贮存过程中大曲原核微生物多样性及土味素含量变化规律
基于高通量测序技术的中温大曲中微生物群落多样性解析
基于高通量测序技术的中温大曲中微生物群落多样性解析作者：胡晓龙王康丽牛广杰乔亚娟张玉何培新来源：《郑州轻工业学院学报(社会科学版)》2019年第04期关键词：白酒;中温大曲;微生物群落;高通量测序技术0引言曲作为一种糖化剂、发酵剂、产香剂和原料，在制酒、制醋、制酱油等传统酿造行业的应用已有几千年的历史.其中，大曲主要用于白酒固态发酵[1]，其品质的优劣在很大程度上决定了白酒的品质和风格.大曲主要是以大麦、小麦、豌豆等单一或多种谷物为原料，经破碎、加水混合再压成块状曲醅[2]，经自然或人工接种并在适宜的温度和湿度条件下进行固态发酵，经成型、控温、贮存等十几个环节而制成块曲或砖曲.制曲过程中，纯种或环境中的微生物在适宜的条件下经过长时间的富集和培养，可在曲醅表面和内部形成有益的酿酒微生物群系[3].大曲微生物菌群复杂，主要集中在酵母菌、霉菌和细菌三类菌中，三者在酿酒过程中的糖化、产香、产酒方面可以协同作用，但各自侧重不同[4]：酵母菌有酒化和酯化的作用;霉菌助产一些生物酶，如红曲霉和米根霉产酯化酶，黑曲霉助产淀粉酶、蛋白酶和糖化酶[5-6];细菌助产一些呈香物质，如吡嗪类化合物、愈创木酚、苯甲醛、乳酸、芳香族化合物等多种香气成分.此外，大曲中还有少量的放线菌，其功能虽然尚不明确，但其可以产生蛋白酶，使蛋白质分解成氨基酸，进而与淀粉分解生成的糖反应会产生醛、酮、吡嗪类化合物等香味物质.目前，关于大曲群落信息研究的报道很多[7-8]，其所采用的方法包括传统可培养方法[9]、传统分子生态学方法（16srDNA克隆文库法[10]、PCRDGGE[11]，扩增核糖体DNA限制性分析[12]和PLFA[13]等）和高通量测序技术[14].尤其是高通量测序技术的应用，使得大曲中痕量微生物和不可培养微生物得以被发现，极大地丰富了人们对大曲中微生物群落多样性的认识.目前对产自四川、贵州等地区的大曲微生物的研究较多，但对产自河南地区的大曲微生物群落的研究相对较少，且对产自河南地区的大曲曲皮和曲心微生物群落差异尚不明晰.基于此，本文拟采用高通量测序技术研究河南地区中温大曲曲皮和曲心两个部位的微生物群落多样性及其组成，以期拓展对河南地区中高温大曲中微生物种类的研究，在一定程度上丰富对我国不同地区中温大曲微生物多样性的认识.1材料与方法1.1材料和仪器1.1.1样品采集中温大曲样品，取自河南某知名酒厂，取曲块表面厚度约为1cm的大曲作为曲皮样品，粉碎后备用;在曲块中心，取长、宽、厚均为5cm的正方体作为曲心样品，粉碎后备用.1.1.2主要试剂 2×TaqPCRMasterMix，上海天根生物公司产;引物ITS1/ITS4和515F/806R，氯化钠、苯酚、氯仿，生工生物上海股份有限公司产;无水乙醇，上海联硕生物技术有限公司产;TritonX-100，上海碧云天生物技术有限公司产;SDS，美国Amresco公司产;Tris，北京索莱宝科技有限公司产;EDTA，上海国药集团化学试剂有限公司产;醋酸铵，天津市科密欧化学试剂有限公司产.以上试剂均为分析纯.1.1.3主要仪器 MP200A型精密电子天平，上海良丰仪器仪表有限公司产;TG16-WS型台式高速离心机，安徽中佳科学仪器有限公司产;DKY-Ⅱ型恒温调速回转式摇床，倍辉北京产品部产;ZDX-35B型灭菌锅，上海三申医疗器械厂产;SW-CJ-1F型超净工作台，苏州净化设备有限公司产;JY92-Ⅲ型PCR仪，宁波新芝生物科技股份有限公司产;DYY-8C型琼脂糖电泳仪，北京市六一仪器厂产.1.2实验方法1.2.1基因组提取1.2.1.1样品预处理分别称取7g大曲曲皮和曲心样品，用20mL灭菌后的0.1mol/LPBS缓冲液悬浮，加入3—5颗玻璃珠，漩涡振荡5min后在300r/min转速下离心5min，取上清液，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤3次，离心后合并上清液.将上清液于9000r/min转速下离心3min，弃去上清液，收集细胞沉淀.再用5mLPBS缓冲液重复洗涤3次，每次于9000r/min转速下离心3min，收集细胞沉淀.最后将细胞沉淀用1.5mLPBS缓冲液重新悬浮，该悬浮液用于基因组提取.1.2.1.2DNA的提取上述悬浮液中DNA的提取参照H.Y.Wang等[15]的方法.1.2.2PCR扩增与高通量测序采用原核微生物16SrRNA基因序列V4可变区设计的通用引物515F/806R[16]和真核生物通用引物ITS1/ITS4分别对上述基因组进行PCR扩增，两种引物的PCR扩增和高通量测序方法分别参照胡晓龙[17]和朱文优[18]的方法进行.1.2.3数据处理1.2.3.1序列质量控制采用Cutadapt（v1.9.1），Vsearch（1.9.6），Qiime（1.9.1）分析软件对所测原始序列进行质量控制：首先，将每对双向测序的序列进行比对，根据比对的末端重叠区进行拼接，拼接时保证至少有20bp的重叠区，去除拼接结果中含有N的序列;接著，去除引物和接头序列，去除两端质量值低于20bp的碱基，去除长度小于200bp的序列;最后，将上面拼接过滤后的序列与数据库进行比对，去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据.1.2.3.2操作分类单元（OTU）分析采用Qiime′suclust程序将相似度为97%的有效序列归为一个OTU，并确定每个OTU的代表序列[17].将获得的每个OTU 的代表序列与RibosomalDatabaseProject（RDP）在线数据库进行比对，选取置信度为80%的阈值对上述序列进行分类，进而确定每个OTU的分类水平，即门、纲、目、科、属、种水平.2结果与讨论2.1大曲样品中真菌群落多样性及其组成分析2.1.1大曲真菌群落多样性大曲真菌群落稀疏曲线如图1所示.由图1可知，当测序深度超过10000序列时，曲皮和曲心样品中真菌群落ObservedOTU数目基本不再增加，稀疏曲线趋于平缓.由于本实验所测序列深度远高于10000条，因此，本文所选取样品有效测序数量能够较全面地反映待测大曲样品的真菌群落多样性信息.大曲真菌群落多样性指数见表1.由表1可知，经过IlluminaMiseq高通量测序和序列质量控制，曲皮和曲心样品中真菌菌群中所得有效序列分别为66850条和70954条.曲皮样品中真菌群落的Shannon和Chao1指数均略高于曲心样品，表明曲皮样品中真菌群落多样性和丰度高于曲心样品.这可能是由于在制曲和存放过程中曲皮和空气或地面直接接触，氧气充足，而曲心温度高于曲皮且氧含量低于曲皮，进而导致曲皮真菌群落多样性和丰度高于曲心，这与李燕荣等[19]的研究结果一致.2.1.2大曲真菌群落组成大曲曲皮和曲心样品中真菌群落组成如图2所示.由图2可知，代表性OTU序列的物种注释结果表明，除“门”水平外，大曲曲皮和曲心样品在不同分类水平上存在一定的差异.在“门”水平（图2a）），子囊菌门（Ascomycota）是曲皮和曲心样品中的唯一优势（相对含量≥1%）菌门，相对含量均大于99%，同时也是四川和安徽等地区中温大曲中的优势真菌菌门[18，20].在“纲”水平（图2b）），酵母纲（Saccharomycetes）和散囊菌纲（Eurotiomycetes）为大曲样品中的优势真菌，且其中酵母纲的相对含量远高于散囊菌纲的相对含量;较之于曲心，曲皮样品中酵母纲相对含量较高，散囊菌纲相对含量较低.在“目”水平（图2c）），酵母菌目（Saccharomycetales）和散囊菌目（Eurotiales）為大曲样品中的优势微生物，同时也含有少量的毛霉目（Mucorales）.在“科”水平（图2d）），共检测到9个科，其中复膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）、发菌科（Trichocomaceae）、毕赤酵母科（Pichiaceae）和酵母科（Saccharomycetaceae）为大曲样品中的优势菌科，其在曲皮和曲心样品中的平均相对含量分别为65.3%，27.2%，3.5% 和2.2%.较之于曲心样品，曲皮中毕赤酵母科（6.3%）和酵母科（4.1%）的相对含量较高;复膜孢酵母科在曲皮（65.4%）和曲心（65.2%）中的相对含量差别不大;发菌科（23.3%）的相对含量较低.在“属”水平（图2e）），共检测到14个属，其中复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、散囊菌属（Eurotium）、毕赤酵母属（Pichia）和酵母属（Saccharomyces）为大曲样品中的4个优势菌属，其在曲皮和曲心样品中的平均相对含量分别为65.3%，26.3%，3.5%和2.2%.