外源基因的表达体系

包涵体
其他表达系统及对比
酵母表达系统： 酵母表达系统： 特点：含有真核体系共有的翻译后修饰，生长快、 特点：含有真核体系共有的翻译后修饰，生长快、 方便简单成本低，外源蛋白易分离。 方便简单成本低，外源蛋白易分离。 宿主菌：毕赤酵母、酿酒酵母 宿主菌：毕赤酵母、
三种表达系统的对比
特有优点 芽胞杆菌表达系统 无毒（ 1. 无毒（除炭疽芽胞杆 蜡样芽胞杆菌） 菌、蜡样芽胞杆菌） 2. 分泌胞外蛋白 遗传学背景最全 1．无毒 2．真核修饰 缺点 1.分泌蛋白酶 1.分泌蛋白酶 2.质粒稳定性差 2.质粒稳定性差 3.无真核修饰 3.无真核修饰 1．易形成包涵体 易形成包涵体 2．无真核修饰 产乙醇
芽胞杆菌表达系统
蛋白酶缺陷型菌株： 蛋白酶缺陷型菌株： WB600存在vpr（丝蛋白酶） WB600存在vpr 丝蛋白酶） 存在vpr（ WB700全部缺陷 WB700全部缺陷 WB800去除内源蛋白酶的影响 WB800去除内源蛋白酶的影响
芽胞杆菌表达系统
注意： 注意： 胞外蛋白酶——缺陷型菌株 胞外蛋白酶 缺陷型菌株 质粒稳定性——质粒构建 质粒构建 质粒稳定性
芽胞杆菌表达系统
特点： 特点： 非致病性 遗传学研究 分泌胞外蛋白 生产商业酶
芽胞杆菌表达系统
宿主菌： 宿主菌： 枯草杆菌、嗜碱芽胞杆菌、淀粉芽胞杆菌、 枯草杆菌、嗜碱芽胞杆菌、淀粉芽胞杆菌、 短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、 短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、嗜热脂肪芽 胞杆菌、耐碱的芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等。 胞杆菌、耐碱的芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等。
芽胞杆菌表达系统
蛋白水解： 蛋白水解： 芽胞杆菌分泌胞外蛋白酶， 芽胞杆菌分泌胞外蛋白酶，至少七种 ——碱性蛋白酶（arpE） 碱性蛋白酶（ 碱性蛋白酶 arpE） 中性蛋白酶（ nprB） 中性蛋白酶（nprE 和nprB） 金属蛋白酶（mpr） 金属蛋白酶（mpr） 丝蛋白酶（epr\bpf\vpr） 丝蛋白酶（epr\bpf\vpr） 其中，aprE和nprE最普遍 最普遍。 其中，aprE和nprE最普遍。
其他表达系统及对比
大肠杆菌表达系统： 大肠杆菌表达系统：
特点：遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期 特点：遗传背景清楚、目的基因表达水平高、 抗污染能力强等。 短、抗污染能力强等。 表达载体：需含有启动子（ 启动子 启动子、 启动子 启动子trp启动 表达载体：需含有启动子（lac启动子、tac启动子 启动 ）、核糖体结合位点 核糖体结合位点（ ）、转录终止子 子）、核糖体结合位点（RBS）、转录终止子 ）、 回文结构）。 （回文结构）。 提高外源基因表达水平：提高翻译水平、生长与表达分开、 提高外源基因表达水平：提高翻译水平、生长与表达分开、 提高表达蛋白稳定性
芽胞杆菌表达系统
跨膜： 跨膜： 定位——前体蛋白与陪伴分子、信号肽结 前体蛋白与陪伴分子、 定位 前体蛋白与陪伴分子 合，定位在质膜上 转移——膜蛋白 转移 膜蛋白 能量 释放——信号肽酶 释放 信号肽酶
芽胞杆菌表达系统
信号肽加工： 信号肽加工： 信号肽分类——TypeⅠ、TypeⅡ TypeⅠ、 信号肽分类 TypeⅠ 信号肽酶—— 七种（SipS、SipT） 七种（SipS、SipT） 信号肽酶 SPases） （SPases）
表达系统概述
表达系统分类 表达系统分类 原核表达系统 大肠杆菌表达系统 芽胞杆菌表达系统 链霉菌表达系统 真核表达系统 酵母表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 植物细胞表达系统
表达系统概述
研究表达体系意义： 研究表达体系意义： 意义 高效、稳定、准确表达外源基因 高效、稳定、准确表达外源基因 需考虑： 基因来源 产物类型 需考虑： 科研背景 应用背景
差异？？？ 差异？？？
载体： 载体： 质粒、整合质粒、 质粒、整合质粒、噬菌体
各种胞内外反应对外源表达的影响
芽胞杆菌表达系统
芽胞杆菌表达系统
转录
蛋白折叠
跨膜
信号肽加工
蛋白水解
芽胞杆菌表达系统
转录： 转录： RNA聚合酶 核心酶、 亚基） 聚合酶（ RNA聚合酶（核心酶、σ亚基） 强启动子（Pamy－ 强启动子（Pamy－α-淀粉酶启动子、Ptms－ 淀粉酶启动子、Ptms－ 强营养启动子、P43－σA和 强营养启动子、P43－σA和σB 识别的启动子） 识别的启动子） P43〉Ptms〉Pamy P43〉Ptms〉
大肠杆菌表达系统 酵母表达系统
共同点：发酵周期短、 共同点：发酵周期短、遗传学研Biblioteka Baidu全面
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芽胞杆菌表达系统
蛋白折叠： 蛋白折叠： 枯草芽孢杆菌 内陪伴分子（intracellular molecular chaperones） ） 外陪伴分子（extracytoplasmic molecular chaperones） ） PrsA 变型菌株：WB600蛋白缺陷型 变型菌株：WB600蛋白缺陷型 WB600[pEPP]型含有 型含有PrsA WB600[pEPP]型含有PrsA WB600BHM[pEPP]型有内外陪伴分子 型有内外陪伴 WB600BHM[pEPP]型有内外陪伴分子 发现二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白还原酶——保护巯基 发现二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白还原酶 保护巯基
外源基因的微生物表达系统 外源基因的微生物表达系统
——芽胞杆菌表达系统 芽胞杆菌表达系统
主要内容
表达系统概述 芽胞杆菌表达系统
其他表达系统及对比
表达系统概述
基因的外源表达 将外源基因与表达载体连接， 基因的外源表达——将外源基因与表达载体连接， 外源表达 将外源基因与表达载体连接 导入到受体细胞中，高效生产有价值的基因产物。 导入到受体细胞中，高效生产有价值的基因产物。 这一过程包括外源基因的复制、转录、翻译、 这一过程包括外源基因的复制、转录、翻译、加 分离纯化等。 工、分离纯化等。 表达系统——重组表达载体 外源基因的表达系统 重组表达载体 外源基因的表达系统 受体细胞