17 生物化学实验--葡萄糖氧化酶法测定血糖含量

葡萄糖氧化酶法测定血糖含量

【目的】

1 ．掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验方法。

2 ．熟悉葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验原理。

【原理】

葡萄糖氧化酶（ GA ）对β-D- 葡萄糖的特异性的很强。溶液中的葡萄糖有α-D- 葡萄糖和β-D- 葡萄糖两型，二者处于动态平衡。当β-D- 葡萄糖不断受酶催化而减少时，α-D- 葡萄糖便依靠平衡移动，全部转变为β-D- 葡萄糖参与反应。

GA 催化β-D- 葡萄糖分子中的醛基氧化生成葡萄糖酸和 H 2 O 2 ，后者在过氧化物酶（ PA ）作用下放出氧，其可将色原性氧受体“4- 氨基安替吡啉偶联酚” 的酚氧化，并与 4- 氨基安替吡啉缩合生成红色化合物，其反应如下。于505nm 与同样处理的标准葡萄溶液比色，可测得葡萄糖含量。

【器材】

1 ．分光光度计

2 ．恒温水浴

3 ．微量加样器

4 ．刻度吸量管

5 ．中号试管

【试剂】

1 ． 0.01mol/L pH7.0 磷酸盐缓冲液

无水 Na 2 HPO 4 18.5g 和 KH 2 PO 4 5.3g 溶于 800ml 蒸馏水中，用少量 1mol/L 的 NaOH 或 HCl 调 pH 至 7.0 ，再加蒸馏水稀释至 1L 。

2 ．酶试剂

取 GA1200 单位、 PA1200 单位， 4- 氨基安替吡啉 10mg 、叠氮钠 100mg ，加上述磷酸盐缓冲液至 80ml 左右，调 pH 至 7.0 ，再加同上缓冲液至 100ml ，混匀。冰箱内保存可稳定 3 个月。

3 ．酚试剂

酚 100mg 溶于 100ml 蒸馏水中。因酚易在空气中氧化成红色，可先配制成 50g /dl ，贮棕色瓶中，用前稀释。

4 ．酶 - 酚混合试剂

将试剂 2 、 3 等量混合。冰箱内保存可稳定 1 个月。

5 ．葡萄糖标准贮存液（ 20mg/ml ）

无水 D- 葡萄糖于80 ℃ 烤箱内干燥恒重，冷却后，称取 2.0g 以 0.25% 苯甲酸溶解、稀释定容至 100ml 。

6 ．葡萄糖应用标准液（ 100mg/dl ）

取葡萄糖标准液 5ml ，加 0.25% 苯甲酸溶液稀释定容至 100ml 。

7 ．蛋白沉淀剂

溶解 Na 2 HPO 4 10g 、 Na 2 WO 4 10g 、 NaCl 19g 于 800ml 蒸馏水中，加入 1mol/LHCl 125ml ，加蒸馏水至 1 000ml 混匀。

【操作】

1 ．血浆直接测定

取试管 3 只，标明测定、标准、空白，分别加入血清 20μl ，磷酸盐缓冲液20μl ，然后各管均加酶 - 酚混合剂各 3ml ，混匀后将 3 管同时置37 ℃ 水浴保温 15 min ，到时取出冷却。用 505nm 波长，以空白管调整零，读取各管吸光度值。

2 ．全血去蛋白血滤液测定

取蛋白沉淀剂 1ml 加全血 50μl 混匀，放置 7 分钟后，离心取上清 0.5ml 于测定管内；取蛋白沉淀剂 1ml 加葡萄糖应用标准液 50μl ，混匀后从中取

0.5ml 于标准管内；另取蛋白沉淀剂 0.5ml 于空白管内。以上三管各加酶 - 酚混合试剂 3ml ，各管分别混匀同时放入37 ℃ 水恒温箱浴保温 15 min 后，取出如前比色测定。

【计算】

血糖浓度（ mg/dl ）＝

血糖浓度 ( mmol/L) ＝

【注意事项】

1 ．葡萄糖氧化酶法测糖，色原性氧受体种类较多，以往曾多用邻联茴香胺等，因其有轻微致癌作用，现已很少应用。本实验介绍的方法为卫生部临床检验中心所推荐，该法测糖显色灵敏且稳定。

2 ．无水葡萄糖结晶属于α-D 型，溶于水中，部分葡萄糖发生变旋光作用，形成β型， 2 小时后α与β比例达成平衡，α型占 36% ，β型占 64% 。因此葡萄糖标准液需在葡萄糖溶解 2 小时后才能应用。

3 ．该酶法测糖特异性高，且干扰测定结果的特质较少。当溶血标本 Hb 达到 1g /dl ，黄疸标本胆红素浓度达到 20mgr/dl 时，都不大影响测定结果。样品中加入抗凝剂或糖分解抑制剂如草酸钾浓度达到 20mg/dl 、脚素达 60mg/dl 、 NaF 达 200mg/dl 时，均不干扰测定结果。标本中尿素达 280mg/dl 、甘油三酯达500mg/dl 时对测定结果无影响。而维生素 C 及谷胱甘肽等还原性物质可引起结果的负误差。

4 ．本法测糖的线性范围宽，至少可达 20mmol/L （ 360mg/dl ）。

5 ．本法测定血糖正常值为 70 ～ 110 mg/dl 或 3.9 ～ 6.1mmol/L 。

【思考题】

1 ．酶试剂为什么要用磷酸盐缓冲液配制，而不用蒸馏水配制？

2 ．试分析影响本实验的因素有哪些，为什么？