尽管复膜孢酵母属和毕赤酵母属是不同地域中温大曲样品共有的优势微生物，但不同地域中温大曲样品整体的优势微生物组成存在明显的差异，如安徽某酒厂中温大曲中有7种优势真菌，四川某酒厂中温大曲中则有10多种优势真菌[18，20]，这主要是由于地理环境、水源、气候、工艺等的不同所造成的微生物群落的区域差异.此外，复膜孢酵母属在曲皮样品（65.4%）中和曲心样品（65.2%）中的相对含量基本相同;而散囊菌属在曲皮样品（23.2%）中的相对含量低于曲心样品（29.3%）;毕赤酵母属和酵母属在曲皮样品（6.3%和4.1%）中的相对含量均远高于曲心样品（0.8%和0.3%）.在“种”水平（图2f）），共检测到15个种，其中扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsisfibuligera）、雪黄散囊菌（Eurotiumniveoglaucum）和毕赤酵母sp1（Pichiasp1）为曲皮和曲心样品中的优势真菌，其在曲皮和曲心样品中的平均相对含量分别为65.3%，26.1%和3.4%.在优势真菌组成上，曲皮和曲心样品中扣囊复膜孢酵母含量基本一致，分别为65.4% 和65.2%;雪黄散囊菌在曲皮样品（23.0%）中的含量低于曲心样品（29.2%）;毕赤酵母sp1在曲皮样品（6.1%）中含量远高于曲心样品（0.7%）.2.2大曲样品中细菌群落多样性及其组成分析2.2.1大曲细菌群落多样性经过IlluminMiseq高通量测序和序列质量控制，曲皮和曲心样品中细菌菌群中所得有效序列分别为42590条和50323条，其平均长度大小分别为459bp和462bp.通过图3所示大曲细菌群落稀疏曲线可以看出，测序深度大于10000条时，稀疏曲线趋于平缓，由于本实验所测序列深度远高于10000条，因此，本文所选取样品有效测序数量能够充分反映待测大曲样品的细菌群落多样性信息.由表1可知，曲心样品中细菌群落的Shannon指数高于曲皮样品，表明曲心样品中细菌群落多样性高于曲皮样品.但是，曲皮样品中细菌群落Chao1指数高于曲心样品，表明曲皮样品中细菌群落丰度略高于曲心样品，这一研究结果与李登勇等[21]发现的高温大曲细菌群落分布规律相近.2.2.2大曲细菌群落组成大曲曲皮和曲心样品中细菌群落组成如图4所示.由图4可知，曲皮和曲心部位细菌群落组成在门、纲、目、科属、种水平上均存在一定的差异.在“门”水平（图4a）），共检测到5个门.其中变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）为曲皮和曲心样品中的优势菌门，其在曲皮和曲心样品中的平均含量分别为79.6%和17.1%.较之于曲心样品，曲皮中的变形菌门相对含量较高，厚壁菌门相对含量较低，而酸杆菌门仅在曲皮样品中可以检测到.在“纲”水平（图4b）），共检测到10个纲，其中γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）和α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）为大曲样品中的优势菌纲.较之于曲心样品，曲皮中的γ-变形菌纲相对含量较高，而芽孢杆菌纲相对含量（9.9%）明显低于曲心（24.2%）.此外，Deltaproteobacteria，Holophagae，vadinHA17和鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）4种纲仅在曲皮样品中可以检测到.大曲真菌群落多样性指数见表1.由表1可知，经过IlluminaMiseq高通量测序和序列质量控制，曲皮和曲心样品中真菌菌群中所得有效序列分别为66850条和70954条.曲皮样品中真菌群落的Shannon和Chao1指数均略高于曲心样品，表明曲皮样品中真菌群落多样性和丰度高于曲心样品.这可能是由于在制曲和存放过程中曲皮和空气或地面直接接触，氧气充足，而曲心温度高于曲皮且氧含量低于曲皮，进而导致曲皮真菌群落多样性和丰度高于曲心，这与李燕荣等[19]的研究结果一致.2.1.2大曲真菌群落组成大曲曲皮和曲心样品中真菌群落组成如图2所示.由图2可知，代表性OTU序列的物种注释结果表明，除“门”水平外，大曲曲皮和曲心样品在不同分类水平上存在一定的差异.在“门”水平（图2a）），子囊菌门（Ascomycota）是曲皮和曲心样品中的唯一优势（相对含量≥1%）菌门，相对含量均大于99%，同時也是四川和安徽等地区中温大曲中的优势真菌菌门[18，20].在“纲”水平（图2b）），酵母纲（Saccharomycetes）和散囊菌纲（Eurotiomycetes）为大曲样品中的优势真菌，且其中酵母纲的相对含量远高于散囊菌纲的相对含量;较之于曲心，曲皮样品中酵母纲相对含量较高，散囊菌纲相对含量较低.在“目”水平（图2c）），酵母菌目（Saccharomycetales）和散囊菌目（Eurotiales）为大曲样品中的优势微生物，同时也含有少量的毛霉目（Mucorales）.在“科”水平（图2d）），共检测到9个科，其中复膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）、发菌科（Trichocomaceae）、毕赤酵母科（Pichiaceae）和酵母科（Saccharomycetaceae）为大曲样品中的优势菌科，其在曲皮和曲心样品中的平均相对含量分别为65.3%，27.2%，3.5% 和2.2%.较之于曲心样品，曲皮中毕赤酵母科（6.3%）和酵母科（4.1%）的相对含量较高;复膜孢酵母科在曲皮（65.4%）和曲心（65.2%）中的相对含量差别不大;发菌科（23.3%）的相对含量较低.在“属”水平（图2e）），共检测到14个属，其中复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、散囊菌属（Eurotium）、毕赤酵母属（Pichia）和酵母属（Saccharomyces）为大曲样品中的4个优势菌属，其在曲皮和曲心样品中的平均相对含量分别为65.3%，26.3%，3.5%和2.2%.尽管复膜孢酵母属和毕赤酵母属是不同地域中温大曲样品共有的优势微生物，但不同地域中温大曲样品整体的优势微生物组成存在明显的差异，如安徽某酒厂中温大曲中有7种优势真菌，四川某酒厂中温大曲中则有10多种优势真菌[18，20]，这主要是由于地理环境、水源、气候、工艺等的不同所造成的微生物群落的区域差异.此外，复膜孢酵母属在曲皮样品（65.4%）中和曲心样品（65.2%）中的相对含量基本相同;而散囊菌属在曲皮样品（23.2%）中的相对含量低于曲心样品（29.3%）;毕赤酵母属和酵母属在曲皮样品（6.3%和4.1%）中的相对含量均远高于曲心样品（0.8%和0.3%）.在“种”水平（图2f）），共检测到15个种，其中扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsisfibuligera）、雪黄散囊菌（Eurotiumniveoglaucum）和毕赤酵母sp1（Pichiasp1）为曲皮和曲心样品中的优势真菌，其在曲皮和曲心样品中的平均相对含量分别为65.3%，26.1%和3.4%.在优势真菌组成上，曲皮和曲心样品中扣囊复膜孢酵母含量基本一致，分别为65.4% 和65.2%;雪黄散囊菌在曲皮样品（23.0%）中的含量低于曲心样品（29.2%）;毕赤酵母sp1在曲皮样品（6.1%）中含量远高于曲心样品（0.7%）.2.2大曲样品中细菌群落多样性及其组成分析2.2.1大曲细菌群落多样性经过IlluminMiseq高通量测序和序列质量控制，曲皮和曲心样品中细菌菌群中所得有效序列分别为42590条和50323条，其平均长度大小分别为459bp和462bp.通过图3所示大曲细菌群落稀疏曲线可以看出，测序深度大于10000条时，稀疏曲线趋于平缓，由于本实验所测序列深度远高于10000条，因此，本文所选取样品有效测序数量能够充分反映待测大曲样品的细菌群落多样性信息.由表1可知，曲心样品中细菌群落的Shannon指数高于曲皮样品，表明曲心样品中细菌群落多样性高于曲皮样品.但是，曲皮样品中细菌群落Chao1指数高于曲心样品，表明曲皮样品中细菌群落丰度略高于曲心样品，这一研究结果与李登勇等[21]发现的高温大曲细菌群落分布规律相近.2.2.2大曲细菌群落组成大曲曲皮和曲心样品中细菌群落组成如图4所示.