序 列正确的天然蛋白． C）构建分泌型异源蛋白表达系统 将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因 拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直 接进入到培养基中． 优点：增大表达蛋白的稳定性大大简化后续 的分离纯化步骤．
原核生物启动子
转录起始位点。多数细菌启动子转录起始区序列为 CAT． Pribnow框。在距转录起始位点上游6bp处存在一个六联 体保守序列： TATAAT ，由于中间的碱基位于转录的起始 点上游的 10bp 处，又称为 -10 序列区。少数 Pribnow 框 中间碱基的位置在-9-18之间变化。 Sextama 框。在转录启动区的另一个六联体保守序列位 于距转录起 始位点上游 35bp 处，通常称为 -35 区，该 保守序列为TTGACA，它是 RNA聚合酶的识别位点。 间隔区。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基 组成对启动子的功能并不十分重要。但间隔序列的长 度却是影响启动子功能．
5 绝缘子
* 绝缘子（insulator）：在真核生物基因组中， 既是基因表达的调控元件，也是一种边界元 件．在果蝇和鸡的基因组中已发现多个绝缘子， 它能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启 动子起增强或抑制作用．
* 果蝇中绝缘子SCS和SCS’分别位于果蝇多线染色 体87A7座位hsp70基因两侧的核酸酶高度敏感 区，它们是一种具有顺式调控作用的边界元件， 能使其界定的染色体结构域上的基因免受区域 外两端正调控和负调控信号的影响．
Ⅲ型启动子。 * 内启动子:转录起始位点的下游，如tRNA和5sRNA 的启动子。 * 外启动子:转录起始位点的上游，如脊椎动物U6 核小RNA和7SK RNA启动子，其结构类似于真核生 物Ⅱ型启动子。
基因工程-第9章-外源基因的表达
故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，
Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。
-35区，位于转录起始位点上游35bp处， 故称-35区，一般由10个碱基组成。一般认为， -35区是RNA聚合酶σ亚基的识别与结合位点。 当σ亚基附着在-35区后，便带动RNA聚合酶 的核心酶(core enzyme，无σ亚基的RNA聚合 酶)沿DNA链向转录起始方向滑动至Pribnow盒， 并与之接触，而一旦它们相互结合之后，σ亚
转录终止子，目的是为了稳定载体系统。因
为上游强的tac启动子控制的转录必须由强终
止子抑制，才不至于干扰与载体本身稳定性 有关的基因 表达。
2.分泌型克隆表达载体pIN Ⅲ系统
这个载体系统是以pBR322为基础构建的。
它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即
Ipp(脂蛋白基因)启动子。ห้องสมุดไป่ตู้启动子的下游装
1. 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶
结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表 达不可缺少的重要调控序列。没有启动子， 基因就不能转录。
原核生物启动子是由两段彼此分开且又 高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成 极为重要。
Pribnow盒，位于转录起始位点上游5～
10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，
点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／
C的区域，G／C富含区域又具有回文对称结 构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环
结构，并且具有与A/T富含区对应的一串U。
4．衰减子
衰减子(attenuator)是指在某些前导序列中 带有控制蛋白质合成速率的调节区。在原核 生物中，一条mRNA分子常常编码数种不同的 多肽链。这种多顺反子mRNA的头一条多肽链 合成的起始点，同RNA分子的5’-P末端间的距 离可达数百个核苷酸。这段位于编码区之前 的 不 转 译 的 mRNA 区 段 ， 叫 做 前 导 序 列 (1eader)。此外，在mRNA的3'-OH末端，以及 在多顺反子mRNA中含有的长达数百个碱基的 顺反子间序列(intercistranic-sequence)，即间隔 序列 (spacer)，也发现有不转译的序列。
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芽胞杆菌表达系统
蛋白水解： 蛋白水解： 芽胞杆菌分泌胞外蛋白酶， 芽胞杆菌分泌胞外蛋白酶，至少七种 ——碱性蛋白酶（arpE） 碱性蛋白酶（ 碱性蛋白酶 arpE） 中性蛋白酶（ nprB） 中性蛋白酶（nprE 和nprB） 金属蛋白酶（mpr） 金属蛋白酶（mpr） 丝蛋白酶（epr\bpf\vpr） 丝蛋白酶（epr\bpf\vpr） 其中，aprE和nprE最普遍 最普遍。 其中，aprE和nprE最普遍。
芽胞杆菌表达系统
特点： 特点： 非致病性 遗传学研究 分泌胞外蛋白 生产商业酶
芽胞杆菌表达系统
