定点突变技术——从单点突变到多点突变
定点诱变技术
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Single gene shuffling
. .. . ....... library of point mutants
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
在正常情况下，尿嘧啶Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺 入DNA中的尿嘧啶残基。但 在ung-的菌株中，此酶失活。
在大肠杆菌dut- ung-菌株 中生长的M13噬菌体的单链基 因组DNA中将含有20-30个尿 嘧啶残基。用这些噬菌体感染 ung+菌株，尿嘧啶被迅速去 除，DNA链遭到破坏，感染 力下降约5个数量级。
牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）
How DNA shuffling works ？
二、随机引物PCR(RPR)和重组装
多功能氧化酶的定向进化 （Hikaru Suenaga等,2001）
How DNA shuffling works ？
三、交错延伸PCR突变法(StEP)
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
芽孢杆菌脲酸酶的定向 进化 （Su-Hua Huang等,2004）
定点突ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的研究意义
1.对调控区进行突变
研究基因结构与功能之间的关系
2. 对编码基因进行突变
PCR介导的基因突变
在基因5’和3’末端产生突变 重叠延伸PCR 大引物PCR法
定点突变技术的原理和步骤
定点突变技术的原理和步骤嘿，咱今儿来聊聊定点突变技术呀！这玩意儿可神奇了呢！你想啊，就好像是一个特别厉害的魔法，能让基因按照我们的想法来变一变。
那定点突变技术的原理是啥呢？简单来说，就是要精准地在基因的特定位置上搞点小改动。
这就好比是在一个庞大的基因拼图里，准确地找到那一块我们想要动的小拼图，然后给它换个模样。
这可不是随随便便就能做到的哦，得有非常精细的操作和技巧才行呢。
那具体咋操作呢？这步骤可不能马虎。
首先呢，得设计好要突变的那个点，这就像是给要走的路先规划好方向，可不能瞎走。
然后，要准备好各种工具和材料，这就跟出门得带好钥匙、钱包一样重要。
接下来，就是真正开始动手啦！就像一个精巧的工匠，小心翼翼地对基因进行操作。
把原来的那块小拼图取出来，再把我们准备好的新的放进去。
这过程可得特别仔细，不能有一点差错，不然可就前功尽弃啦！做完这些还不算完哦，还得检查检查，看看变的对不对，效果好不好。
这就像我们做完作业得检查一遍一样，可不能马马虎虎的。
你说这定点突变技术是不是很神奇？它能让我们对基因进行精确的改造，为很多领域带来了巨大的帮助。
比如说在医学上，能帮助我们研究疾病的发生机制，找到更好的治疗方法。
在农业上呢，能让农作物变得更优秀，产量更高，品质更好。
想象一下，如果没有定点突变技术，我们对基因的了解和利用会少多少啊！那得是多大的损失呀！所以说，这项技术真的是太重要啦！总之呢，定点突变技术就是这样一个既有趣又有用的东西。
它让我们对基因的操控变得更加精准和有效。
我们要好好利用它，让它为我们的生活带来更多的好处和惊喜。
你说是不是呀？。
蛋白质工程的定点突变
20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
定点突变技术：从单点突变到多点突变
定点突变技术：从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E. coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经da m甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
简单介绍定点单突变与多突变
1.3.克隆及测序：反应结束后,将PCR 产物进行回收,经
酶切、连接、转化等步骤后克隆到pGL3 - Basic报告基因载 体中,送上海生物工程公司测序。看单位点突变是否成功。
结果：
重叠延伸PCR扩增人TGF -β2基因启动子 区-114bp区突变基因 Ⅰ和Ⅱ分别为5’端带有突变位 点的短片段PCR产物, Ⅲ是以Ⅰ和Ⅱ为模板进行延伸 并扩增得到的带有突变位点的564bpPCR产物,见图1。
2.定点多突变：下面举一个双突变的例子：与单突
变不同，双突变需要六个引物，两个通用引物，以及四个定点 突变引物：方法看图2.