由图4可知，曲皮和曲心部位细菌群落组成在门、纲、目、科属、种水平上均存在一定的差异.在“门”水平（图4a）），共检测到5个门.其中变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）为曲皮和曲心样品中的优势菌门，其在曲皮和曲心样品中的平均含量分别为79.6%和17.1%.较之于曲心样品，曲皮中的变形菌门相对含量较高，厚壁菌门相对含量较低，而酸杆菌门仅在曲皮样品中可以检测到.在“纲”水平（图4b）），共检测到10个纲，其中γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）和α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）为大曲样品中的优势菌纲.较之于曲心样品，曲皮中的γ-变形菌纲相对含量较高，而芽孢杆菌纲相对含量（9.9%）明显低于曲心（24.2%）.此外，Deltaproteobacteria，Holophagae，vadinHA17和鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）4种纲仅在曲皮样品中可以检测到.。
高温大曲发酵过程中微生物多样性研究
“曲是酒之骨”，酒曲的好坏直接影响着酒的产 量和质量。不同类型大曲内微生物和酶类的组成 与其具体的制曲生产工艺和地理环境息息相关。 从宏观上看，不同香型大曲之间的差异主要是受环 境条件（温度、湿度等环境因素）和制曲工艺措施的 影响；从微观角度看，其本质是受各大曲中微生物 种群组成和丰度，以及由此产生的符合酶系组分配 比差异的影响。因此，从微生物学角度比较不同香 型间的相互作用规律，具有较为重要的意义。
付绍鸿，赵荣寿，杨 柳，周 蔺·高温大曲发酵过程中720 thermal cycler PCR 仪 ，Applied Biosysterms；DYCP-31 DNA 电泳槽，北京六一仪器 厂；DYY-5 稳压电泳仪，北京六一仪器厂；FR980 凝 胶成像仪，上海复日科技仪器有限公司。 1.2 试验方法 1.2.1 大曲总 DNA 提取
基金项目：四川大学-泸州市人民政府战略合作资金专项项目（2015CDLZ-S09）。 收稿日期：2018-11-02 作者简介：付绍鸿（1968-），男，工程师，研究方向：白酒酿造技术。 通讯作者：杨柳（1985-），男，工程师，本科，研究方向：白酒酿造技术。 优先数字出版时间：2018-12-04；地址：/kcms/detail/52.1051.TS.20181204.1434.001.html。
1 材料与方法
1.1 材料及仪器 高温大曲样品：取自四川省古蔺郎酒厂有限公
司，分别为入仓、翻曲、储存 1 个月、储存 2 个月 4 个 时间段的同一批样品。块状曲药取样方法采用分 层法，粉碎后曲药取样采用四分法。
仪器设备：2P-200 型恒温振荡器，江苏太仓市 实验设备厂；YM-1000CT 恒温超声仪，上海豫明仪 器有限公司；TGL20M-Ⅱ冷冻离心机，湖南凯达科 学仪器有限公司；5810R 台式冷冻离心机，德国 Ep-
浓香型大曲贮藏过程中糖化力发酵力变化及真菌多样性分析
浓香型大曲贮藏过程中糖化力发酵力变化及真菌多样性分析施思;彭智辅;乔宗伟;刘多涛;罗青春;涂福明【摘要】为了探究大曲贮藏过程中微生物群落结构变化,采用高通量测序技术分析了真菌18S rDNA V4区,聚类分析共产生3 747个OTU分类.结果表明,在贮藏过程中大曲真菌群落结构不断调整,毕赤酵母属、根霉菌属及横梗霉属成为最终的优势菌群.随着时间的推移,大曲发酵力逐渐升高,而糖化力则经历了由高变低再升高的过程.数据结果与大曲质量要求相符,能为后续酿造提供足够动力.%To explore the change of microorganisms communities of Daqu in the storage process,the V4 regions of fungal 18S rDNA were analyzed by high-throughput sequencing,3747 OTUs were obtained in clustering analysis.The results showed that fungal community structure was constantly adjusted,Pichia,Rhizopus,Lichtheinia became the dominant genera at the end of storage.The fermenting power of Daqu gradually increased as time going on,while saccharifying power gradually decreased and then increased again.The data meet the requirements for quality of Daqu,which can provide enough power for the subsequent brewing.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)005【总页数】4页(P76-79)【关键词】大曲;储藏;真菌多样性;理化指标【作者】施思;彭智辅;乔宗伟;刘多涛;罗青春;涂福明【作者单位】五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;固态发酵资源利用四川省重点实验室,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007【正文语种】中文在我国传统酿酒行业一直流传着“曲乃酒之骨”的说法，曲药既是酿酒的糖化发酵剂，又是酿酒的重要原料，同时为酿酒提供部分风味物质或风味前体物质，对白酒的香型风格有着举足轻重的作用。
浓酱兼香型白酒不同储存期的高温大曲微生物群落结构与发酵特征分析
细菌 ＤＮＡ采 取试 剂 盒抽 提后 ，ＰＣＲ扩 增 １６Ｓ ｒＤＮＡ，
丁孟 加 拉 红 平 板 置 于 生化 培 养 箱 中 以 ３０℃培 养 ２ ｄ，观 细 菌 的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 引 物 为 ２７Ｆ和 １４９２Ｒ。 反 应 体 系 采
察 ，计 数 。牛 肉膏蛋 白胨 平板 置 于生 化培 养箱 中 以 ３７℃ 用 ５０ Ｌ的 反 应 体 系 。 ＰＣＲ循 环 程 序 为 ：９４℃ 预 变
ｆｅｒｍ ｅｎｔｉｎｇ ｐｏｗｅｒ ｏｆ Ｄａｑｕ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｌｏｗｌｙ，ａｎ ｄ ｔｈｅ ｓａｃｃｈａｒｉｆｙｉｎｇ ｐｏｗｅｒ ｏｆ Ｄａｑｕ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｔ ｔ ｈｅ ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ ａｎｄ ｔ ｈｅｎ ｄｒｏｐｐｅｄ．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙ－ ｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ｈａｄ ｔｈｅ ｗｉｄｅｓｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｄａｑｕ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆｍｉｃｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｄａｑｕ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆｅｔｈａ ｎ ｏｌ，ｎｏｒ－ ｍ ａｌ ｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｉｎ ｆｅｒｍ ｅｎｔｅｄ ｇｒａｉｎｓ．
大曲培养过程中微生态变化规律的研究
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章肇敏， 吴生文， 林 培 · 大曲培养过程中微生态变化规律的研究
31
2.3