宿主菌： 宿主菌： 枯草杆菌、嗜碱芽胞杆菌、淀粉芽胞杆菌、 枯草杆菌、嗜碱芽胞杆菌、淀粉芽胞杆菌、 短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、 短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、嗜热脂肪芽 胞杆菌、耐碱的芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等。 胞杆菌、耐碱的芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等。
芽胞杆菌表达系统
蛋白折叠： 蛋白折叠： 枯草芽孢杆菌 内陪伴分子（intracellular molecular chaperones） ） 外陪伴分子（extracytoplasmic molecular chaperones） ） PrsA 变型菌株：WB600蛋白缺陷型 变型菌株：WB600蛋白缺陷型 WB600[pEPP]型含有 型含有PrsA WB600[pEPP]型含有PrsA WB600BHM[pEPP]型有内外陪伴分子 型有内外陪伴 WB600BHM[pEPP]型有内外陪伴分子 发现二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白还原酶——保护巯基 发现二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白还原酶 保护巯基
表达系统概述
表达系统分类 表达系统分类 原核表达系统 大肠杆菌表达系统 芽胞杆菌表达系统 链霉菌表达系统 真核表达系统 酵母表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 植物细胞表达系统
表达系统概述
研究表达体系意义： 研究表达体系意义： 意义 高效、稳定、准确表达外源基因 高效、稳定、准确表达外源基因 需考虑： 基因来源 产物类型 需考虑： 科研背景 应用背景
包涵体
其他表达系统及对比
酵母表达系统： 酵母表达系统： 特点：含有真核体系共有的翻译后修饰，生长快、 特点：含有真核体系共有的翻译后修饰，生长快、 方便简单成本低，外源蛋白易分离。 方便简单成本低，外源蛋白易分离。 宿主菌：毕赤酵母、酿酒酵母 宿主菌：毕赤酵母、
三种表达系统的对比
特有优点 芽胞杆菌表达系统 无毒（ 1. 无毒（除炭疽芽胞杆 蜡样芽胞杆菌） 菌、蜡样芽胞杆菌） 2. 分泌胞外蛋白 遗传学背景最全 1．无毒 2．真核修饰 缺点 1.分泌蛋白酶 1.分泌蛋白酶 2.质粒稳定性差 2.质粒稳定性差 3.无真核修饰 3.无真核修饰 1．易形成包涵体 易形成包涵体 2．无真核修饰 产乙醇
其他表达系统及对比
大肠杆菌表达系统： 大肠杆菌表达系统：
特点：遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期 特点：遗传背景清楚、目的基因表达水平高、 抗污染能力强等。 短、抗污染能力强等。 表达载体：需含有启动子（ 启动子 启动子、 启动子 启动子trp启动 表达载体：需含有启动子（lac启动子、tac启动子 启动 ）、核糖体结合位点 核糖体结合位点（ ）、转录终止子 子）、核糖体结合位点（RBS）、转录终止子 ）、 回文结构）。 （回文结构）。 提高外源基因表达水平：提高翻译水平、生长与表达分开、 提高外源基因表达水平：提高翻译水平、生长与表达分开、 提高表达蛋白稳定性
差异？？？ 差异？？？
载体： 载体： 质粒、整合质粒、 质粒、整合质粒、噬菌体Leabharlann 各种胞内外反应对外源表达的影响
芽胞杆菌表达系统
芽胞杆菌表达系统
转录
蛋白折叠
跨膜
信号肽加工
蛋白水解
芽胞杆菌表达系统
转录： 转录： RNA聚合酶 核心酶、 亚基） 聚合酶（ RNA聚合酶（核心酶、σ亚基） 强启动子（Pamy－ 强启动子（Pamy－α-淀粉酶启动子、Ptms－ 淀粉酶启动子、Ptms－ 强营养启动子、P43－σA和 强营养启动子、P43－σA和σB 识别的启动子） 识别的启动子） P43〉Ptms〉Pamy P43〉Ptms〉
外源基因的微生物表达系统 外源基因的微生物表达系统
——芽胞杆菌表达系统 芽胞杆菌表达系统
主要内容
表达系统概述 芽胞杆菌表达系统
其他表达系统及对比
表达系统概述
基因的外源表达 将外源基因与表达载体连接， 基因的外源表达——将外源基因与表达载体连接， 外源表达 将外源基因与表达载体连接 导入到受体细胞中，高效生产有价值的基因产物。 导入到受体细胞中，高效生产有价值的基因产物。 这一过程包括外源基因的复制、转录、翻译、 这一过程包括外源基因的复制、转录、翻译、加 分离纯化等。 工、分离纯化等。 表达系统——重组表达载体 外源基因的表达系统 重组表达载体 外源基因的表达系统 受体细胞
芽胞杆菌表达系统
跨膜： 跨膜： 定位——前体蛋白与陪伴分子、信号肽结 前体蛋白与陪伴分子、 定位 前体蛋白与陪伴分子 合，定位在质膜上 转移——膜蛋白 转移 膜蛋白 能量 释放——信号肽酶 释放 信号肽酶
芽胞杆菌表达系统
信号肽加工： 信号肽加工： 信号肽分类——TypeⅠ、TypeⅡ TypeⅠ、 信号肽分类 TypeⅠ 信号肽酶—— 七种（SipS、SipT） 七种（SipS、SipT） 信号肽酶 SPases） （SPases）
大肠杆菌表达系统 酵母表达系统
共同点：发酵周期短、 共同点：发酵周期短、遗传学研究全面
Thank you for your attention!
芽胞杆菌表达系统
蛋白酶缺陷型菌株： 蛋白酶缺陷型菌株： WB600存在vpr（丝蛋白酶） WB600存在vpr 丝蛋白酶） 存在vpr（ WB700全部缺陷 WB700全部缺陷 WB800去除内源蛋白酶的影响 WB800去除内源蛋白酶的影响
芽胞杆菌表达系统
注意： 注意： 胞外蛋白酶——缺陷型菌株 胞外蛋白酶 缺陷型菌株 质粒稳定性——质粒构建 质粒构建 质粒稳定性