结果：
图2 各阶段PCRБайду номын сангаас物电泳图
M:DL2000 DNA 分子量标记; 1: 985bp 片段; 2: 578bp 片段; 3: uORF1Mu (由985bp 片段、578bp 片段重叠延伸而来,长 1534bp) ; 4: 1101bp 片段; 5: 459bp 片段; 6: uORF2Mu (由1101bp 片段、459bp片段重叠延伸而来,长1534bp)
一：定点单突变
1 材料和方法 1.1.材料：Pyrobest TaqDNA Polymerase、dNTP、 T4DNA连接酶、限制性内切酶MluⅠ和BglⅡ及琼脂糖。2 个含有突变碱基的反向互补的引物，2个分别与DNA两端互 补的上下游通用引物：
引物1:5’GTATCAACGCGTAAAACGGGAGACTTGATTGT3’， 引物2: 5’GATCTAAGATCTATTGCTCGCTTAGGGTAGG3’， 引物3: 5 ’ACCAAAAGCTCTCCCCGAAC3 ’， 引物4:5’GGGAGAGCTTTTGGTCTAAGTA3’，
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
简单介绍定点单突变与多突变
一：定点单突变
1 材料和方法 1.1.材料：Pyrobest TaqDNA Polymerase、dNTP、 T4DNA连接酶、限制性内切酶MluⅠ和BglⅡ及琼脂糖。2 个含有突变碱基的反向互补的引物，2个分别与DNA两端互 补的上下游通用引物：
引物1:5’GTATCAACGCGTAAAACGGGAGACTTGATTGT3’， 引物2: 5’GATCTAAGATCTATTGCTCGCTTAGGGTAGG3’， 引物3: 5 ’ACCAAAAGCTCTCCCCGAAC3 ’， 引物4:5’GGGAGAGCTTTTGGTCTAAGTA3’，
定点单突变及多突变
随着分子生物学研究的突飞猛进,基因定点突变技术成为 一项重要的分子生物学实验技术手段,在基因表达及蛋白 质的结构与功能之间关系等方面的研究中得到广泛的应用。 常用的定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、 PCR介导的定点突变及盒式突变。目前, PCR介导的定点 突变技术是使用最普遍的定点突变方法,以PCR为基础的 突变方法一般有大引物突变、重叠延伸突变及一步快速突 变。重叠延伸突变PCR可以在DNA区段的任何位置突变, 且可以在侧引物的两端设计酶切位点,方便进一步的连接 克隆。我今天要举得例子是重叠延伸突变，包括两个内容： 一· 定点单突变。二.定点多突变。
第一次pcr：分别利用两对引物进 行常规pcr，产生两个DNA片段。 两个pcr片段有一段的重叠，即互 补配对，且突变位点位于重叠序列 中间位置，进行跑胶。第二次pcr： 纯化回收后，两个片段混合作为模 板分别利用引物1和引物2 进行 pcr，变性后的两个片段将在重叠 区域退火,进而延伸形成全长。进 行跑胶。
2.定点多突变：下面举一个双突变的例子：与单突
变不同，双突变需要六个引物，两个通用引物，以及四个定点 突变引物：方法看图2.
定点突变技术
操作：设计引物，分别PCR，前两次PCR 反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需 纯化,直接将胶条切下置于EP管中, 80℃冷冻10min,然后将胶条离心后分 别取上清液作为模板进行第三次PCR,以 获得全长的突变目的基因
PCR介导的定点突变法其优点是操作较简 单，突变的成功率可达100%。但它亦 有两个缺点:①后续工作较复杂，PCR扩 增产物通常需要连接到载体分子上，然
寡核有酸引物介导的定点突变 法其优点是保真度比PCR突变法 高，经过改进后使该方法突变少 成功率大大提高，缺点是操作过 程环节复杂制。
盒式突变法具有简单易行、突变效率高 等优点，还可以在一对限制酶切位点内 一次突变多个位点。缺点是合成多条引 物的成本较高。另外，在一般情况下， 在靶DNA片段的两侧往往难以满足存在 一对限制性酶切位点的要求，限 制了该 方法的广泛应用。然而一旦具备了这样 的条件该方法则为首选。
定点突变技术
刘微
基因的定点突变技术
点突变的技术有很多种，常见的有： ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术
（M13噬菌体法） ㈡ 盒式诱变 ㈢PCR点突变技术
1.引物PCR定点诱变法 2.重组PCR定点诱变法 3.重叠延伸PCR技术
寡核苷酸引物诱变技术 （M13噬菌体）
噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体 粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后， 通过复制以双链形式存在。将待研究的基因 插入载体M13，制得单链模板，人工合成一 段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基） 作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶 连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双 链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类 型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。
重组PCR定点诱变2
操作：设计引物，分别PCR， 从两个PCR反 应管中各取出3μl PCR反应产物,混匀后用 CaCl2转化法转化至感受态大肠杆菌中。涂 平板后,从转化的细菌菌落中随机挑选若干,筛 选。
基因定点突变
基因定点突变step by step本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。
实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。
基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。
大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。
第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。
对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。
另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。
如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。
实在不行的话再来做定点突变。
对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。
基因定点突变技术.