霉菌数量消长规律
大曲培养过程中霉菌的数量变化规律见表 3， 其消
长规律见图 3。
图 3 大曲培养过程中霉菌数量变化规律
1.2.3
培养方法
细菌计数为培养温度 37 ℃ ， 培养 24～48 h 后计数 ； 霉菌和酵母计数采用 25 ～28 ℃ 培养 48 ～96 h 后 计 数 。 细菌 、 酵母菌 、 霉菌总数测定 ， 活菌计数法 [2]。
2 2.1
结果与分析 [3]
1 1.1
材料与方法 实验材料
大曲 ， 四特酒有限责任公司制 。 培养基 ， 自制 。
温度升高使得霉菌大量消亡 ， 约 10 d 达到最小值 。 随着
量又逐渐增加 。 以均值计 ， 霉菌总数为 1.56×106 个 /g 曲 坯。
3
结论
大曲培养过程中微生物数量呈现动态变化 ， 从数量
上看为细菌 ＞ 酵母 ＞ 霉菌 ， 以均值计 ， 各类群数量 （ 个 /g
曲坯 ） 分别为 ： 细菌 1.75×7， 酵母菌 2.28×106， 霉菌 到最大值 ； 酵母数量在培养过程中逐渐降低 ， 后期略有增 大 ； 霉菌数量在培养过程中先略微增加后逐渐降低 。
参考文献：
[1] [2] [3]
周德庆 . 微生物学教程 [M]. 北京 ： 高等教育出版社 ,2002. 李顺鹏 . 微生物学实验指导 [M]. 北京 ： 中国农业出版社 ,2003. 章肇敏 , 吴生文 , 等 . 特香型大曲制曲工艺分析 [J]. 酿酒科技 ,
特香型大曲存储过程中霉菌、酵母菌、细菌数量变化规律的研究
２ ０ １ ４ 年 １ 月
酿
酒
Ｖｏ １ ． ４ １ ． Ｎ ｏ ． １
Ｉ ＮＧ Ｌ Ｉ Ｑ Ｕ Ｏ Ｒ ＭＡＫ
Ｊ ａ ｎ ． ， ２ ０１ ４
文章编号： １ ０ ０ ２ — ８ １ １ ０ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １ — ０ ０ ２ ７ — ０ ２
香型大曲在储存 ２ ￣ ３个月左右时最适合 白酒生产。 同时， 初步建立 了特香型大曲霉菌、 酵母 、 细菌数量的质量标
准。
关键词 ： 特 香型大曲 ； 霉 菌； 酵母 茵； Ｔ Ｓ ２ ６ １ ． １ 文献标识码 ： Ｂ
Ａｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｑｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｍｙ ｃ ｅ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ Ｙｅ ａ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ Ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｓ ｔ ｏ ｒ ａ ｇ ｅ
ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ． ｈｅ Ｔ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗ ｔ ｈ ａ ｔ ， Ｓ ｉ ｔ ｅ — ｌ ｆ ａ ｖ ｏ ｕ ｒ Ｄａ ｑ ｕ ｉ ｎ ｓ ｔ ｏ ｒ ｇｅ ａ ｏ ｆ ２￣ ３ ｍｏ ｎ ｔ ｈ ｓ ｉ ｓ ｂ ｅ ｓ ｔ ｆ ｏ ｒ ｌ ｉ ｑ ｕ ｏ ｒ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ． Ｔ ｏ ｐ ｒ ｅ ｌ ｉ ｍｉ ｎ ａ ｒ ｙ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｈｅ ｔ ｑ ｕ Ｍｉ ｔ ｙ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ｒｄ ａ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｑ ｕ ａ ｎ ｉ ｔ ｔ ｙ ｏ ｆ ｍｙ ｃ ｅ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ ｙ ｅ ｓｔ ａ ａ ｎ ｄ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｓ ａ ｍｅ ｔ ｉ ｍｅ ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ： Ｓ ｉ ｔ ｅ － ｆ ｌ ａ ｖ ｏ ｕ ｒ Ｄａ ｑ ｕ ；ｍｙ ｃ ｅ ｔ ｅ； ｙ ｅ ａ ｓ ｔ； ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ
中温大曲在发酵和贮存过程中微生物群落结构分析
中温大曲在发酵和贮存过程中微生物群落结构分析唐贤华;田伟;张崇军;周文;舒学香【摘要】通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术解析中温大曲在不同发酵期和贮存期的微生物群落结构,获得表征中温大曲细菌和真菌群落结构的DGGE指纹图谱.结果表明,中温大曲细菌有19种,其中芽孢杆菌属(Bacillus)和乳酸菌属(Lactobacillus)均属于优势菌群;真菌共13种,其中根霉属(Rhizopus)和酵母属(Saccharomyces)均属于优势菌.大曲微生物总体的变化趋势是发酵开始时微生物数量较少,发酵中期(4～8 d)微生物数量达到顶峰,大量细菌和真菌旺盛繁殖,发酵后期(12 d)微生物群落逐渐减少并趋于稳定;贮存期内,微生物的种类的趋于平稳,数量变化较大.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2019(038)006【总页数】6页(P113-118)【关键词】中温大曲;细菌;真菌;聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳【作者】唐贤华;田伟;张崇军;周文;舒学香【作者单位】四川工商职业技术学院,四川都江堰 611830;中国测试技术研究院,四川成都 610021;四川工商职业技术学院,四川都江堰 611830;四川工商职业技术学院,四川都江堰 611830;四川工商职业技术学院,四川都江堰 611830【正文语种】中文【中图分类】TS261.1我国传统白酒的酿造是依靠大曲中菌系的繁殖代谢而进行的[1]。
参与酿酒发酵的微生物种类很多，包括细菌、霉菌、酵母菌等。
追踪其来源，主要是大曲发酵过程中网罗自然界的微生物，因而通过研究大曲中的微生物，了解大曲中微生物数量、种类和分布规律，从而明白白酒的发酵原理是很有必要的[2-5]。
中温大曲是清香型大曲酒的糖化发酵剂，由于其发酵最高品温一般在50℃以下，故称中温大曲。
大曲的质量与培养、贮存过程有着密切的关系，主要体现在微生物的差异上，不同时期曲坯的微生物结构和数量有显著区别，影响着糖化酶、液化酶和蛋白酶等多种酶类以及有机酸等代谢产物的生成[6]。
青稞酒大曲微生物的分离鉴定及可培养微生物变化规律分析
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酿酒科技 2021 年第 6 期（总第 324 期）·LIQUOR-MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2021 No.6(Tol.324)
CAATAAGCGGAGGAAAAG） NL4 （GGTCCGT-
GTTTCAAGACGG）；PCR 采用 50 µL 体系，扩增反
应条件如表 1，反应完成后，取 3 µL PCR 产物进行
(Huzhu Highland Barley Liquor Co. Ltd., Huzhu, Qinghai 810500, China)
