实验十PEG法诱导鸡血细胞融合

称取1.4g的CaCl2，融于30-50ml的重蒸水中。取 1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧 杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前 一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完 全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至 1000ml。
（6）Hanks液：Hanks原液100 ml，加重蒸水896 ml，
荧光标记的细胞融合
三．实验仪器、材料和试剂
仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心 机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微 镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、 酒精灯等。
材料：成年家鸡。
■ 试剂
（1）0.85%NaCl溶液:
（2）GKN液：8.0gNaCl，0.4g KCl,1.77 g Na2HPO4·2H2O， 0.69 g NaH2PO4·H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚红，溶于 1000ml重蒸水中。
实验 十 PEG法诱导鸡血细胞融合
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一、实验目的
了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合 的基本原理。
通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 初步掌握细胞融合的基本方法。
二、实验原理
• 影响原生质体融合的因素。 （1）首先是酶解条件： 渗透压稳定剂 Ca2+ 、Mg2+、蔗糖 可保持原生质体稳定利于再生；随着酶解时间的增加原生 质体的释放量增大；酶解浓度到达一定浓度后，原生质体 的再生率下降；再就是酶解温度。 （2）原生质体的脱壁是否完全会影响融合效果。有的原生质 体会很快再生细胞壁，因此在洗去酶液后，应立即进行融合 处理。 （3）原生质体的悬浮状况也会影响融合，如果两亲本原生质 体密度相差较大，就难以混和均匀，接触机会减少，这时应 用离心方法强迫它们密集
吸取悬液1mL放入离心管中，加入4mLHanks液混匀， 1000r/min离心5min，弃上清液，再加入适量GKN液，使 成10%的悬液。
4、PEG诱导细胞融合 吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴 加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在 37℃水浴中静置5---10min。
• 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细 胞
接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于 两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此 的表面张力作用，使细胞发生融合。
• 细胞融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、 作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
骨髓间质充质干细胞移植后的细胞融合
5、染色和镜检 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液 混匀，染色5min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细胞 融合情况。
观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五 个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿 孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞 连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或 多个核的圆形细胞。
细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指 用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核 体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩 溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含 有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免 疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的 助融剂的不同，细胞融合可分为：病毒诱导的细胞 融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二 醇（polyethyleneglycol ,PEG）;电场诱导的细胞 融合；激光诱导的细胞融合。
3、鸡血细胞悬液的制备 取细胞悬液1mL，加4mL0.85%NaCl溶液混匀，1200r/min离
心5min，弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条件 离心两次（5分钟，10分钟）。最后，弃去上清液，加入 10ml的GKN溶液，制成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞 悬液，加入4.5ml的GKN液进行稀释。
（3）50%（m/v）PEG溶液：取50gPEG(相对分子量=4000)放 入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG 冷却至50-60℃， 勿让其凝固。加入50ml预热至50℃的GKN 液，混匀，置 37℃备用。
（4） Hanks原液(10×)： NaCl 80.0g；Na2HPO4·12H2O1.2g； KCl 4.0g；KH2PO4 0.6g；MgSO4·7H2O 2.0g； 葡萄糖 10.0g；CaCl2 1.4g。
加0.5%酚红 4 ml。配好的Hanks液，分装包扎好 贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。
（7）詹纳斯绿染液。
四、方法与步骤
（一）鸡血细胞的体外融合
1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，
注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。
6．计算细胞融合率
细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合 的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已 融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示， 而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为 准确。
细胞融合过程在形态上的变化
五、实验结果
六、注意事项
1.高压灭菌过的PEG 冷却至50-60℃时就加入 预热至50℃的GKN 液，勿让其凝固。
2.严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞1 －2min。
3.终止PEG的作用时，缓慢加入5ml Hanks 液， 轻轻吹打，以免融合的细胞分离或破裂。
七、作业
1．绘出典型的细胞融合过程图。 2．计算细胞融合频率。 3．说明影响原生质体融合的因素。
• 本实验所用PEG融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融 合，因为植物细胞具有细胞壁，PEG无法介导其细胞融合； 但是，如果将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用PEG融合 方法进行融合实验。