4、大引物诱变法
首先用正向突变引物（M） 和反向引物（R1），扩增模板 DNA产生双链大引物（PCR1）， 与野生型DNA分子混合后退火并 使之复性，第二轮PCR中加入正 向引物（F2），与PCR1中产生 的一条互补链配对，扩增产生带 有突变的双链DNA。由于F2中的 退火温度显著高于第一轮PCR所 使用的引物M和R1，因此，可忽 略引物M和R1在本轮反应中所造 成的干扰。
1、寡核苷酸盒式诱变
（Cassette mutagenesis）
利用一段人工合成的具有突变 序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸 盒，取代野生型基因中的相应序列。
2、寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡 核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引 物便成为了新合成DNA子链的一个组 成部分，因此所产生出来的新链便具 有已发生突变的碱基序列
2寡核苷酸引物诱变使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物启动单链dna分子进行复制随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成dna子链的一个组成部分因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列?将待突变的目的基因插入将待突变的目的基因插入m13噬菌体载体上制备单链噬菌体载体上制备单链dna?将合成的寡核酸片段在与单链模板退火在dna聚合酶的作用下合成互补的双链聚合酶的作用下合成互补的双链dna?将双链dna转化大肠杆菌获得突变基因转化大肠杆菌获得突变基因?突变体的筛选
定点突变技术通过寡核苷酸盒式诱变、寡 核苷酸引物介导、重叠延伸介导和大引物诱变 法介导（PCR介导）等途径来实现。盒式突变 是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核 苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列，该 法虽简单易行，但成本较高。寡核苷酸引物介 导是利用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物， 在聚合酶的作用下启动对ＤＮＡ分子的复制， 该方法虽被广泛应用于基因调控、蛋白质功能 与结构之间的相互关系的研究中，但存在突变 效率低的问题；重叠延伸和大引物诱变法介导 的定点突变技术为基因修饰、改造也提供了另 一条方便的途径。但该方法后续工作比较复杂， 且易发生其他突变；
定点突变
周赞虎等人采用快速PCR定点突变方法成功地对 hCu,Zn-SOD进行了基因改良，即将hCu,Zn-SOD 基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码 子，以提高其稳定性。 朱大兴等人对该试剂盒试验规程进行了改良， 利用实验室的常规试剂进行定点突变，并指出PCR 突变反应产物能被琼脂糖电泳检测到是非常重要的， 因为这样有利于分析试验成败的原因。 周兴等人以定点突变方法对325RLDRD32基序 的带电荷氨基酸进行突变，并构建R325D、R328A、 R328D、R328Q和D329N五个突变体。
1988年，ein首次将其用于植物转基因研究，克服了当时农杆菌 介导的转基因方法的受体种类和基因型的限制，开创了植物转基 因方法的新领域。McCabeetal利用基因枪法转化大豆幼胚和成 熟胚的下胚轴获得了转基因再生植株。 1990年，From示etal利用基因枪法成功转化T玉米胚性愈伤组织 。同年Fine:andMcmullen(1990)用陆地棉柯字310的胚性悬浮系 进行的基因枪转化。获得了10个再生植株，较农杆菌介导的遗传 转化，所用的再生时间较短(5个月)。其后，MeCabeandM inell 报道T基因型独立的基因枪转化方法。 1994年，Hieital通过使用农杆菌侵染诱导剂乙酞丁香酮(AS)以及 构建巧rG和巧rB高效表达的超双元载体，高效成功地转化了水稻 。利用该转基因系统，Ishidaetal(1996)、Tingayetal(1997)和 Chengetal(1997)相继获得了玉米、大麦和小麦的转基因植株。
八、参考文献
1.定点突变技术的研究进展
2.植物基因定点突变与定点置换技术及其在植物遗传改良中的应用
3，基因定点突变技术简介
谢谢观赏
七、应用前景
定点突变技术——从单点突变到多点突变
定点突变技术——从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