Abstract: Using traditional microbial separation technology combined with PCR sequencing, we analyzed the quantitative relationship and diversity composition of microbes in Daqu of highland barley liquor. 37 strains of yeasts, 22 strains of bacteria, and 13 strains of mould were isolated from the Daqu samples, which were further identified as Saccharomycopsis fibuligera, Wickerhamomyces anomalus, Bacillus subtilis, Staphylococcus vitulinus, Rhizomucor pusillus, Pantoea, etc. The cultivable test results showed that the number of bacteria in the Daqu samples was the largest, which stabilized after reaching the peak in about 3 to 4 days, and decreased slightly in the later stage. The number of yeasts reached the peak in 5 days, and stabilized in the later stage. The number of mould was the smallest, which increased slowly. Key words: highland barley liquor; Daqu; cultivable microorganism; change rules
不同储存时间下大曲的变化
不同储存时间下大曲的变化关宝义;陈煜【期刊名称】《食品与营养科学》【年(卷),期】2024(13)2【摘要】以软质小麦为原料,探究不同存储时间对曲药质量的影响。
以新制曲药(储存时间一周)、老曲药(储存一个月的曲药)和生产曲药(储存时间六个月)为研究对象,探究三个储存时间下曲药糖化力、液化力、酸度、水分、淀粉、发酵力的变化,从而确定不同储存时间对曲药理化指标的影响。
结果表明,新制曲药糖化力为850.0~970.0 mg/g·h、液化力0.44~0.59 g/g·h、酸度0.73~0.77、水分12.25%~14.51%、淀粉59.0%~59.74%、发酵力300.0~396.0 ml/g·72h。
老曲药糖化力为750.0~950.0 mg/g·h、液化力0.43~0.59 g/g·h、酸度0.72~0.78、水分11.25%~14.27%、淀粉59.10%~59.60%、发酵力286.0~361.0 ml/g·72h。
生产曲药糖化力为280.0~380.0 mg/g·h、液化力0.25~0.31 g/g·h、酸度0.7~0.75、水分10.08%~12.05%、淀粉59.26%~59.51%、发酵力118.0~186.0 ml/g·72h。
【总页数】7页(P250-256)【作者】关宝义;陈煜【作者单位】四川省宜宾市长兴酒业集团有限公司宜宾;四川轻化工大学宜宾校区生物工程学院宜宾【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.不同储存时间酸水解玉米蛋白粉中挥发性物质的变化分析2.普洱茶不同储存时间的生化成分变化和抗氧化活性研究3.大曲高温放线菌CICC10681在不同温度下的脂肪酸代谢变化4.不同生产方法PVC溶胶流变性能随储存时间的变化5.食用油在不同储存时间下酸败程度变化的研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高温大曲贮存过程中部分理化指标与微生物群落演替变化规律研究
高温大曲贮存过程中部分理化指标与微生物群落演替变化规律
研究
汪彩莉;程险峰;李晓环;张虎
【期刊名称】《酿酒科技》
【年(卷),期】2023()2
【摘要】在传统白酒生产上非常强调使用陈曲,但在大曲贮存过程中会受到曲虫危害,曲库成本会随着贮存时间的延长而增加。
本实验以成品曲库中贮存的白云边高温大曲为研究对象,对部分理化指标及微生物生长情况进行统计分析,初步揭示了高温大曲在贮存过程中理化指标变化规律与微生物生长情况的关系。
通过研究发现,随着贮存时间的延长,大曲水分变化不大,维持在11%左右;糖化力和酶活先增加后降低,糖化力和酶活与大曲中霉菌含量呈正相关性;在大曲中难以检测到酵母菌;细菌数量减少。
【总页数】5页(P19-22)
【作者】汪彩莉;程险峰;李晓环;张虎
【作者单位】湖北白云边酒业股份有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS262.3;TS261.1
【相关文献】
1.浓香型大曲贮存过程中部分理化指标及微生物变化
2.大曲贮存过程中理化指标及微生物变化研究
3.黄山头包包曲发酵过程中部分理化指标与微生物群落演\r替规
律的研究4.凤型大曲培曲阶段不同部位理化指标动态变化及微生物群落演替规律分析5.凤型大曲储藏期不同部位理化指标及微生物群落演替规律分析
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大曲贮存过程中理化指标及微生物变化研究
ｐ Ｈ ４ ． ６乙酸 一醋酸钠缓冲液 ： 量取 １ １ ． ８ ｍ Ｌ冰乙
作者简介 ： 孟姣姣 （ １ ９ ９ １ － ） ， 女， 大学 ， 食品科 学与工程 专业 ， 从事 白酒、 大曲生产过程 中的微 生物研 究， 发表论文 多篇。 ★ 通讯作者 ： 崔海灏 （ １ ９ ７ ４ － ） ， 高级工程师， 河北三井酒业股份有 限公 司。
第 ４ ２卷 第 ５期
２ ０ １ ５ 年 ９ 月
酿
酒
Ｖ０ １ ． ４２ ． № ． ５
Hale Waihona Puke ＮＧ Ｌ Ｉ Ｑ Ｕ Ｏ Ｒ ＭＡＫＩ
Ｓ ｅ ｐ ． ，２ ０１ ５
文章编号： １ ０ ０ ２ — ８ １ １ ０ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ５ — ０ ４ ３ — ０ ３
短， 生香 酵 母 在 堆 积过 程 中还没 有 代 谢 产 生 足 够量 的其 它香 味 成分 。
３ 结 果
刺鼻 ， 酸度比芝麻香型丢糟高 的缘故。
白 曲麸 曲 在 芝 麻 香 型 白酒 的过 程 中主 要 提 供 了糖 化 酶 和 酸性 蛋 白酶 ， 其 主要 功 能 分 别 是糖 化淀
Ｔｌ ｌ ｅ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ａｂ ｏ ｕ ｔ ｔ ｈ ｅ Ｃｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄ Ｃｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ Ｉ ｎ ｄ ｅ ｘ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ
Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ａ ｌ Ｄｕ ｒ ｉ ｎｇ Ｓ ｔ ｏ ｒ ａ ｇ ｅ Ｐｅ ｒ ｉ ｏ ｄ Ｄａ ｑ ｕ
大曲是大 曲酒生产 的糖化剂 、 发酵剂 ， 内含大 于使大 曲的生产 、 贮存 、 使用 向科学化、 系统化 、 可控 曲酒生产 、 发酵必须的各 种酶和微生物 ， 对大 曲酒 化 发展 ［ ２ １ 。
清香大曲贮存期的变化和大曲糖化酶功能菌及快速检测的相关研究
清香大曲贮存期的变化和大曲糖化酶功能菌及快速检测的相关研究中国白酒最主要的工艺特点是制曲酿酒。
大曲是酿酒的糖化发酵剂,是中国白酒酿造不可或缺的原料,也是保持中国白酒独具特色的关键核心。
大曲制作已有上千年的历史,经验非常丰富。
事实上,大曲的发酵生产、贮存及评价仍是以感官经验为主,缺乏必要的科学依据,使白酒研究酿造机理进展缓慢,给白酒的稳定生产和进一步提质改善带来巨大的困难。
大曲生产以生料制曲,自然接种,网罗了原料、自然环境和工具上的大量微生物,由于涉及微生物众多,真正起糖化作用的菌株并不明确;白酒生产周期很长,不仅要制曲时间长达28~40天左右,酿酒过程从清香白酒两楂56天到酱香的一年一个周期,出房曲即发酵结束的大曲还需经过3~6个月贮存后方可使用,贮存期长短的科学依据以及贮存期的变化也不清楚;大曲是酿酒的主要原料,好曲酿好酒,但长期以来,大曲质量评价主要以感官评价为主,近年来行业逐渐加入一些生化指标,如糖化力、酒化力等,但由于大曲属固态发酵,同一批大曲块乃至每一块大曲的不同部位都存在差异,导致酒曲检测样品量较大。