基因定点突变的原理和应用
基因定点突变的原理和应用1. 引言基因定点突变是指基因组中特定位置上的突变事件，它在遗传学研究、分子生物学研究以及生物工程等领域中具有重要的应用。
本文将介绍基因定点突变的原理和应用，并探讨其在科学研究和生物技术领域的潜力。
2. 基因定点突变的原理基因组中的定点突变可以通过多种机制产生，包括点突变、缺失、插入和替换等。
下面将介绍几种常见的基因定点突变的原理。
2.1 点突变点突变是指基因组中发生的单个碱基的改变。
它可以包括碱基替换、碱基插入和碱基缺失等不同类型。
点突变的原因可以是DNA复制时的错误、环境暴露以及基因组重组等。
2.2 缺失和插入缺失和插入是指基因组中发生的多个碱基的改变。
缺失是指某个区域的碱基突然丧失，而插入则是指某个区域多出了一个或多个碱基。
缺失和插入的原因可以是DNA复制过程中的错误、环境暴露以及基因组重组等。
2.3 替换替换是指基因组中的某个碱基被另一个碱基替换的现象。
替换可以是同义替换，即被替换的碱基编码的氨基酸与替代后的碱基编码的氨基酸一致；也可以是非同义替换，即被替换的碱基编码的氨基酸与替代后的碱基编码的氨基酸不同。
替换的原因可以是DNA复制时的错误、环境暴露以及基因组重组等。
3. 基因定点突变的应用基因定点突变在科学研究和生物技术领域有着广泛的应用。
下面将介绍几个常见的应用领域。
3.1 基因功能研究基因定点突变可以用来研究基因的功能。
通过人为地引入特定的突变，可以观察到这些突变如何影响基因的表达或功能，从而揭示基因的作用机制。
这对于理解基因与疾病之间的关系以及探索基因功能具有重要意义。
3.2 遗传疾病研究基因定点突变对于遗传疾病的研究也具有重要意义。
通过研究疾病相关基因的突变情况，可以了解突变对基因功能的影响，进而揭示疾病的发生机制。
这对于预防和治疗遗传疾病具有重要的指导意义。
3.3 基因工程基因定点突变在基因工程中有着广泛的应用。
通过引入特定的突变，可以改变目标基因的功能或表达水平，从而实现对生物体的改造。
定点突变技术ppt课件
位点特异性突变的类型
• 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱
基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作 用下启动DNA分子进行复制。
• 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变
序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相 应序列。
• PCR介导的基因突变
Kunkel 法
原理
在E. coli中
dUTP
dUMP
优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高， 因此运用非常广泛
同时利用重叠延伸PCR机设可以对基因中 心区段进行取代、插入、缺失的突变
各种方法的比较
寡聚核苷酸介导的突变 盒式突变
PCR介导的突变
优 点
保真度高
缺 操作复杂 点 周期长
简单易行 突变效率高
合成多条引物成本 高 受到酶切位点的限 制
操作简单 突变成功率高
后续工作复杂 TapDNA聚合酶 保真性偏低
应用
• 一步反向PCR法 • Stratagen 公 司 的
Quickchange试剂盒
一种简便快速的定点突变的方法
• Stratagen 公 司 研 制 的 Quickchange 试 剂 盒,可以双链DNA质粒为模板,只需一对 引物，进行一次PCR,在1～2d内即可完 成点突变过程。
Oligo诱导突变的改进方法
• 武汉大学的叶林柏等人对Oligo诱导 突变方法进行了改进。2-3个核苷酸 替换的突变频率可达80%-85%，即使 是需要有道连续4个氨基酸缺失，突 变频率也高达40%－５０％。
原Kunkel 法
DNA聚合酶和T4 连接 酶同步加入 直ຫໍສະໝຸດ 用反应混合物转 染 转染效率：3个空斑
改进后的方法
分级退火，冰浴稳固异 源双链再加T4 连接酶 经酚-仿抽提后再进行 转染 转染效率：78个空斑
定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变技术
定点突破旳措施
• 寡核苷酸介导旳基因突变指用具有突变碱基旳寡聚核苷酸
片断作为引物，在聚合酶旳作用下开启DNA分子进行复 制。
• 盒式突变是利用一段人工合成旳含基因突变序列旳寡核
苷酸片段，取代野生型基因中旳相应序列。
• PCR介导旳基因突变
寡核苷酸介导旳定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 旳生物化学家 ( michael smith )发明 旳.
在分子生物学和基因工程中旳应用
探明未知序列旳构造和功能旳关系，如开启子诱变筛选，真 核旳TATA盒保守序列拟定。 载体构建：调控元件，强开启子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。
在蛋白质工程中旳应用
降低毒性，如TNF 变化亚型和种旳特异性，如IFN旳23位AAG（赖氨酸），AGG （精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝， 使IFN种属特异性明显变化，对人抗病毒活性不大于牛。 提升活性和稳定性，如IFN- βser17（cys变ser） 提升蛋白质作用旳专一性，如IFNβ旳9-56位被IFNa旳7-54位 取代后，活性提升40倍。
• 定点突变技术旳潜在应用领域很广，例如研究蛋白质相互 作用位点旳构造、改造酶旳不同活性或者动力学特征，改 造开启子或者DNA作用元件，引入新旳酶切位点，提升蛋白 旳抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白旳晶体构造，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变旳是基于PCR旳随机突变，经过变化PCR条件提 升PCR过程中旳随机犯错，这种措施合用于未知旳蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 但是这种措施因为没有目旳性，分析操作相当繁琐，而且不会出 现一种位点2个以上碱基突变，因而应用上有不足。定点突变合 用于蛋白构造已经有初步了解旳基因，比PCR随机突变更有目旳 性，也更为精确，简朴，同步改造基因愈加“随心所欲”。因为 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛旳应用前景，相信这 个技术在不远旳将来还会有更大旳改善和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
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定点突变技术——从单点突变到多点突变
体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E.coli
中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。
另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。
试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。
只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。
这个试剂盒适用于质粒大小不超过
8Kb的质粒。
后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质
粒的定点突变的，通过优化试剂特别是其感受态细胞（XL10-Gold），使得较大的质粒的定点突变也一样简单。
QuikChange由于操作简单快速，效率高（>80%）而受到普遍欢迎，光是今年的前9个月就有超过400篇发表的论文中用到这个产品。
定点突变的比较有特色的产品还有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根据准备突变的质粒自行设计两条引物（同一方向，对同一单链模版），一条包含计划定点突变的序列，另一条引物包含质粒上某一个单酶切位点，不过在单酶切位点中引入突变，这样两条引物除了所包含的突变位点，其他序列和质粒上对应位置的序列完全一致，退火后和质粒模版结合，通过T4 DNA聚合酶延伸，延伸反应持续直到碰到另一条引物停止，两段包含突变位点的延伸产物经T4连接成环，和模版链组成杂和环，带有两处错配。
单酶切反应产物，直接转化Ecoli BMH 71-18 mutS(错配修复缺陷株)。
原来的双链质粒模版被切开而不能转化，而杂和质粒由于一条链上单酶切位点引入突变而不被切开，保持环状质粒得以转化。
转化子的杂和双链在E.coli的复制过程中分开，再经过一轮提质粒、单酶切、转化，最后得到纯和的突变质粒。
这个试剂盒则是利用改造单酶切位点使得新合成的突变质粒不被切开从而除去原来的模版质粒。
虽然这个试剂盒比上一个麻烦，但实际上是引入了两个定点突变。
只不过一个用于酶切除掉模版的反应。
有的时候研究可能需要多个位点的定点突变，比如改造酶的活性或者动力学特性，研究蛋白之间的相互作用位点等，单点突变不能满足实验的需要，重复进行单点突变也非常浪费时间。
因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。
最多一次实验可以引入5个定点突变。
这个试剂盒的原理和Clontech的相似，就是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。
资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。
得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1—2个不同定点突变的质粒（因为存在1—2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。
这样，一次实验可以得到不同数目突变的质粒，对于研究蛋白质结构和功能的关系也是有用的。
不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。
不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。
定点突变适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。
由于定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人熟悉应用。