本项目针对白酒生产中遇到的酒曲相关的实际问题做了相关研究,结果如下:1.为理解大曲贮存过程中的变化,最终确定大曲合理的贮存期,本项目以某清香型白酒生产用的低温出房曲为材料,粉碎混匀,在不同贮存时期取样分析其主要指标,结果表明:大曲在贮存过程中,水分含量、酸度基本保持不变;pH值在贮存3个月后略有增加,经分析主要产酸菌并不没有减少,可能是酸与醇合成主体香气成分乙酸乙酯,在实验中检测到乙酸乙酯随大曲贮存时期的延长而增加;样品HX(红心曲)和HH(后火曲)的糖化力在贮存期变化不大,样品QC(清茬曲)在贮存期前3个月处于波动状态,之后就开始下降;液化力在贮存过程略有波动但不明显;α-多样性分析显示微生物在贮存期前3个月波动比较大,Simpson和Shannon指数趋势非常相似,细菌HH 曲在3个月最低,真菌三种曲都在3个月最低,之后多样性增加,从微生物β-多样性来看,同一贮存期样品有明显的相似性,表明贮存期对不同样品微生物的影响较为类似。
浓香大曲在培养及贮存过程中主要功能菌的变化规律探索与研究
浓香大曲在培养及贮存过程中主要功能菌的变化规律探索与研
究
李学思;刘新田;李绍亮;侯小歌;闫培勋;宋瑞
【期刊名称】《酿酒》
【年(卷),期】2017(44)5
【摘要】通过分析浓香型大曲在培养及贮存过程中微生物的变化得出:大曲中的微生物随着培养时间的延长而变化;通过分析宋河大曲曲皮与曲心的微生物变化得出:大曲中曲皮和曲心微生物的总体变化趋势基本一致,但由于曲皮和曲心处的环境不同,二者之间微生物的变化规律有细微差别.
【总页数】4页(P25-28)
【作者】李学思;刘新田;李绍亮;侯小歌;闫培勋;宋瑞
【作者单位】河南省宋河酒业股份有限公司,河南鹿邑477265;河南省宋河酒业股份有限公司,河南鹿邑477265;河南省宋河酒业股份有限公司,河南鹿邑477265;周口师范学院,河南周口 466001;河南省宋河酒业股份有限公司,河南鹿邑477265;河南省宋河酒业股份有限公司,河南鹿邑477265
【正文语种】中文
【中图分类】TS262.31;TS261.1;TS201.2
【相关文献】
1.浓香型白酒贮存过程中主要酸、酯变化规律的研究 [J], 李家民
2.酒曲在培养及贮存过程中主要理化指标变化规律的探索和研究 [J], 李学思;杨明
先;李亚凤
3.基于Biolog ECO技术对贮存过程中大曲微生物多样性变化规律的研究 [J], 汤有宏;李红歌;李晓欢
4.陶融型大曲培养贮存过程生化指标变化规律及相关性研究 [J], 陈蒙恩;韩素娜;侯建光;李建民;陈伟平;李华;邓杰;胡晓龙
5.浓香型白酒在发酵和贮存过程中微量成分的变化规律研究 [J], 唐贤华;王思思;隋明;黄睿
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浓香型大曲贮存过程中部分理化指标及微生物变化
浓香型大曲贮存过程中部分理化指标及微生物变化宋瑞滨;邵泽良;宋军【摘要】In this study, Nongxiang Daqu was used as the research object. Trace analysis of the change in physiochemical indexes and microbial quantity of Nongxiang Daqu during 2-year storage was performed. Then Daqu with its storage period of 6 months, 12 months, 18 months, and 24 months were used respectively in the production. The change rules of Nongxiang Daqu in different storage period, and the experience of us-ing Daqu of different storage period for liquor production were revealed, which laid a solid foundation for improving Daqu quality and guiding liquor production.%以浓香型大曲为研究对象,通过跟踪大曲贮存两年内的部分理化指标和微生物数量变化情况,使用大曲贮存期分别为6个月、12个月、18个月、24个月应用生产,初步弄清了不同贮存期浓香型大曲变化规律,以及不同贮存期大曲应用于生产所产酒质的变化规律,为进一步提高制曲质量、指导生产打好坚实基础.【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2017(000)001【总页数】3页(P59-61)【关键词】浓香型大曲;贮存期;理化指标【作者】宋瑞滨;邵泽良;宋军【作者单位】湖北黄山头酒业有限公司,湖北公安434300;湖北黄山头酒业有限公司,湖北公安434300;湖北黄山头酒业有限公司,湖北公安434300【正文语种】中文【中图分类】TS262.3;TS261.1;Q925.7大曲是酿制大曲酒的糖化剂、发酵剂、生香剂，多种微生物菌体和微生物酶形成复杂的“多酶多菌共酵体系”，对曲酒的产量和质量起着决定性作用，素有“曲是酒之骨”“好酒必有好曲”的说法。
牛栏山大曲可培养微生物多样性分析
牛栏山大曲可培养微生物多样性分析朱婷婷【摘要】采用传统微生物分离结合PCR测序,从酵母菌、丝状真菌、芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌5个方面入手,系统分析了牛栏山大曲微生物数量关系及多样性组成.研究结果表明,牛栏山大曲中主要微生物为扣囊覆膜酵母,可占大曲微生物的59 %,乳酸菌、芽孢杆菌和丝状真菌共占大曲微生物的41 %,其余酵母和放线菌虽然能够分离到,但数量较少.在微生物多样性组成方面,从牛栏山大曲中共分离到27种微生物,结合不同种微生物数量关系,确定了大曲中的主要微生物种类.%Traditional microbe separation method coupled with PCR sequencing were adopted to analyze the quantity of microbes in Niulanshan Daqu and their diversity.The results suggested that,the dominant microbe in Niulanshan Daqu was Saccharomycopsis fib-uligera,accounting for 59 %;the quantity of Lactobacillus,Bacillus,and filamentous fungi accounted for 41 % of the total microbes;a few other bacteria and actinomycetes were separated but their quantity was few.There were 27 kinds of microbes separated from Ni-unanshan Daqu and the main microbial species were identified.【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2018(000)005【总页数】5页(P75-79)【关键词】微生物分离;扣囊覆膜酵母;乳酸菌【作者】朱婷婷【作者单位】北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂,北京101301【正文语种】中文【中图分类】TS262.3;TS261.1;Q93-3;TS261.7中国白酒作为世界六大蒸馏酒之一，具有悠久的历史和深厚的酒文化内涵[1]，其酿造过程以大曲为糖化发酵剂，经糖化、发酵、蒸馏和贮存等步骤制得。
不同贮存期高温大曲中乳酸菌的多样性及其耐受性分析
不同贮存期高温大曲中乳酸菌的多样性及其耐受性分析吴正坤;缪礼鸿;张明春;周凤鸣【摘要】该研究对不同贮存期高温大曲中乳酸菌的数量、群落结构与多样性的变化规律进行分析.结果表明,高温大曲贮存过程中,乳酸菌的数量由完成制曲时(0 d)的1.7× 104 CFU/g增长至30d时的1.4×105 CFU/g,最终贮存至120d时乳酸菌数量达到最大值(7.6×l05 CFU/g)a通过高通量测序,从大曲中共鉴定出5个属,分别为乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium),其中格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)在各贮存期30d、60 d和120 d大曲乳酸菌中占比最多,分别为66.31％、47.75％和47.18％.通过富集培养和平板分离,从高温大曲中共分离、鉴定出18株乳酸菌,对其中6株乳酸的生长曲线、耐温性、耐酸性和耐乙醇能力进行了测定,其中菌株pH4-3能耐受47℃高温,菌株JD-1能耐受酒精度8％vol,并且二者均耐酸(pH 3.5).【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)006【总页数】7页(P61-67)【关键词】高温大曲;贮存期;乳酸菌;高通量测序;分离鉴定;耐受性【作者】吴正坤;缪礼鸿;张明春;周凤鸣【作者单位】武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉430023;湖北白云边酒业股份有限公司,湖北松滋434200;武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉430023【正文语种】中文【中图分类】Q93-331;TS261.1高温大曲是酱香型白酒和浓酱兼香型白酒生产上大量使用的一种由自然接种、高温发酵而制成的菌酶合一发酵剂[1]。
中高温大曲曲块部位间生化指标的差异及变化规律
中高温大曲曲块部位间生化指标的差异及变化规律杨勇; 李燕荣; 姜雷; 贾亚伟; 王启彪【期刊名称】《《食品与发酵工业》》【年(卷),期】2019(045)019【总页数】6页(P73-78)【关键词】中高温大曲; 部位; 生化指标; 差异; 变化规律【作者】杨勇; 李燕荣; 姜雷; 贾亚伟; 王启彪【作者单位】江苏洋河酒厂股份有限公司江苏宿迁 223800【正文语种】中文“曲是酒之骨”，大曲在浓香型白酒生产中起着至关重要的作用[1]。
大曲作为一种富含多酶多菌的微生态制品，具有糖化、发酵、生香等功能，是传统固态发酵蒸馏大曲酒的重要物质保障[2]，其品质好坏直接决定了酒的风格及档次。
作为块状曲，不同曲块部位因通气性、水分、温度等微环境的差异而呈现不同的质量[3]。
本文选取中高温大曲为研究对象，将块状曲细分为曲皮、曲心及火圈，研究曲块部位间生化性能的差异，结合在培菌发酵过程中变化规律和相关性的研究，进一步剖析大曲的生化功能，为制曲工艺的调整、优化甚至现代化提供参考依据。
1 材料和方法1.1 材料与主要试剂大曲样品：中高温大曲，选择7月上旬入房发酵的四房曲进行跟踪研究。
HCl，NaOH，H2SO4，可溶性淀粉，CuSO4，酒石酸钾钠，亚铁氰化钾，醋酸，醋酸钠，三氯乙酸，乳酸钠，Na2CO3，酪素，乙醇，己酸，正庚烷等均为分析纯。
1.2 仪器与设备分析天平、生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、控温水浴锅、干燥箱、分光光度计等。
1.3 试验方法1.3.1 取样1.3.1.1 成品曲曲块部位间取样将成品大曲拆分为曲皮、火圈与曲心，分3批次，每批次取3房，每房10块曲粉碎混匀作为1个样本，每个部位9个样本，取平均值。
1.3.1.2 大曲发酵过程取样对发酵期全流程进行跟踪并取样。
取样时间分别为主发酵期(1、2、3 d)、潮火期(4、5、6、7 d)、大火期(8、9、10、11、13、15 d)、后火期(17、19 d)、养曲期(22、25、29、32、36 d)。
景芝浓香大曲随储存期延长的变化规律
景芝浓香大曲随储存期延长的变化规律刘雪;曹建全;李霞;杨爱华;张学梅【摘要】The change rules of physiochemical indexes and microbial species and quantity of middle-high-temperature Nongxiang Daqu during the extended storage period were explored.The effects of physiochemical indexes and microbial quantity on the quality of Daqu were elaborated,which provided theoretical evidence for judging the best storage time of Daqu.%研究了浓香型中高温大曲的理化指标和微生物种类及数量随储存期延长的变化规律,阐述了大曲理化指标与微生物数量对大曲质量的影响,为大曲的最适储存时间提供了判断的理论依据.【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2018(000)003【总页数】7页(P65-71)【关键词】大曲;储存期;理化指标;微生物【作者】刘雪;曹建全;李霞;杨爱华;张学梅【作者单位】山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119;山东省酿造食品生物发酵技术重点实验室,山东景芝262119;山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119;山东省酿造食品生物发酵技术重点实验室,山东景芝262119;山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119;山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119;山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119【正文语种】中文【中图分类】TS262.3;TQ925.7;TS261.1大曲是我国古老的曲种，根据大曲在发酵中的作用也可将其称为糖化发酵剂[1]，它巧妙地将野生菌进行人工自然培养，选育有益菌种，积蓄酶及发酵前体物质，并为发酵提供营养物质。
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贮存过程中大曲原核微生物多样性及土味素含量变化规律杜海;杜小威;赵景龙;张鑫;徐岩【摘要】通过对不同贮存时期大曲的微生物群落结构的分析,进一步阐述了大曲的贮存过程的必要性.采用MiSeq高通量测序方法,鉴定出原核微生物119个属.其3种大曲相对丰度靠前的优势菌属主要为乳酸菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、链霉菌属、短杆菌属等.随着贮存时间的推移,3种大曲的物种多样性都处于上升趋势.在各个阶段高温曲的物种丰度和多样性都高于清茬曲和红心曲,说明高温曲的制曲工艺使得微生物生长更活跃.分析3种大曲中链霉菌与土味素的含量变化趋势,在贮存3个月时,两者的含量相对较低.因此,从异味控制的角度来看,大曲贮存3个月左右的时间更利于白酒风味的形成.%The necessity of storage of Daqu was clarified by analyzing microbial community structure of Daqu during different storage periods.119 genera of prokaryotic microbe were identified using the method of MiSeq highthroughputsequencing.Dominant microbes which have a relatively higher abundance in three kinds of Daqu mainly wereLactobacillus,Bacillus,Leuconostoc,Weissella,Streptomyces,Brevibacterium etc.Species diversity of three kinds of Daqu presented a rising tendency as time goes on.Species diversity and abundance of Gaowen Daqu were higher than those of Qingcha Qu and Hongxin Qu.It indicated that the craft process of Gaowen Daqu was more suitable for the growth of microbes.Both the content of geosmin and abundance of Streptomyces in the three kinds of Daqu were found obviously lower in the third month ofstorage compared with the initial stage.Therefore,Daqu storing over three month was conductive to the control of off-odor.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)004【总页数】6页(P1-6)【关键词】大曲贮存;MiSeq测序;微生物群落;链霉菌【作者】杜海;杜小威;赵景龙;张鑫;徐岩【作者单位】江南大学,酿酒科学与酶技术中心,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心,山西汾阳,032205;山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心,山西汾阳,032205;山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心,山西汾阳,032205;江南大学,酿酒科学与酶技术中心,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文中国白酒历史久远，是以粮谷为主要原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒。
大曲在白酒酿造过程中有着举足轻重的地位，其中栖息着丰富的微生物种属(比如细菌、酵母及霉菌等)[1]，其作为白酒酿造过程中微生物及生物酶的有效载体，在白酒酿造中起着糖化、发酵、生香的作用，因此，大曲质量的好坏会直接影响到白酒的产量以及质量。
大曲是以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过粉碎，加水混捏，压成曲醅，形似砖块，大小不等，让自然界各种微生物富集生长而制成[2]。
清茬、红心、高温这3种大曲在培养的过程中存在差异，具体来说是3种曲在培养温度上各有不同[3]。
因而其生化性能与微生物的数量也有较大的差异性，而这些差异与工艺是相一致的。
据目前的研究，在贮存3个月后，清茬曲的糖化力、液化力和蛋白酶均高于另两种大曲。
而红心曲中的细菌含量最高，清茬和高温曲中总的酵母和霉菌的含量比较高[4]。
3种大曲若单独发酵，出酒率是高温曲最高，清茬曲次之，红心曲最低。
而将3种大曲按照一定比例混合(3∶3∶4)，则出酒率会得到提高。
3种大曲混合可以取长补短，菌种较多后，各种营养的成分才能尽可能地被各种微生物利用，进而代谢出各种产物，提高出酒率的同时也能提高其质量和风味[5]。
同时，大曲白酒中除香气成分以外，还存在着许多像糠嗅味、涩苦酸等常见的不愉快气味[6]。
其中，糠嗅味则在清香型白酒中表现更为突出。
研究表明，产生这一异味的源头为大曲中链霉菌代谢的土味素[7]。
研究制曲过程分析土味素产生菌变化规律以及其他微生物之间的相互作用，对于白酒风味提升以及品质稳定性的提高有重要意义。
根据文献记载，PCR-DGGE技术在21世纪初开始运用到大曲微生物的研究中，使人们更近一步地认识大曲中的微生物的分布[8]。
CHEN等人采用PCR-DGGE技术，共检测到了11株细菌、9株杆菌和7株真菌，其中优势菌群有枯草杆菌和米曲霉[9]。
利用PCR-DGGE技术来研究大曲中的微生物，能够提供微生物群落中比较详细的种类信息并且可以同时去分析多个样品，但弊端是实验操作很繁琐，对微生物多样性的认识比较有限[10-11]。
近几年，因为高通量测序技术的发展，在微生态学研究中开始大规模地使用二代测序技术。
ZHANG等人利用二代测序的技术，分析了清香型白酒3种大曲的微生物结构，为生产时大曲的添加比例提供了可靠依据[12]。
但新曲中微生物种类丰富且生物量较高，导致投入生产的酒醅发酵前升温迅速，总酸度高。
因此，出房大曲必须贮存于通风干燥的曲库。
在此过程中，随着贮存时间的推移，3种大曲中所含微生物的结构也在不断发生变化。
目前关于这些微生物结构的动态变化报道还相对比较少。
本研究以汾酒酿造用大曲为研究对象，通过提取大曲微生物总DNA、PCR扩增等预处理，以MiSeq高通量测序剖析大曲贮存过程中微生物群落结构变化；对微生物群落组成进行比较研究，以此分析各功能菌的变化趋势，从而进一步解析清香型大曲功能微生物，探究大曲最合适的贮存时间。
1.1 大曲样品实验大曲样品取自某清香型白酒厂所产清茬曲、红心曲和高温曲，3种大曲均按照出房、贮存1个月、3个月和5个月一共4个时间点分别采集。
为了保证取样的科学性以及均一性，出房时在5处取样，贮存1个月、3个月和5个月则随机选取3块大曲做平行样并放置在-20 ℃进行保藏。
1.2 样品前处理取7 g大曲样品，加入20 mL无菌的0.1 mol/L PBS缓冲液(0.057 7 mol/LNa2HPO4，0.042 3 mol/L NaH2PO4)将样品悬浮，再加入玻璃珠平放漩涡振荡3 min使其充分混合。
将混合样300×g转速下离心5 min，取上清液，沉淀用上述PBS缓冲液重复洗涤3次，再次离心后收集全部的上清液。
上清液于10000×g离心15 min，收集细胞沉淀。
用5 mL PBS缓冲液将上述沉淀重复洗涤3次，直到洗液干净呈无色状态，再10 000×g离心10 min重新收集细胞沉淀。
1.3 大曲宏基因组提取采用玻璃珠细胞破碎仪破碎细胞，苯酚氯仿抽提方法提取窖泥细菌基因组，具体方法参照文献[14]。
1.4 IlluminaMiseq测序及序列分析利用引物对338F (5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GTGGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)，对上述大曲基因组进行PCR扩增，该对引物针对细菌16S rRNA基因序列中的V3-V4可变区进行扩增。
将合并的PCR产物按照说明书TruSeq® DNA Sample Preparation Guide中的Low Sample (LS)Protocol进行文库制备，然后在Illumina平台上进行双端测序(2×250 bp)。
然后将所得原始序列按照Ren等人的方法进行序列质量控制处理最终得到有效序列。
本实验用QIIME′s uclust程序将相似度为97%有效序列归为一个OTU并确定每个OTU的代表序列。
利用QIIME软件计算酒醅微生物群落的α-多样性信息，包括Shannon及Chao1指数。
基于Weighted UniFrac距离对不同酒醅样品中微生物群落进行主坐标轴分析(PCoA)。
将每个OTU的代表序列与Ribosomal Database Project (RDP)在线数据库进行比对，选取置信度为80%的阈值对上述序列进行分类，进而得到每个OTU的分类水平，即门、纲、目、科及属水平。
采用MiSeq测序技术结合PCR技术对3种大曲样品进行定性定量分析，将测序结果所得到的原始的序列按照REN[15]等人的方法进行一个初步的处理，来控制质量，进而得到有效的序列。
然后将每个OUT所代表的序列在NCBI的在线数据库里进行比对，选择匹配度最高的比对结果，进而进行分类，得到门、纲、目、科、属5个水平。
基于以上处理结果，探究其在不同贮存时期微生物群落的变化，以此来区分3种大曲，以及每种大曲在不同时期的特点。
2.1 三种大曲贮存过程中微生物群落结构差异为了更加全面地揭示3种大曲在贮存过程中微生物群落的组成以及多样性信息，本研究采用IlluminaMiSeq技术，对清茬、红心和高温曲不同贮存时间下微生物群落结构进行了分析。
图1为3种大曲在不同贮存时间下针对原核微生物测序结果的稀释曲线。
该曲线相对来说趋于平缓，说明本研究测序结果可以比较全面的覆盖应有的物种。
表1中分析了3种大曲细菌的Chao1和Shannon指数。
表中显示，随着贮存时间的推移，原核微生物多样性总体呈现先上升后下降的趋势。
清茬曲和红心曲在贮存3个月的时候物种丰度和多样性达最高值，高温曲则在贮存5个月的时候达到最高。
说明大曲贮存过程中微生物的群落多样性及结构在不断地进行调整变化。
生物多样性与后期发酵风味的产生密切相关，各菌种相互平衡、协同作用，更利于发酵的进行。